胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心
细胞工程实验实验报告
胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。
关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养
胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。
1.材料和方法
1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。
1.2方法：
1.2.1愈伤组织的诱导培养
（1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8
（2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤）
（3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次；
（4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块；
（5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶
（6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况
1.2.2继代培养
从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（3~4周后在相同培养基上继代培养1次）1.2.3愈伤组织再分化的诱导
（1）培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L
（2）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3
个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。适当条件下培养1-3周。 2.结果
2.1愈伤组织的诱导培养结果如下图，
通过观察，看出M1和M2均被污染长出菌，M3水清化，M4和M5褐化，均没有成功诱导愈伤组织形成，比较于小组其他同学的培养情况统计于下表：
Table 2小组诱导愈伤组织形成情况
统计后得到小组全部都是没有成功诱导愈伤组织形成，实验失败，诱导率为0。 2.2继代培养结果
因诱导愈伤组织培养失败，所以向老师取来的成功的愈伤组织继代培养，结果如下图
由图片看出来初次继代培养结果良好，愈伤组织继续分化，二次继代培养结果在形态上已经变大且在组织外层透亮说明生长良好； 2.3愈伤组织再分化的诱导
再分化的结果待观察 3.讨论
3.1对于小组内诱导愈伤组织形成的培养结果全部失败，进行详细的分析，分为以下几点 3.1.1大部分被微生物感染，培养基内长出大面积菌落，仔细观察有生出霉菌占大部分，有白色霉菌的孢子丝，还有淡黄色霉菌，还有粘稠的细菌菌落，分析原因有以下几点
（1）首先材料来源带来的污染，材料来源不是无菌植株培养出来的，而是一般市售的胡萝卜，所带有的微生物大部分可能在消毒过程已杀死，但是在外表皮有细缝沾有的微生物未被清除，在切材料时被外层微生物污染，还有因在多次清洗消毒过程会造成材料损伤，给内部材料造成影响；
（2）培养瓶封口塑料盖用久了容易老化，密封性差造成的污染，但我们后面发现更大可能是盖子没有旋紧，因为盖子是塑料的盖上以后很容易盖歪了然后旋不动，就以为是盖紧了其实是没有旋紧，让培养过程中空气进入造成大面积污染；
（3）学生操作过程不注意细节部分，比如操作者的双手要完全伸入超净工作台，操作物品尽可能挨近工作台吹风口，在取各种无菌的器材要用灭菌镊子拿取，打开瓶口要盖子倒放在工作台酒精灯附件，而不是正扣下去，这一点也是造成污染主要原因，因盖子正扣会使盖子内部沾到工作台的微生物；
（4）操作因不熟练所以操作步骤繁琐，耗时过长，使材料或者培养基长时间暴露，因为操作环境不是完全的无菌，所以操作熟练动作快缩短时间可以减少污染； 3.1.2有水清化的现象，是不生长,不死亡,也无愈伤形成
3.1.3有褐化的现象，是不生长,组织块颜色发黑，边缘发白，大部分是已死亡；
3.2对于继代培养没有被污染，能够正常分化，在取已经形成好的愈伤组织时来源是无菌材料做的愈伤组织，所以没有形成二次污染，在材料方面没有带来污染，且操作上也没有带来污染；
4.小结
4.1实验最初是利用不同培养基中加入不同比例的激素研究不同比例激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，但由于愈伤组织诱导分化结果失败，因造成污染或是材料不分化最后结果是诱
导率为0，无法得出结论哪种激素能够促进胡萝卜愈伤组织诱导，理论上[2]
，在添加2，4-D 1．0 mg ／LJ,KT 0．5 mg ／L 的MS
培养基上愈伤组织的诱导效果最好，并且愈伤组织能在相同的培
养基上快速大量地增殖，其增殖速率为原体积的3～4倍／周。
4.2一一般认为，诱导外植体脱分化和器官的建成关键在于生长素和分裂素的配比。生长素在诱导外植体脱分化产生愈伤组织中起决定性作用，而分裂素只是增加了愈伤组织的发生数量，其浓度过高反而产生负面作用，低浓度生长素2，4一D有利于胡萝卜愈伤组织的诱导，2，4一D与一定浓度的细胞分裂素KT(0．5 mg／I )配合使用则有利于愈伤组织的快速增殖；
参考文献：
[1]尹文兵[1],李丽娟[1],黄勤妮[1],李艳红[1],.胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究[J].山西师
范大学学报：自然科学版,2004,18(2)
[2]汪洪[1,2],夏鸿亮[2],李校垄[2],杨树林[1],.胡萝卜愈伤组织诱导培养的研究[J].北方艺,2012,(6)
胡萝卜组织培养系统实验
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066 学号：20131070156座号：A2 开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 ( 云南大学生命科学学院,昆明650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表 明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型 愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培 养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高 峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh root s really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1 材料和方法 1. 1材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量 I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一 边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。 5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。 6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。 7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。121℃高压灭菌20min。
