胡萝卜愈伤组织诱导培养实验

云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心

细胞工程实验实验报告

胡萝卜愈伤组织诱导培养实验

摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。

关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养

胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。

1.材料和方法

1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。

1.2方法：

1.2.1愈伤组织的诱导培养

（1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8

（2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤）

（3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次；

（4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块；

（5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶

（6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况

1.2.2继代培养

从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（3~4周后在相同培养基上继代培养1次）

1.2.3愈伤组织再分化的诱导

（1）培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L

（2）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。适当条件下培养1-3周。

2.结果

2.1愈伤组织的诱导培养结果如下图，

通过观察，看出M1和M2均被污染长出菌，M3水清化，M4和M5褐化，均没有成功诱导愈伤组织形成，比较于小组其他同学的培养情况统计于下表：

Table 2小组诱导愈伤组织形成情况 M1

M2

M3

M4

M5

诱导率

污染率

我的 污染 污染 水清化 褐化 褐化 0% 40% 2 污染 污染 水清化 水清化 污染 0% 60% 3 污染 污染 污染 污染 污染 0% 100% 4 褐化 水清化 褐化 水清化 污染 0% 10% 5 污染 污染 污染 水清化 污染 0% 80% 6 污染 污染 污染 污染 污染 0% 100% 总计

5污染1褐化

5污染1水清化

3污染2水清化1褐化

3水清化2污染1褐化

5污染1褐化

统计后得到小组全部都是没有成功诱导愈伤组织形成，实验失败，诱导率为0。

Figure1.M1 Figure2.M2 Figure3.M3

Figure4.M4 Figure5.M5

2.2继代培养结果

因诱导愈伤组织培养失败，所以向老师取来的成功的愈伤组织继代培养，结果如下图

Figure6.初次继代培养Figure7.二次继代培养

由图片看出来初次继代培养结果良好，愈伤组织继续分化，二次继代培养结果在形态上已经变大且在组织外层透亮说明生长良好；

2.3愈伤组织再分化的诱导

再分化的结果待观察

3.讨论

3.1对于小组内诱导愈伤组织形成的培养结果全部失败，进行详细的分析，分为以下几点3.1.1大部分被微生物感染，培养基内长出大面积菌落，仔细观察有生出霉菌占大部分，有白色霉菌的孢子丝，还有淡黄色霉菌，还有粘稠的细菌菌落，分析原因有以下几点（1）首先材料来源带来的污染，材料来源不是无菌植株培养出来的，而是一般市售的胡萝卜，所带有的微生物大部分可能在消毒过程已杀死，但是在外表皮有细缝沾有的微生物未被清除，在切材料时被外层微生物污染，还有因在多次清洗消毒过程会造成材料损伤，给内部材料造成影响；

（2）培养瓶封口塑料盖用久了容易老化，密封性差造成的污染，但我们后面发现更大可能是盖子没有旋紧，因为盖子是塑料的盖上以后很容易盖歪了然后旋不动，就以为是盖紧了其实是没有旋紧，让培养过程中空气进入造成大面积污染；

（3）学生操作过程不注意细节部分，比如操作者的双手要完全伸入超净工作台，操作物品尽可能挨近工作台吹风口，在取各种无菌的器材要用灭菌镊子拿取，打开瓶口要盖子倒放在工作台酒精灯附件，而不是正扣下去，这一点也是造成污染主要原因，因盖子正扣会使盖子内部沾到工作台的微生物；

（4）操作因不熟练所以操作步骤繁琐，耗时过长，使材料或者培养基长时间暴露，因为操作环境不是完全的无菌，所以操作熟练动作快缩短时间可以减少污染；

3.1.2有水清化的现象，是不生长,不死亡,也无愈伤形成

3.1.3有褐化的现象，是不生长,组织块颜色发黑，边缘发白，大部分是已死亡；

3.2对于继代培养没有被污染，能够正常分化，在取已经形成好的愈伤组织时来源是无菌材料做的愈伤组织，所以没有形成二次污染，在材料方面没有带来污染，且操作上也没有带来污染；

4.小结

4.1实验最初是利用不同培养基中加入不同比例的激素研究不同比例激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，但由于愈伤组织诱导分化结果失败，因造成污染或是材料不分化最后结果是诱