16SrDNA的提取&鉴定

用16S rDNA 方法鉴定细菌种属

一、实验目的

1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；

2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、实验原理

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16S rDNA 序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA 。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

利用16S rDNA 鉴定细菌的技术路线：

PCR 的基本原理：必须已知部分序列设计出引物，10-30bp 。

细菌培养液 基因组DNA DNA 提取 PCR 扩增 16S rDNA 片段

片段回收 连接克隆载体 阳性克隆鉴定 测 序 序列比对

以此类推，呈几何级增长。一般进行25-35个扩增循环

DNA可扩增106~109倍。

三、实验步骤

（一）细菌基因组DNA提取

技术路线：

具体步骤：

1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。（前期由老师完成）

2. 取2 mL培养液到2 mL Eppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

3. 再往同一离心管中2 mL培养液到2 mL Eppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

4. 加入200 μL 缓冲液GA，充分悬浮、混匀，将菌体彻底悬浮。

5. 再加入20 μL Protein K，混匀，55℃温育10分钟。（55℃为酶最适温度）

6. 加入220 μL缓冲液GB，混匀后，55℃温育10分钟。（实为50-60℃之间）

7. 加入220 μL 无水乙醇（降低体系粘稠度），充分混匀。将上清（挑去其中絮状杂质，少部分，会产生气泡，除不去））小心转入UNIQ-10柱（羟基纤维素膜，特异吸附核酸，因为吸附有限，所以损失核酸）中。13000 rpm（离心机最高设定实为10000rpm）离心5分钟，倒弃收集管内的液体。

6. 加入500 μL GD Solution，10000 rpm离心1分钟。

8. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。（离心机最小设定实为1min，仪表盘上显示时间的梯形最小面积为1min，所以没法在到梯形面积中间时按暂停）

9. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。

10. 加入50 μL预热（60℃）的洗脱缓冲液（TE，含RNase），加到柱子中间的膜上。

60℃放置5分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。

11. 电泳。取5 μL提取DNA溶液+2μL Loading Buffer（不用吸放混匀，以免机械损伤DNA）进行电泳检测质量。（吖啶橙做染色液，橙红色）

（二）PCR扩增

1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。

16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

2. PCR扩增体系：

在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：

16S (F) 1μL (10μM)

16S (R) 1μL (10μM)

2×PCR Mix 25 μL（含10×PCR Buffer，dNTP，Taq酶）

ddH2O22 μL（最先加）

反应体系50 μL，简单离心混匀。

3. PCR反应

将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：

94℃ 3 min

94℃30 sec

50℃（实为52℃）45 sec 35 cycles

72℃100 sec（因为Taq酶1Kb/min,时间为经验所得）

72℃7 min（充分延伸）

4. PCR产物的电泳检测

拿出Eppendorf管，取出全部溶液点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶大孔中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果（下午1:50）。

（三）扩增片段的回收

根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。

1）称量一2 mL.的Eppendorf 管质量，记录0.99g 。

2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL 的Eppendorf 管内，称量1,06g 。计算凝胶质量0.07g 。

3）每100 mg 凝胶加入300 μL Buffer DE-A （促融），混匀。70℃温育至凝胶融化。

4）加入0.5倍体积的Buffer DE-B （帮助连接），混匀。全部转入UNIQ-10柱，10000 rpm 离心1分钟，倒去收集管（与之前的试剂盒中的收集管规格不同）内的液体。

5）加入500 μL Buffer W1（Wash Solution ），10000 rpm 离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6）加入500 μL Buffer W2（去盐液，70%乙醇），10000 rpm 离心0.5分钟。（离心机最小设定实为1min ）

7）再10000 rpm 离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml 的离心管。

8）加入30 μL 预热的洗脱缓冲液（Eluent ），60℃放置3分钟。12000 rpm 离心2分钟，流下的液体即

为回收的DNA 片段。

（四）DNA 片段测序

将回收的片段（足量）送至生物公司测序，测序引物为16S PCR 引物。（Sanger 双脱氧法，一边PCR ，一边测序）

四、实验结果及分析

1．细菌基因组提取DNA 电泳结果：

第十一泳道为我组结果，条带清晰，说明提取的DNA 含量较高。

正极 负极 点样孔

（小孔，4ul ）

DNA

28sRNA

18sRNA

5.8sRNA