胡萝卜素愈伤组织培养开题报告
胡萝卜素愈伤组织培养开题报告 1011421130 徐亮 1、本论文课题国内外概况和文献综述： 应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型、外植体、培养基、激素等因素。 胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。 对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高 [1-3] 。 同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根 [1,3,4] 。此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏 根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果 [5] 。 在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为MS 培养基对体细胞胚的发生更为有利。但也有认为B5基础培养基略优于MS 基础培养基 [1] 。 不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。已有的研究结果表明，在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。2,4-D 的浓度从0.1～10.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从0.2～4.5mg/L 不等，BA 的浓度从0.5～1.0mg/L 不等，KT 的浓度从0.2～2.0mg/L 不等 [2,3,6] 。此外还 有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势[7] 。
胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导及继代增值培养实验报告.
综合性实验报告 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导 及继代增殖培养 一、实验原理及目的 （一）实验目的 1、通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制于保存培养基母液的基本技能。 2、通过MS固体培养基的配制，掌握培养基的制备基本技能。 3、学会和掌握诱导愈伤组织的基本技术。 4、初步掌握组织培养的无菌操作技术。 5、初步掌握外植体的消毒技术。 6、掌握组培室常用的化学试剂。 7、学会和掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。 （二）实验原理 1、配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。 2、在自然情况下，根主要为植物吸收和固定的重要器官，同时，有些植物的
根亦具有繁殖的功能。植物根生长快、代谢能力强、变异小，使得其在研究根的营养吸收、生长和代谢的变化规律、器官分化、形态建成规律等方面具有重大的理论与实践意义。 依据细胞全能性原理，即指任何具有完整细胞核的细胞（动物、植物等），都拥有形成一个完整个体所必需的全部遗传信息（DNA）。就胡萝卜根来说，其肉质根细胞同样具有形成完整再生植株的能力。这种由单个根衍生而来并经继代培养而保存的，在遗传上具有一致的根的培养物，称为离体根无性系。利用这些离体根的无性系可以进行器官再生体系、苗木无性系快速繁殖和其他方面的实验研究。 3、愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木与接穗沟通。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁细胞组织而形成愈伤组织。 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2,4-D，IAA和
胡萝卜愈伤组织培养
验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月 小组合作： 是○√ 否○ 一、实验预习 1、实验目的： 1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。 1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 2、实验准备： 2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器： 电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。 药品： NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。 2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器： 冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。 药品和试剂： MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH 2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器： 100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。
胡萝卜愈伤组织诱导实验报告
南昌大学实验报告胡萝卜愈伤组织诱导 姓名： 学院： 专业： 班级： 学号：
