病毒毒性疫苗制造技术
病毒性疫苗制造技术
任务一灭活苗的制造流程
菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活
↓
↓
配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩
工序一菌种与种子培养
选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。
工序二菌液的培养
用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。
实例大肠杆菌的菌液培养方法
(1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。
(2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min
(500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。
如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。
工序三菌数计算
采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中的细菌总数。
工序四灭活与浓缩
对大肠杆菌菌液应加入0.5％甲醛溶液，置37℃温箱作用48～72h，以达到杀死细菌的目的。灭活后需对菌液进行浓缩，常用的浓缩方法有离心沉降法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。可使菌液浓缩1倍以上。
工序五配苗与分装
配苗就是在菌苗的制备过程中加入佐剂，以增强免疫效果。由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不同。例如,大肠杆菌氢氧化铝菌苗细菌计数所得原菌液的浓度，用灭菌生理盐水将其稀释成最终浓度为100亿～400亿个/ml。按每5份菌液加入1份氢氧化铝胶配苗，同时加入0.01%硫柳汞，充分振荡，置2～8℃静止2～3d，抽弃上清液，浓缩成全量的60%。塞上胶塞，用固体石蜡溶化封口，贴上标签，注明菌苗名称。使用前充分摇匀。,整个制备过程都必须在无菌条件下按照无菌操作进行
介绍常用灭活剂
1.甲醛
甲醛是最古典的、也是应用最广的一种灭活剂。为无色气体，易溶于水和乙醇，其36％～40％水溶液称为福尔马林。
甲醛用于疫苗灭活的浓度为0.1％～0.5％。一般需氧细菌用0.1％～0.2％的浓度，厌氧菌则多用0.4％～0.5％的浓度。病毒可在0.05％～0.4％的之间，多数使用0.1％～0.3％。
2.苯酚又称石炭酸。为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，易潮解，溶于水及有机溶剂。置于空气中易被氧化，应避光保存。
灭活机制是使微生物的蛋白质发生变性和抑制特异酶系统（如脱氨酶、氧化酶等）的活性，从而导致微生物死亡。制作生物制品的常用浓度为0.3％～0.5％。
3.β-丙内酯又名为羟基丙酸-β-内酯，性状为不稳定，无色，有刺激气味的液体，是一种良好的病毒灭活剂。
β-丙内酯的灭活机制是破坏病毒的核芯，但不损害衣壳蛋白，因此能保持病毒良好的免疫原性，主要用于狂犬病灭活苗的制备。
4.结晶紫是一种带有金属光泽的绿色结晶或深绿色结晶状粉末的碱性染料，易溶于醇、氯仿，不溶于水和醚。
灭活机制主要是它的阳离子与微生物蛋白质的羧基形成带弱电的化合物，妨碍了微生物的正常代谢，扰乱微生物的氧化还原作用，使电势太高而不适于微生物的增殖，对革兰氏阳性菌主要是干扰细胞壁肽聚糖的合成。
5.硫柳汞又称乙基汞硫代水杨酸钠，为无色结晶或乳白色粉末，微有特殊气味，易溶于水和乙醇，不溶于乙醚和苯，应避光保存。用于生物制品的防腐和消毒，对霉菌、细菌和病毒都有一定的灭活作用。常用浓度为0.01％～0.02％。
6.烷化剂是含有烷基的分子中去掉一个氢原子与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。其灭活机制是烷化微生物DNA、RNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双链交联，也可与酶系统和核蛋白起作用，破坏核酸代谢、合成，使病毒丧失感染力，但不损害蛋白衣壳，从而保留其抗原性。这类烷化剂常用的有N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺及缩水甘油醛等。
介绍常用的免疫佐剂
(一)免疫佐剂的概念
