western bloting 步骤

Western blotting 步骤

一、全细胞裂解液的提取

(该步骤在冰上操作，所以要提前准备冰)

1.用PBS洗两遍细胞，然后尽量把PBS吸干净

2. 配细胞裂解液混合液：

细胞裂解液（RIPA）：蛋白酶抑制剂（cocktail）=50：1 或细胞裂解液（RIPA）：PMSF=100：1

3.按每1×10^6细胞加100到250ul的细胞裂解液混合液，例如：每个10cm的中皿加500ul RIPA再加50ul cocktail

4.冰上裂解30min中间震荡几下使其充分裂解(或放在4℃冰箱里，摇床上摇30min，速度20-30)，之后拿刷子把黏在板子上的细胞刷到下面的液体中，将液体吸到EP管中。

5.超声波破碎仪（此步骤可省略）

6.离心12000g 4℃离心10min，离心结束后轻轻吸出上清至新的EP管。

离心时打开金属浴，提前做好准备，调节温度到95℃

7.测蛋白质浓度(BCA法)

①准备一个96孔板，每个孔里加25ul的蛋白质样品，注意加样时间隔一定的距离。

②配测浓度用的BCA液按A:B=50:1的比例配置，每个孔加200ul的BCA混合液。然后放入37℃的水平摇床上摇晃30分钟，速度60rpm左右。

③将96孔板放入测浓度的设备中，打开电脑中的gen5软件，按“reading”开始测浓度。

假设所得的结果是X，则Y=921.62X-151.65，蛋白浓度=（Y/1000×4/5）ug/ul 上样量=样本量/蛋白浓度

8.按吸出的蛋白样本：5×loading buffer =4：1的比例加入loading buffer，在小离心机上甩一下，使挂壁的液滴掉下来。

9.95℃煮蛋白10分钟，使蛋白成线性；然后再放冰上5分钟忽冷忽热使蛋白成球，并与loading紧密结合

10.如果紧接着做Western blotting，则可直接用。如果要以后备用，把蛋白样本放在-20或-80的冰箱里。

二、电泳及免疫印迹

1.配胶

①将玻璃板洗净，用干净纱布擦干。夹好后首先试漏，要求5分钟左右无漏水，用滤纸吸干玻璃板缝隙间的水分备用。

③配好后立刻加入到两块玻璃板的夹缝中，迅速用异丙醇封胶。等30分钟左右，待下层胶凝固后倒掉异丙醇。

④开始配上层胶。上层胶配的还差一步时，用滤纸吸干异丙醇，然后配完上层

胶，紧接着加入到两块玻璃板中间，注意不要有气泡，然后插入梳子，等待30分钟左右。

2电泳

配电泳液：（1×的电泳液25mmol/L Tris, 250mol/L甘氨酸，0.1% SDS）

每1L的1×电泳液需要Tris 3.02g，Gly 19.8g，SDS 1.0g

在电泳槽内加入电泳液，使液面超过电泳槽上的标记线。拔出梳子，将marker和要测的蛋白依次加入梳齿孔道。盖上槽盖，启动电源，将电压调成80V，带蛋白跑至分离胶时，调整电压至120V，直至蛋白跑至凝胶底部。

3.转膜

配转膜液：（1×的转移液25mmol/L Tris, 0.182mol/L甘氨酸，20%甲醇）每1L的1×转膜液需要Tris 3.03g，Gly 14.41g，甲醇200ml

纪老师的转膜液配方（1×的转移液48mmol/L Tris, 39mmol/L甘氨酸，20%甲醇）每1L的1×转膜液需要Tris 5.82g，Gly 3.08g，甲醇200ml

将凝胶从玻璃板中取出，切去上层胶及不必要的部分，将其置于浸过电转液的海绵和滤纸上，上面用甲醛激活过的PVDF膜覆盖，夹层中不能有气泡。加入转膜液至液面与电泳槽上的标记线平齐。调节电流300mA，冰浴下恒流转膜，根据目的蛋白的

配封闭液：即5%脱脂奶粉。50mlPBST/TBST＋2.5g脱脂奶粉

转膜结束后，将带有蛋白分子的PVDF膜取出，注意要在正面的右上角切一个缺口，以区别正反面。根据分子量切膜，切膜时将PVDF膜放入透明一次性手套中。然后将切好的PVDF膜取出，背对背放入封闭液中，至于摇床慢摇一小时。

5．敷一抗。

将PVDF膜取出，放在缓冲液（TBST或PBS）洗去牛奶，再将膜取出放入配好的相应抗体中，4℃缓慢摇床过夜。

配制10×的TBS 1L：NaCL 80.06g, KCl 2.0g, Tris 30g,用的时候在稀释成1×的原液，然后每1L 稀释后的1×的TBS加Tween1ml，调PH至7.5

一抗溶液：按抗体说明书建议的浓度稀释于5%的脱脂奶粉中

6. 洗膜

取出PVDF膜，用TBST或PBST漂洗膜后再放于摇床上快速摇动浸洗三次，每次5-10分钟

7. 敷二抗

根据一抗来源选择相应的二抗，按说明书稀释相应比例后放于摇床上缓慢摇晃一小时

8. 洗膜

取出PVDF膜，用TBST或PBST漂洗膜后再放于摇床上快速摇动浸洗三次，每次5-10分钟

9.曝光（辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法）

手曝

至暗室，将A、B发光液按1：1的比例混合，将膜正面向上贴于片盒中，在膜表面充分滴加ECL混合液，之后迅速盖上胶片，关闭片盒。数分钟后，取出胶片立刻放于显影液中1-2分钟，清水漂洗后再放在定影液中，之后清水冲净凉干。

机曝

将A、B发光液按1：1的比例混合，将膜浸泡于ECL中数秒，之后反向贴于曝光机表面，合上机器开始曝光。

10.标片，读片

问题：

1.为什么测蛋白浓度时不用测280和260的分光光度之比？不用担心核酸杂质吗？

2. 5.超声波破碎仪和调TBST的PH值我之前没有操作过，不知道具体怎么做。

3.转移液的配方好像有很多种，我用的配方和纪老师的就不一样，到底该选择哪个配

方？