胡萝卜愈伤组织诱导 实验一母液的配制与保存 一、实验目的 1.学习母夜的配制方法和母液的保存方式。 2.熟悉掌握制备母液的操作。 二、实验原理 培养基中提供植物生长所需的营养成分，才能满足植物正常的生长发育的需求。主要包括水分、有机物质、盐类，而配制母液时将其分为大量、微量、钙盐、镁盐、铁盐、有机和肌醇分别配制。配臵培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配臵，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液臵于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配臵即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1．试剂 NH4NO3,KNO3,KH2PO4,CaCl2〃2H2O,MgSO4〃7H2O,FeSO4〃7H2O Na2-EDTA, MnSO4〃4H2O,ZnSO4〃7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4〃2H2O CuSO4〃5H2O,CoCl2〃6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水。 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。四、实验步骤 1 、计算：计算各化学成分所需要的量。大量、微量和盐类按扩大50倍，定容500ml的配制计算。有机和肌醇按扩大100倍，定容200ml的配制计算。计算后制成配方表。2、制定标签：裁取7张适当大小的牛皮纸，用铅笔写上MS，种类，并标明此类母液所含物质，质量，定容体积，扩大倍数吸取量，制备人，制备日期。 3、大量元素母液的配制：先用量筒量取300ml蒸馏水放入500ml 烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，溶解过程用玻璃棒搅拌，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml 容量瓶中，并用蒸馏水将烧杯和玻璃棒洗涤3次，每次约50ml，而后用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，并臵于冰箱中低温保存备用。 4、微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO4〃4H2O,ZnSO4〃7H2O，H3BO3,KI,Na2MoO4〃2H2O。CuSO4〃5H2O 和CoCl2〃6H2O先稀释后用移液管吸取,按制备母液I的方法逐个溶解，转移至容量瓶中，
胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心 细胞工程实验实验报告 胡萝卜愈伤组织诱导培养实验 摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。 关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养 胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。 1.材料和方法 1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。 1.2方法： 1.2.1愈伤组织的诱导培养 （1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8 （2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤） （3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次； （4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块； （5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶 （6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况 1.2.2继代培养 从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（3~4周后在相同培养基上继代培养1次）1.2.3愈伤组织再分化的诱导 （1）培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L （2）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3
胡萝卜愈伤组织的培养
胡萝卜愈伤组织的培养 摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。针对这一问题我们反复实验。通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。 关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制 1.实验流程 （1）实验总流程： MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录 （2）无菌操作流程： 实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程： 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养 （4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程： 器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种 2.实验仪器及材料 胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。 3.实验方法与步骤 3.1胡萝卜愈伤组织的诱导 ①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。 ②外植体接种。把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。为了操作简便、快速，外植体美观，建议使用打孔器切取胡萝卜外植体。具体操作方法: 把消毒好的胡萝卜直根放于无菌培养皿中(建议使用一次性塑料培养皿)，用小刀将其切成2~3cm的小段，用灭过菌的打孔器沿着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的2~3cm的圆柱体，然后用无菌解剖刀片将其切成厚1mm的小薄片，将切好的胡萝卜外植体接种在MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L KT的固体培养基上，放于黑暗处25℃条件下进行暗培养，50d后长出淡黄色愈伤。 3.2胡萝卜愈伤组织悬浮体系的建立 用镊子夹取在固体培养基上继代20d的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤用解剖刀切碎，接种在MS+0.3mg/L 2，4-D+3%蔗糖的液体培养基(pH5.8)中，每100mL的三角瓶中加入MS液体培养基50mL，摇床转速为110r/min，温度为25℃，黑暗培养，每隔7d继代一次，
胡萝卜愈伤组织的培养