免疫佐剂又称佐剂，是指单独使用没有免疫原性，与抗原物质合并使用能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用的一类物质。其作用特点是：①对某些分子的相对质量小的多糖或多肽等抗原性微弱的物质，可明显增强其抗原性；②可用最小的抗原量、最少的接种次数，刺激机体产生足够的免疫应答和高滴度的抗体，在血流中或黏膜表面维持较长时间，发挥持久作用。
(二)常规免疫佐剂
1.铝盐类佐剂
(1)．氢氧化铝胶简称铝胶。铝胶可用制造多种兽用疫苗。
(2)．明矾
(3)．磷酸三钙
2.弗氏佐剂
弗氏不完全佐剂是由3份液体石蜡油、1份无水羊毛脂、4份磷酸缓冲盐水（pH7.2）混合而成。制造时，先将各成分混合均匀，116℃高压灭菌30min，冷却后加入1％吐温-80混匀，使用时与抗原物质等量混合。
弗氏完全佐剂是在不完全佐剂中加入杀死的分枝杆菌或卡介苗，按l～2mg／ml 的量加入，使用时与抗原物质等量混匀。
3.油乳佐剂
油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。
4.蜂胶佐剂
蜂胶是由蜜蜂上颚腺的分泌物和由蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其他植物幼芽分泌的树脂以及蜂蜡、花粉等组成。
5.微生物佐剂
(三) 新型免疫佐剂
1.细胞因子类佐剂
白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）
白细胞介素-12（IL-12）γ-干扰素。
2.免疫刺激复合物(ISCOM)佐剂
任务二活疫苗的制造流程
弱毒疫苗的制造流程
菌种与种子→菌液培养→浓缩→配苗与冻干
工序一菌种与种子。
弱毒菌种多是冻干制品，在使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、免疫原性等鉴定，合格后将菌种接种于规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即作为种子液。种子液保存在0～4℃，有效期2个月。在保存期内用作菌苗生产的批量种子使用。
工序二菌液培养。
按培养基1%～3%的比例接入种子液，依不同菌苗的要求制备菌液。如猪丹毒弱毒苗在深层通气培养中要加入适当植物油作消泡剂，并通入过滤除菌的热空气。菌液于0～4℃暗处保存，经抽样无菌检验、活菌计数合格后使用。
工序三浓缩。
经上述检验合格的菌液进行浓缩，其目的是提高单位活菌数，进而提高某些弱毒菌苗的免疫效果。常用的浓缩方法有吸附剂吸附沉降法和离心沉降法。浓缩菌液应抽样作纯粹检验、无菌检验及活菌计数。
工序四配苗与冻干。
将检验合格的菌液按比例加入冻干保护剂（如5%蔗糖脱脂乳）配苗，充分摇匀后立即分装。随后将菌苗迅速放入冻干柜预冻和真空干燥，并立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存后由质检部门抽样检验
介绍常用的冻干保护剂
（一）冻干保护剂的组成和分类
1．低分子物质又称为营养液，是一种均匀的混悬液，使微生物保持稳定的存活状态及对水分子起缓解作用，使冻干生物制品保留一定量水分，促进高分子物质骨架形成，使冻干制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。如糖类和氨基酸类（谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨酸）等。
2．高分子物质又称为赋型剂，在冻干生物制品中主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。高分子物质范围很广，种类甚多。如白蛋白、血清、明胶、脱脂乳、各种液体培养基、淀粉、酵母浸膏、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素等。
3．抗氧化剂具有抑制冻干制品中酶的活化作用，从而促进、保持微生物等活性物质的稳定性。抗氧化剂包括一些有机物质和无机物质，如维生素C、维生素E、硫脲、碘化钾、钼酸铵和硫代硫酸钠等。
(二)、冻干保护剂分类
1.根据冻干保护剂的化学性质分类
可分为复合物、糖类、盐类、醇类、酸类、碱类、聚合物等
2.根据冻干保护剂的作用机制分类⑴．渗透剂⑵．非渗透剂
(三)常用的冻干保护剂
1．5％蔗糖脱脂乳保护剂
2．脱脂乳-谷氨酸钠保护剂
3．7.5％葡萄糖血清保护剂
4．环乙醇-血清保护剂
5．喷雾干燥用保护剂
（四）不同微生物适用的保护剂
1．需氧和兼性厌氧菌可用5％蔗糖脱脂乳，或含1％谷氨酸钠的10％脱脂乳，或l0％脱脂乳与犊牛血清，或5％蔗糖，或1.5％明胶等。
2．厌氧菌可用10％脱脂乳，或7.5％葡萄糖加血清，或用含0.1％谷氨酸钠的10％乳糖等。