胡萝卜愈伤组织的培养 一、实验目的 1、理解胡萝卜愈伤组织培养的培养方法及条件。 2、了解培养基的成分及掌握培养基的配制方法。 3、会对外植体胡萝卜进行预处理和正确消毒。 4、能严格按照操作规程进行无菌操作。 二、实验原理 在离体根培养中，首先解决外植体消毒问题，因为在自然条件下，根生长在土壤中，要进行彻底灭菌、消毒。为了消灭这种污染源，在把植物组织接种到培养基上之前必须要进行彻底的表面消毒；内部已受到真菌或细菌侵染的组织在组织培养研究中一般都淘汰不用。 胡萝卜的肉质根，其硬度较大，容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。 无菌操作技术室用于防止微生物进入实验室区内的操作技术。 要求：①在进行无菌操作之前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭； ②操作过程中是界面与外界隔离，避免微生物的侵入。 目前，多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。 三、实验材料与用具 1、器具：培养瓶、电磁炉、玻璃棒、酒精灯、解剖刀、镊子、酒精棉球（浓度为75%）、烧杯、废液缸、滤纸、玻璃棒、移液管、PH试纸 2、材料：新鲜健康的胡萝卜肉质直根 3、试剂、2.4-D、6-BA、大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液、蔗糖、琼脂、钙盐母液、无菌水、蒸馏水 四、实验方法与步骤 1、配制培养基
（1）、确定配方和配制量：根据实验需要，确定配制培养基的配方。 （2）、计算各种母液和药品用量：a、确定培养基配制量b、查看MS培养基母液的扩大倍数、植物生长调节剂母液浓度c、由母液用量=培养基配方浓度/培养基母液浓度*培养基配制量植物生长调节剂母液用量=培养基配方浓度/植物生长调节剂母液浓度*培养基配制量 （3）、量取：由表一的数据仔细量取相应的量并用托盘天平分别称取蔗糖、琼脂。（4）、溶解：a、在锅内加配制量60%左右的蒸馏水，至于电磁炉加热b、加入琼脂，加热不断搅拌，待琼脂完全溶化后加入蔗糖c、将所量取的各种母液的混合液倒入锅中，搅拌均匀d、琼脂必须完全熔化，以免造成浓度分布不均匀（5）、用蒸馏水定容：a、将完全溶解、混匀后的培养基倒入烧杯中b、加蒸馏水定容至规定体积。 （6）、调节PH（5.8）：用PH试纸将PH调制5.8。 （7）、分装：将配制好的培养基趁热分装到培养瓶中厚度为1cm左右。 （8）、封口：用橡皮筋扎紧封口膜。 （9）、标记：在瓶壁上写上标记，作好记录，准备灭菌 2、培养基灭菌：将培养基放入高压蒸汽锅中灭菌20min左右。 3、接种前的准备工作 A、外植体表面灭菌前的准备工作 （1）、接种室的清洁和消毒及超净工作台的开机和消毒：将接种室、超净工作台清理干净。用酒精棉球将超净工作台进行消毒（酒精浓度为75%）。 紫外灯+风机20min后关闭紫外灯并保持风机吹风状态。 （2）、将待用的培养基，无菌水、解剖刀、镊子、消毒溶液、培养皿、烧杯、玻棒、废液缸放到超净工作台上待用。 B、实验材料的准备 （1）、准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料； （2）、实验材料的修整、刷洗、冲洗； （3）、用洗衣粉水浸洗后再用自来水冲净 用试管刷和肥皂将胡萝卜洗净，浸洗除此表明清洁；洗净后用干净的烧杯盛放，用小刀切成合适大小的4段（每人一段），转入超净台待用。 4、植物材料的表面灭菌和接种 （1）、操作人员洗手消毒，操作前，工作人员的手和小臂用75%的酒精消毒。（2）、装材料的容器及玻棒用酒精表面消毒。
胡萝卜组织培养
. 研究背景 1.1 胡萝卜 胡萝卜(Daucus carota L．)为伞形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，占蔬菜生产总量的3％，达13．5百万吨(Hole，1996)。胡萝卜块根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪[1] 。由于其富含维生素A前体类胡萝b素和植物纤维，因而是一种重要的营养保健品。其适于生食、加工、烹调等多种用途。中国是农业大国，胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。 因此继续深入研究胡萝卜细胞培养还是很有必要的。 1.2 组织培养 植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术[2]。其理论基础是植物细胞具有全能性，即一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，具有发育成完整植株的潜能，在适宜的条件下能够发育成一个完整的植株。进行离体培养时，植物的组织或器官通过脱分化形成愈伤组织。 胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。
2. 材料与方法 2.1 材料 培养皿、锥形瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、烧杯、量筒、玻璃棒、酒精灯、无菌操作台、高压灭菌锅、微波炉、PH试纸。 MS培养基、2,4-D、6-BA、活性炭、无菌水、蔗糖、琼脂粉、75%酒精、1% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液、胡萝卜块根（2012-2-21-怡购，2012-2-24-水果摊，2012-3-13-水果摊，2012-3-21-珠影，2012-3-29-荣一） 2.2 方法 2.2.1 MS培养基的配制200ml ◆用大烧杯取无菌水100-120ml ◆依次用移液管量取加入母液：20ml大量（10x）、2ml微量（100x）、 2ml铁盐（100x）、4ml有机（50x）、2mg/L2,4-D。 ◆称取6g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解。 ◆用量筒定容至20ml。 ◆用pH试纸调pH至6.0-6.2 ◆称取1.6g琼脂加入，搅拌。 ◆放入微波炉内加热直至清澈无沉淀。 ◆分装后高压灭菌3h。 探究实验1激素为1.0mg/L2,4-D，1.0mg/L6-BA[3] 探究实验2激素为2.2mg/L2,4-D[3 4]
胡萝卜组织培养系统实验
胡萝卜组织培养系统实 验 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
云南大学生命科学实验教学中心 实验报告 课程名称：细胞工程实验 院系：生命科学学院 2013级生物技术（国家生命科学与技 年级专业： 术基地班） 姓名：杨梦梅选课号： 学号：座号：A2 开课日期：学期：2015秋季学期 任课教师：吕琦、牛芸 云南大学生命科学实验教学中心制 胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究 第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗 (云南大学生命科学学院, 昆明 650504) 摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT;继代培养1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。 关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织; The study about inducement, subculture and suspension cell lines of Carrots’ callus
Abstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth. Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特 别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。但是在胡萝卜细胞培养方 面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次 生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。 1材料和方法 1. 1 材料来源 胡萝卜肉质根自农贸市场购买. 1. 2 方法 1. 2. 1 MS培养基的配制1000ml 1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml 2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、 10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。 3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。 4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放 在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。将1号溶液加入，继续
胡萝卜愈伤组织诱导
胡萝卜愈伤组织的诱导 摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。 关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素 一、引言 19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。 植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。 外植体在培养过程中切口产生的多酚类物质被氧化成褐色的醌类物质,这就是褐变现象。目前已在许多植物组织培养中发现有褐变现象,尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变现象主要发生在外植体,外植体的部位不同,取材时期不同,褐变程度亦不同,如油棕用幼嫩器官或组织,胚等作外植体进行培养,褐变较轻,而用高度分化的叶片作外植体,接种后很容易褐变。选择适当的外植体进行预处理之后,选择适宜的培养基,在黑暗或弱光下进行培养,并在培养基中加入活性碳可以防止细胞褐变的发生和发展;在外植体接种后1-2天既转移到新鲜培养基上,使细胞在褐化之前及时转移可以大大减轻或避免褐化。 胡萝卜营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。从20世纪初到近几年，胡萝卜一直是科研人员的主要研究对象。同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根。 植物组织培养首先不仅可以生产大量良性系，而且可以获得人类需要的多种代谢物质；其次，细胞融合可打破种属间的界限，客服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培养和种性的改良中发挥着巨大的作用；再次，还可获得单倍体，三倍体及其他多倍体，非整倍体;最后，组织培养的植物细胞液成为在细胞水平上分析研究的理想材料。 二.材料和方法 （一）试剂器材
胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究
山西师范大学学报(自然科学版) 第18卷第2期Journal of Shanxi Teacher c s University Vol.18No.2 2004年6月Natural Science Edition June2004文章编号:1009-4490(2004)02-0071-06 胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究 尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红 (首都师范大学生物系,北京100037) 摘要:分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125@104个/mL~2.325@104个/50mL时,7d~9d为对数生长期;继代培养4代~5代时,可得到稳定的悬浮细胞系. 关键词:胡萝卜;组织培养;细胞悬浮培养;松散型愈伤组织;生长曲线 中图分类号:S631.2文献标识码:A 胡萝卜(Daucus carota L.),属于十字花科植物,是一种十分重要的蔬菜作物,由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培.中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要[1].近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,作为生物技术研究的理想材料,许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究.我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展,特别是在组织培养、原生质体融合[2]、遗传转化及再生等方面.但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多,因此继续深入研究还是很有必要的. 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物A-胡萝卜素、B-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础. 1材料和方法 1.1材料来源 胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供. 1.2方法 收稿日期:2004-03-22 作者简介:尹文兵(1979)),男,山西安泽人,首都师范大学在读硕士研究生,主要从事功能基因组学方面的研究.