3．病毒可用明胶、血清、蛋白胨、乳糖、蔗糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮等，也可加入脱脂乳，或者几种成分混合配成保护剂。
4．支原体可用3％脱脂乳加5％葡萄糖混合液，或1％牛血清白蛋白，或50％健马血清，或7.5％葡萄糖加血清等。
5．立克次体常用10％脱脂乳。
6．酵母菌可用健步马血清，或7.5％葡萄糖加血清，或脱脂乳加谷氨酸钠和蔗糖等。
任务三类毒素的制造流程
类毒素的制造流程
菌种与毒素→脱毒→类毒素的精制
工序1菌种与毒素
应选用中监所分发或批准的产毒效价高、免疫力强的菌株，必要时可对菌种进行筛选。菌种应定期作全面性状检查（如细菌形态、纯化试验、糖发酵反应、产毒试验及特异性中和试验等），并有完整的传代、鉴定记录。菌种应用冻干或其他适宜方法保存在2～8℃。选择适宜的培养基制造种子菌及毒素。毒素制造过程应严格控制杂菌污染，经显微镜检查或纯化试验发现污染者应废弃。毒素须经除菌过滤后方可进行下一步制造程序，亦可杀菌后进行精制。
工序2脱毒
目前采用最可靠的脱毒方法仍是甲醛溶液法，温度控制在37～39℃，终浓度控制在0.3%～0.4%。脱毒后的制品即成粗制的类毒素。经检验合格者，置2～8℃保存，有效期可达3年。
工序3类毒素的精制
用人工培养法所制得的粗制类毒素液含有大量的非特异性杂质，而毒素含量较低。因此，有必要对类毒素进行浓缩精制，以获得纯的或比较纯的类毒素制品。（1）物理学方法可用冷冻干燥、蒸发、超滤、冻融等方法除水浓缩；也可用氧化铝和磷酸钙胶等固相吸附剂吸附。
（2）化学沉淀法有酸沉淀法（盐酸、硫酸、磷酸、三氯醋酸等）、盐析法（硫酸盐、硫酸钠及磷酸盐缓冲液等）、有机溶剂沉淀法（甲醇、乙醇及丙酮等）和重金属阳离子沉淀法（Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+等，其中以氯化锌应用最广）。（3）层析法有凝胶过滤和离子交换层析法。
类毒素精制后应加终浓度0.01%硫柳汞防腐，并尽快除菌过滤。保存于2～8℃，有效期为3年。
实例猪链球菌蜂胶苗制备
1．材料与试剂
（1）器材：粉碎机或垫板和锤头.研磨器.量筒.玻璃棒.离心机.吸管等。（2）试剂：95%酒精
2．蜂胶佐剂疫苗制备方法
（1）蜂胶的处理：
①用市售蜂胶，放4℃以下低温贮存，制备前用粉碎机或垫板和捶头在4-8℃下粉碎。
②过筛，按1：4加入95%乙醇，室温浸泡24-48h。
③冷却，过滤或离心取上清液，即得透明栗色纯净蜂胶浸液。
④除去干渣，计算出浸液中蜂胶含量，浸液置4℃以下保存备用。
（2）链球菌的培养
①将至病性链球菌接踵于普通肉汤培养基中，37℃震荡培养至细菌生长饱和状态。
②将菌液3000rpm 离心20min，弃去上清液，沉淀物用灭菌生理盐水或PBS液稀释至所需浓度，同时要求纯粹生长。
③将菌液灭活：在菌液中缓慢加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，边加入变搅拌，使之完全混匀，置37℃灭活24h。
（3）蜂胶佐剂疫苗的制备：
在灭活菌液中加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中喊蜂胶10mg，边加边摇荡，迅即成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。
（4）疫苗的检验
自制菌苗的检验主要为安全检验，取注射计量的5-10倍的剂量注射实验猪，猪在注射后应无异常反应，或反应很轻微。
任务四几种主要细菌性疫苗的制作
实例1布鲁氏菌19号活疫苗的制作
（1）菌种制苗菌种为牛种布鲁氏菌弱株A19，其生物学特性典型。
（2）制备工序
工序1种子繁殖冻干菌种接种于胰蛋白琼脂平板培养基上,于36-37℃培养2-3d,选取典型菌落,再次接种于胰蛋白琼脂平板营养48-72h,作为种子.
工序2菌液培养按培养基总量的1%-2%将种子液接种于马丁肉汤,在 36-37℃下通气培养36h期间于第12h、20h、28h分别按培养基总量的 1%-2%加入50%葡萄糖溶液。纯粹检验合格。
工序3浓缩与配苗将菌液用PH6.3-6.8缓冲生理盐水稀释成120亿-160亿个/ml,无菌分装即为湿苗,若制冻干苗,按总量的 0.2%_0.4%加入羧甲基纤维素钠,浓缩沉淀菌体.浓缩的菌液纯粹检验及活菌计数合格后,加入PH7.0的蔗糖明胶稳定剂进行配苗,定量分装,迅速冷冻真空干燥.
实例2仔猪大肠杆菌三价灭活苗制作
（1）菌种制苗用菌种为C83549.C83644.C83710菌株,检验用菌种,检验用菌种为 C83902 C83912 C83917菌株.要求用相应的 K88 K99和987P因子血清做平板凝集反应,达到强阳性反应.