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
实验序号01 实验名称胡萝卜愈伤组织的诱导培养 实验时间2010年4月——5月实验室组培实验室 1．实验目的 1）、通过本次实验，能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂。 2）、通过本次实验，使学生能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 3）、通过本实验，使同学们能够熟练的掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。 4）、通过本次实验，使同学们熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。2．实验原理、实验流程或装置示意图 1）、培养基的成分 目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。 2)、培养基的配制方法 Ⅰ、配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。最后调节PH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。 Ⅱ、如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制： ①一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。 ②另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在2~4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。此法较为常用。 3）、MS培养基母液的配制 在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物；同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。 母液的配制有两种方法： ⅰ一种是配制成单一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。 ⅱ另一种是配成几种不同化合物的混合母液。此法在大量配制同种培养基时省力。 配好的母液应放在试剂瓶中贮存。 3．实验设备及材料 1）、设备： 冰箱、普通天平、分子天平、试剂瓶（棕色和白色）、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、三角瓶、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（５.４～７.０）、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、50ml三角瓶、1000ml搪瓷杯、50ml量筒、10ml和5ml吸管、PH试纸（5.4～7.0） 2）、药品和试剂： 硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4—D（2、4—二氯苯乙酸）、6—苄基腺嘌呤（6—BA）、盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物、盐酸（1mol·L-1）、氢氧化钠（1mol·L-1）。胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75%酒精、0.1%氯化汞、MS基本培养基和常用试剂母液、蒸馏水。3）、实验材料： 胡萝卜储藏根
胡萝卜组培实验报告
本科学生综合性实验报告 学号：姓名： 学院：生命科学学院专业、班级：班 实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞 悬浮及体细胞胚胎发生培养实验 教师： 开课学期：至学年学期 填报时间：年月日 云南师范大学教务处编印
一．实验设计 实验序号实验一实验名称胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬 浮及体细胞胚胎发生培养实验 实验时间2013年3月-6月实验室325 实验内容： 实验1-1 MS培养基母液的配制与保存 实验1-2 MS固体培养基配制 实验1-3 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养） 实验1-4 胡萝卜愈伤组织培养 实验1-5 胡萝卜愈伤组织继代增殖培养 实验1-6 胡萝卜细胞悬浮培养 实验1-7 胡萝卜愈伤组织器官分化培养 一．实验目的 1-1：使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。 1-2：通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。 1-3：使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，并且基本掌握愈伤组织的诱导培养。 1-4：使同学熟练掌握愈伤组织培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。 1-5：使同学熟练掌握愈伤组织继代增殖培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。 1-6：使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。 1-7：使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。 二、实验原理、实验流程 1.实验原理 植物细胞全能性是植物组织培养的细胞基础。生活的植物细胞只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。 1-1：培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的
胡萝卜愈伤组织培养实验报告
植物细胞工程 -胡萝卜的组织培养姓名：物理数学狂班级：生物技术综合班学号：2019004284 【实验计划】 1.MS培养基母液的配置与保存、MS固体培养基的配置（准备实验） 2.外植体胡萝卜愈伤组织的诱导培养（2018.10.18） 3.胡萝卜愈伤组织的继代培养（2018.11.8） 4.胡萝卜愈伤组织悬浮培养（2018.11.22） 5.胡萝卜愈伤组织诱导生根（2018.12.1） 6.观察实验结果（2018.12.13） 【实验时间】 2018年10月18日-2018年12月13日