（2）制备工序
工序1种子繁殖将各株冻干菌种接种改良Minca汤中培养后,用改良Minca琼脂平板划线分离,选取典型菌落若干,分别用相应的 K88 K99和987P因子血清逐个做平板凝集反应,选取强阳性反应菌落,接种改良Minca汤中培养,作为一级种子.取一级种子按上述方法繁殖,革兰氏染色镜检后 ,无杂菌者作为二级种子.
工序2菌液制备将二级种子进行连续通气培养,搅拌速度为600r/min，通气量大于1：1，第一代通气培养7h，取样检验合格，即收获，并按加入培养基的3%-5%留有种子，然后加入培养基，通气培养6-7h，再收获，如此循环培养，但最多吧超过10代。培养温度为36-37℃，0.01%花生油为消泡剂。
工序3配苗与分装按总量加入20%氢氧化铝胶，最后补加PBS和 0.01%硫柳汞，每1ml成品苗中应含有K88100个抗原单位、K99 50个抗原单位、987P50个抗原单位、菌种≦200亿个。经无菌检验合格后，进行混合、分装。
实例3猪丹毒灭活疫苗
本疫苗是用免疫原性两好的B型猪丹毒杆菌，接种于适宜培养基中培养，培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶浓缩后制成。用于猪丹毒的预防。皮下或肌肉注射，体重在10kg以上的断奶猪5ml；未断奶仔猪3ml，间隔1个月后，再注射3ml，注射后多无不良反映，但有时注射部位出现硬结，可逐渐消失。免疫期为6个月。
活疫苗国内猪丹毒弱毒疫苗使用菌株很多，目前，我过猪丹毒弱毒
疫苗生产中广泛使用是GC
42和G
4
T
10，
两个菌株。
实例4猪丹毒GC
42
活疫苗
将GC
42
弱毒菌株接种与明胶平板上进行培养，选取呈分支状生长的典型菌落，接
种在血液琼脂斜面上培养作为菌种。制苗时再将斜面培养物接于肉肝肠膜消化汤。37℃培养20h将培养物作为种子液，按1%接种于含2%血清或裂解红细胞全血的肉肝肠膜消化汤，35-37℃培养20h经菌数计算和纯粹检验后，7份菌液与1
份明胶蔗糖保护剂混合分装冻干即成。分头份活菌GC
42
应不低于7亿个.安全检疫用小白鼠应全部健活.-15℃保存,有效期1年;2-8℃保存,有效期9个月.使用时,按瓶签标定的头份加入20%铝胶生理盐水稀释溶解,每
头猪皮下注射1ml,疫苗稀释后,限4h内用完, GC
42
疫苗亦可用于口服,口服时剂量加倍,口服前应停食4h,免疫后7-9天产生免疫力.断奶猪免疫期可达6个月. 任务五细菌性疫苗生产中的主要设备
仪器设备:超净工作台恒温培养箱灭菌平板灭菌试管培养病毒的方法:动物培养,组织培养,细胞培养
任务一病毒性组织疫苗的制备
流程：动物选择→ 种毒与接种→观察与收获→制苗
工序1动物选择
动物质量对组织疫苗的质量有着直接影响，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用。所选择的动物应是SPF动物，对所接种的病毒易感性高，在品种、年龄和体重等方面应合乎要求。
工序2种毒与接种
种毒既可用强毒株的脏器组织毒或增菌培养物，也可用弱毒株的组织毒。无论何种种毒都必须经纯粹性、抗原性等检查合格后使用。无疑，生产不同批次的疫苗也可使用同一批检验合格的种毒批，以减少疫苗批次间的质量差别。
将检验合格的种毒接种到动物体内进行病毒的增殖培养。种毒的接种途径依病毒性质和目的而异。如猪瘟结晶紫疫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾、淋巴结毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内感染。
工序3观察与收获
动物在接种毒种后应每天观察和检查规定的各项指标，常规检查的项目有食欲、精神、活动状态、体温、粪尿和血液变化等。根据观察和检查的结果选出符合要求的发病动物，按。规定方式剖杀，采取、收集含毒量高的器官组织，用于制备疫苗。如兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产，猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备，狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。
工序4制苗
（1）组织灭活疫苗收获的含毒组织经无菌检验及毒价测定合格后按规定比例加入平衡液和灭活剂(甲醛、酚、结晶紫等)制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份、结晶紫甘油溶液1份混合，于37～38℃减毒6～8d制成。
（2）弱毒组织疫苗在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，
称重后剪碎，加入适量保护剂制成匀浆，然后过滤去除残渣，按实际滤过的组织液计算稀释倍数，加入余量保护剂即为原苗。原苗按100IU（μg）/ml加入青、链霉素，摇匀后置4℃作用一定时间，作无菌检验与毒价测定，合格者进行分装、冷冻真空干燥制成冻干疫苗。
任务二病毒性禽胚培养疫苗的制备
流程：禽胚的选择与孵化→种毒与毒种的继代→ 接毒与收获→配苗
工序1禽胚的选择与孵化
生产用的鸡胚应来自SPF鸡群或未用抗生素的非免疫鸡群的受精卵，蛋壳为白色且薄厚均匀。按常规无菌孵化至所需日龄用于接种。
工序2种毒与毒种的继代
种毒应由国家菌、毒种保藏部门供应，适应于鸡胚的种毒多系弱毒且为冻干毒种，使用前需在鸡胚上继代复壮3代以上和检验合格后方可用于生产。毒种鉴定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的鉴定等。
工序3接毒与收获
鸡胚接毒可根据不同的病毒与不同疫苗生产程序选择最佳接种途径和最佳接种量，目的在于获得最高的毒价。接种途径常采用尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种和卵黄囊接种。
工序4配苗
按规定收获的尿囊液和卵黄囊液经无菌检验合格后，可直接配苗。胎体和绒毛尿囊膜需剪碎制成乳剂后，再经无菌检验合格，方可配苗。
（1）湿苗将经无菌检验合格的病毒液按规定加入双抗（青、链霉素），放置2～8℃冷暗处处理后分装。
（2）冻干苗将无菌检验合格的病毒液，按1∶1比例加入保护剂（5%蔗糖脱脂乳），按规定加入双抗，混匀后分装冻干。
（3）灭活苗(佐剂苗) 将无菌检验合格的病毒液，加入适当浓度的灭活剂，在适当条件下灭活后，再加入佐剂，充分混匀后分装。
任务三病毒性细胞培养疫苗的制备
流程：种毒与毒种→营养液配制与细胞制备→接毒与收获→配苗
工序1种毒与毒种
种毒由国家指定的菌、毒种保藏部门鉴定分发，多为冻干品。按规定在细胞中继代培养后用作毒种。继代培养控制在一定代数以内。
工序2营养液配制与细胞制备
营养液通常分为细胞培养用的生长液和病毒增殖用的维持液，两者不同的是生长液血清含量为5％～20％，维持液血清含量仅有0％～5％。不同细胞需要不同的营养成分，根据需要选择合适的营养液。常用的营养液有乳汉液、MEM、DMEM、199、1640等，只需溶解后经除菌过滤即可使用。
工序3接毒与收获
病毒接种可与细胞同步（分装同时或分装不久后接种病毒）或异步（细胞形成单层后接种病毒）。待出现70%～80%以上细胞病变时即可收获。收获时可将培养瓶反复冻融后收取；也可加EDTA-胰酶液消化分散收获。收获的细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后，供配苗用。
工序4配苗
灭活疫苗和冻干苗的配制方法见禽胚培养疫苗。
任务四几种主要病毒性疫苗的制备
一、猪传染性胃肠炎H-5活疫苗
将自然强毒株通过猪肾细胞传代120代的细胞弱毒株，经4次克隆纯化作为疫苗株。取其150代以内的细胞毒，在猪肾原代细胞增值后制成冻干苗和佐剂灭活
苗。活疫苗毒价不低于107.0TCID
50/0.3ml。灭活疫苗不低于108.3TCID
50
/ml。一般
免疫两次，第一次给妊娠6周内母猪鼻内喷雾接种弱毒活疫苗1ml，第二次在产前2-3周肌肉注射灭活疫苗1ml。
二、猪传染性胃肠炎华毒株活疫苗
该制苗种毒是华27细胞弱毒株。该毒株通过胎猪肾细胞传代至弱，是将华27-4肠组织强毒通过加有二甲基亚砜的猪胎肾原代细胞传代至弱，在92-165代之间5次克隆纯化，挑选直径小于1mm的小空斑再传代。100代后以后的毒价为104.67 -106.0TCID
50
/0.3ml。妊娠母猪在产前45d及15d左右进行肌肉注射和滴鼻各1ml，仔猪获得的被动免疫的保护率达95%以上。
三、马立克氏病火鸡疱疹病毒（HVT）活疫苗
1种毒制苗用种毒为FC
毒株。用10000PFU以上剂量由卵黄囊接种4-5日龄鸡
126
胚，观察至18-19日龄，应不致死鸡胚。
2制备要点种毒接种于鸡胚呈纤维细胞，上复壮继代1-2代，选择培养48-72h，CPE达70%以上者，收获并作为种子毒液。常用的细胞培养液包括包括199、MEM、199-HL、199-F