实验（一）MS 培养基母液的配制与保存 一、实验目的 1.通过MS 培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能； 2.掌握培养基各种母液的保存方法。二、实验原理 1.MS 培养基的特点：①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③含有一定的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。MS 按照营养水平划分为基本培养基。 2.培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养物质，配置培养基时，为了减少试剂称取时的工作量出现的误差，以及多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，需要预先将各种营养成分配置为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到适合的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。 3.需要时将配置好的母液按一定比例稀释到培养基指定浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调解物质等，制成符合要求的培养基。 三、器材与试剂 1.器材：各类天平、磁力搅拌器、冰箱、烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、标签； 2.试剂：95%酒精，0.1-1N NaOH ，0.1-1N HCl ，配制MS 培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。四、方法步骤（一）母液的配制 母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。优点：（1）保证各物质成分的准确性； （2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。 1.MS 大量元素母液（10×） 称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液100ml 。 化学药品 1升量10升量（10×） ①NH 4NO 31650mg 16.5g ②KNO 3 1900mg 19.0g ③CaCl 2·2H 2O （CaCl 2）440mg 4.4g ④MgSO 4·7H 2O（MgSO 4） 370mg 3.7g ⑤ KH 2PO 4 170mg 1.7g 2.MS 微量元素母液（100×） 称10升量溶解在100ml 蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml 。
胡萝卜组织培养
胡萝卜组织培养 摘要胡萝卜具有很高的营养价值, 在世界各地广泛栽培, 在许多国家和地区尤其是发达国家, 是人们食用最多的蔬菜之一, 美国把其列为前位的蔬菜。据联合国粮农组织统计, 全世界每年每人的消费量平均为。胡萝卜起源于中亚和地中海地区, 十二世纪传到北欧, 十四世纪传到中国, 十五世纪传到日本,橙红色胡萝卜于十七世纪出现在北欧, 以后传遍世界各地, 而在那以前主要栽培的是黄色与紫色胡萝卜。本文主要介绍胡萝卜组织培养的原理、培养中应注意的问题和胡萝卜组织培养的的应用：在体细胞配的建立、产胡萝卜素中的应用。 关键词:胡萝卜组织培养应用 胡萝卜(Daucus carota L. ) 又名红萝卜、丁香萝卜、药性萝卜等,是伞形科胡萝卜属的2 a 生草本植物。因其营养丰富、又具药用价值,且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏,而成为人们常食蔬菜。胡萝卜(D aucus carota L. ) 为伞形科植物, 是世界上最重要的蔬菜作物之一, 占蔬菜生产总量的3% , 达13. 5 百万吨(Hole, 1996)。胡萝卜块根营养丰富, 约含有88% 的水、6%～8% 糖、1%～ 2% 植物纤维、0. 7%～ 1. 2% 蛋白质、1% 灰份及0～ 3% 脂肪。其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培. 中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用. 因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要. 植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 1胡萝卜组织培养的原理 植物组织培养的原理是细胞全能性。也就是说每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。 组织培养基于此原理就可以将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。 2胡萝卜组织培养的注意问题和思考问题 经过一段时间培养后, 可获得由成熟组织培养后长成的植株, 在此过程中常见问题: ①切取外植体时尽量取胡萝卜的形成层进行接种，形成层相对木质部和韧皮部较容易诱导出愈伤组织。②实验过程中所需要用到的实验用具以及固体液体培养基都要经过严格的灭菌，防止实验污染导致实验失败。 ③悬浮培养过程中如果培养液出现乳白色的混浊，打开后可闻到刺鼻的气味，证明培养液已污染，不能进行下一步接种实验。 3胡萝卜体细胞胚再生系统的建立 胡萝卜可食部分—贮藏根具有发达的韧皮部,适合表达外源蛋白,使很多科研工作者乐于用它作为植物生物反应器的受体。因此,建立胡萝卜的优良再生系统,已经越来越受到人们关注。早在1958 年,Steward 和Reinert 就已经从胡萝卜的愈伤组织通过体细胞胚途径诱导产生了完整植株;随后在1972 年,Granbow 又用胡萝卜的根和叶柄作为外植体通过体细胞胚途径诱导产生了再生植株;之后关于胡萝卜组织培养的研究、体细胞胚发生机制的研究以及近30 年来关于胡萝卜遗传转化的研究一直接连不断。目前用于胡萝卜离体培养产生体细胞胚的培养基差别很大,基础培养基主要涉及B5 和MS ,所用激素的种类和浓度的差别就更大。近年来,育种者不断培育出新的胡萝卜优良品种。由于基因型的影响,对不同的胡萝卜品种进行离体再生时,所适应的培养基配方可能要发生相应的变化。该试验通过对培养基组成、外植体类型和品种进行筛选,优化了胡萝卜品种长城红玥和开拓者的体细胞胚再生系统,试验结果对胡萝卜的基因工程研究具有理论和实践意义。