等，另外加0.5%-2%犊牛血清和 5%-10%磷酸胰蛋白肉汤。以1：10
60-1：100细胞感染比接毒，37℃培养 64-72h，待CPE达60%时用1：4-1：6
胰酶-EDTA消化细胞，加入适量营养液后离心收集沉淀细胞。然后加入适量SPGA 稳定剂悬浮细胞，用超声波裂解器进行裂解，即为原苗。然后配苗、分装、冻干即可。
四、猪瘟活疫苗I-----猪瘟兔化弱毒兔体组织活疫苗制备
1种毒猪瘟兔化弱毒”C株”.注射家兔后发生定型热反应,体温超过常温
1-1.5℃维持18—24h
2制备要点选择健康的 1.5—3kg体重家兔.用20—25倍生理盐水稀释的脾乳剂.活脾磷乳剂,静脉注射1ml,定期测定其体温.选择定热型反应兔和轻热反
应兔,并在其体温下降到常温后24h内剖杀.在无菌条件下采取脾脏和淋巴结供制备脾淋苗用.采取脾.淋巴结.肝.肺,去除脂肪.结缔组织.血管.胆囊.及病灶部,供生产混合苗用.制备混合苗时,肝脏用量不超过淋巴结.脾重量的2倍,将组织称重后剪碎,加入适量5%蔗糖脱脂乳保护剂,混合研磨后去除残渣,按实际率过
的组织液计算稀释倍数,加入余量保护剂为原苗.每毫升原苗可加青霉素.链霉素各500—1000IU,摇匀.至4℃条件下作用一定时间后即可分装.冻干.
实例1鸡新城疫油苗制备
（一）培养病毒按实习四将鸡新城疫病毒接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。
（二）灭活尿囊液中新城疫病毒
1．灭活方法在尿囊液中加入0.1%甲醛溶液充分振摇后入37℃温箱灭活18h，每隔2～3h振摇一次，置4℃冰箱备用。
2．灭活尿囊液残毒检验取灭活后的尿囊液2ml，接种10日龄SPF鸡胚或非免疫鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37℃温箱培养5d后观察，鸡胚应发育正常，无病变；逐个检测血凝价，HA≤1:16方可判灭活符合要求。
3．无菌检验取1ml灭活毒液加入49ml硫乙醇酸盐培养基中，培养72h后移植到葡萄糖蛋白胨水培养基中和酪胨琼脂培养基上培养5d，应无细菌生长。（三）鸡新城疫油苗的制备
1．配制油苗（油包水型W/O）
（1）配制水相取灭活毒液96ml、吐温-80 4ml于三角瓶中，混合后充分振摇，即成水相。
（2）配制油相取白油94ml、司本-80 6ml、硬脂酸铝2g于三角烧瓶中，置电炉上加热溶解至透明，冷却至室温。在生产实践中，油相配好后需经高压灭菌后方可用来配苗。
（3）乳化将油相与水相按照3:1～2:1的比例配制。实验时如无胶体磨，可采用手工乳化法，方法为将油相装入三角烧瓶中，边摇边缓慢加入水相，水相加完后，充分振摇0.5～1h。在生物制品厂采用机器乳化法，将油相置于胶体磨或高压匀浆泵中，高速搅拌进行乳化。
（四）油苗的检验
1．物理性状检验
①外观乳化后的W/O型油苗应呈乳白色粘稠状。
②剂型用1ml洁净吸管吸取油苗滴入冷水中。油滴不扩散为油包水型（W/O），油滴呈云雾状扩散的为水包油型（O/W）。
③黏度用内口直径为1.2mm的吸管，在室温下吸满1ml油苗，记录垂直放出
0.4ml所需的时间，以2～6s为合格，不能超过10～15s。
④稳定性可采用加速老化法，将疫苗置于37℃环境下贮存10～30d，应不破乳，不分层。或离心加速分层法，将油乳剂装入半径为10cm的离心器中，3 000r/min 离心15min不分层。相当于可保存1年以上不破乳。
2．安全检验取21日龄健康鸡，每鸡颈背部皮下注射1ml油苗(设使用剂量为0.5ml/羽)，共注射5～10只，同时设不接种疫苗的对照组，与免疫组同条件饲养，观察20d，应健康存活，剖杀后，内脏器官及注射部位应无损伤。
3．效力检验取健康非免疫鸡，每鸡颈背部皮下注射0.25ml油苗(设使用剂量为0.5ml/羽)，共注射5～10只，21d后攻强毒，同时设攻毒对照组。攻毒后观察14d，对照组鸡应全死亡，试验组鸡保护率应在70%以上。
4．无菌检查往50ml硫乙醇酸盐培养基中加入1ml油苗，37℃培养72h后，取培养物移植到葡萄糖蛋白胨水培养基中和酪胨琼脂培养基上，接种量为每支
0.2ml，每种培养基各接种2支，分别置37℃、25℃培养，5d后观察，应无细菌生长
实例2鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备
（一）培养病毒
按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液，通过细胞计数结果，调细胞数为100万个/ml。按0.3%～0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒，置37℃ 5%CO
2
培养箱培养72～96h，观察CPE，由法氏囊炎病毒所致的CPE主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。细胞出现70%以上的CPE时即可将培养瓶反复冻融3次，收获病毒，供检测用。
（二）检测TCID
50
1．TCID
50的概念 TCID
50
为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液
接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。
2．病毒TCID
50
的测定
（1）稀释病毒液将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释，即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。
（2）接种细胞培养板取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合，接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4～6孔，每孔100μL，同时设立病毒对
照和细胞对照组。置37℃ 5%CO
2
培养箱培养72h。观察记录病变情况。
（3）判断70%以上的细胞出现CPE判为感染。
（三）法氏囊弱毒冻干苗的制作及检测
1．法氏囊弱毒冻干苗的制作
将细胞培养的病毒液按1∶1的比例加入5%蔗糖脱脂乳保护剂，充分混匀后分装于西林瓶中，盖上棱形胶塞，切勿盖严。放在冷冻真空干燥机中预冻4～6h。取出放入真空罩内抽真空12h，视感疫苗已完全干燥，转动有机玻璃罩上方手柄，使罩中压盖架丝杠转动下移，将瓶盖压入瓶中，使瓶中达到真空状态。
2．冻干苗的检验
（1）真空度检测利用高频火花真空测定器对法氏囊弱毒冻干苗进行测定，如果冻干疫苗瓶内出现蓝色辉光，则真空度检验合格。注意放电火花不应指向容器内的制品，否则会损伤制品。
（2）安全检验取10只10日龄无法氏囊(IBD)母源抗体的健康鸡，每鸡点眼和口服10个使用剂量的疫苗，同时设不接种疫苗的对照组，与免疫组同条件隔离饲养，观察21d，应健康存活，剖杀后，法氏囊应无明显病变。
（3）效力检验取10只10日龄无IBD母源抗体的健康鸡，每鸡点眼和口服1/2使用剂量的疫苗，同时设不接种疫苗的对照组，与免疫组同条件隔离饲养20d 后，攻强毒，免疫组80%以上应健康存活，剖杀后，法氏囊应无明显病变，攻毒对照组应80%发病。
（4）支原体的检验用细胞、禽胚或动物组织制成的活疫苗和用于配制细胞培养液的各种畜禽血清,需做支原体检验。常用改良Frey氏培养基。每批样品取样3～5瓶，因为是冻干制品，先加液体培养基复原成混悬液后，再做检测。
病毒及其疫苗的生产制备技术
第25章病毒及其疫苗的生产制备技术 第一节病毒的生产制备 病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。 一、病毒生产的目的和用途 1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。 4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。 5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。 二、病毒生产制备的方法 1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。 3、细胞培养法（详见第二篇第18章） 不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。 以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。 第二节病毒疫苗的生产制备 病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
病毒载体概述
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
国家科技支撑计划重点项目疫苗关键生产技术研究开发课题申报指引
附件2. “十一五”国家科技支撑计划重点项目“疫苗关键生产技术研究开发”课题申报指南 一、总体目标 本项目的总体目标是着力解决制约我国疫苗产业发展的关键生产技术，完善或建立疫苗关键性技术平台，发挥其示范作用，使我国疫苗大品种生产关键技术水平迈上新台阶，大幅度缩小与发达国家之间的差距。通过项目实施，提高紧缺疫苗大品种的产量，提高优势企业疫苗的质量，为疫苗行业的进一步集约化提供科技支撑；大力推动国际化进程，促进我国疫苗产品出口，提高我国疫苗产品在国际市场的占有率。 通过项目的实施，建立3-5个技术平台，突破5-10项关键技术，力争1-2个品种获得临床研究批件、2-3个品种获准换发生产文号，大幅度提高8-10种疫苗产品的产量，实现我国疫苗产业年销售收入新增8-10亿元。 二、实施年限 项目实施年限为2008年7月～2010年12月。 三、主要内容 课题1、细菌多糖-蛋白结合关键技术及其应用研究 1、研究内容
（1）研究多糖－蛋白质结合化学的适宜方法。利用具有代表性的Hib结合疫苗优化制备条件和结合物大规模纯化技术条件；优化Hib多糖衍生及多糖蛋白结合技术；解决Hib多糖活化、衍生，与载体蛋白结合过程中的条件优化，进行规模纯化层析条件的优化，最终使多糖-蛋白结合疫苗的产量提高，结合物原液质量指标稳定；建立Hib结合物原液、成品中结合物含量、成品中游离蛋白、游离多糖的快速、稳定的测定方法游离蛋白质和游离多糖含量的质量控制方法。 （2）细菌多糖蛋白质结合疫苗质量标准研究。主要包括多价结合疫苗和多联多价联合疫苗质量标准确立（多价疫苗中各种单价疫苗抗原含量检测，游离蛋白、游离多糖含量检测、多种抗原成分剂量、配伍研究，以及最低免疫剂量的确定等）。 （3）载体蛋白多样化研究。开发TT和DT以外的新载体蛋白质；对现有载体蛋白使用风险的评价，以及对新的载体进行安全性、有效性的全面评价研究，完成H21G、64K外膜蛋白、C5a 肽酶等新型载体蛋白的特性研究；以及探索这些新型载体蛋白与细菌多糖结合的方法或工艺。 （4）细菌多糖蛋白质结合疫苗效果评价方法建立。包括： ①标准参考物质的制备； ②抗体含量检测方法建立与标准化； ③抗体功能活性检测方法建立与标准化。 2、考核指标 (1)技术指标
病毒性肝炎
病毒性肝炎 一、概述 ●多种肝炎病毒引起 ●以肝脏炎症和坏死病变为主的一组常见传染病 ●临床表现基本相似、症状多样化（乏力、食欲减退、肝区痛、肝大、肝功异常） ●甲、戊型肝炎为急性肝炎。乙、丙、丁型主要为慢性肝炎 ●重型肝炎病死率高 ●目前缺乏特效治疗方法 ●目前甲、乙型肝炎有特异的预防方法（疫苗接种） 二、问题 1)流行病学特点如何？ 2)肝炎病毒标记物（乙肝两对半）的临床意义？ 3)临床特点？ 4)肝炎的诊断思路、鉴别诊断要点？ 5)抗病毒治疗的目标、指征、方法？ 6)重型肝炎治疗的思路？ 7)病毒性肝炎的预防方法？ 三、病原学 ●HA V RNA ●HBV DNA ●HCV RNA ●HDV RNA ●HEV RNA ●HGV RNA 1996 USA ●TTV DNA 1997 J 四、几种肝炎病毒的共同特点 1)除HBV和TTV属DNA病毒外，其余均属RNA病毒； 2)除HBV有3个抗原抗体系统外，其余只有一个抗原抗体系统； 3)HA V和HEV在肝细胞内复制，通过胆汁从粪便排出； 4)抵抗力较强，耐冷、耐干燥、一般浓度消毒剂无效。 五、【病原学】 （一）甲型肝炎病毒（HA V） 1.病毒分类：HA V属于微小RNA病毒科（picornavirus）,嗜肝RNA病毒属（heparnavirus）。 2.基因结构：单股RNA 3.抵抗力：较强。在水、泥土、贝壳类动物中存活数月。 4.抗原抗体系统：抗HAV lgM：急性感染标志，临床诊断检查 抗HA V lgG：保护性抗体，流行病学调查意义 5.分子生物学标志：HA V-RNA（血、粪） （二）乙型肝炎病毒（HBV） 1.归类：嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus）科 2.形态和结构：HBV颗粒（Dane颗粒），42nM。 （1）胞膜：HBsAg在肝细胞内合成，释放到血液循环中。本身无传染性，但有抗原性。（2）核心：有HBV DNA、DNA聚合酶、核心抗原、E抗原。 HBV感染后病毒在体内存在形式：
重组腺病毒常见问题解答(FAQs)解析
重组腺病毒常见问题解答(FAQs) ?Q1. 使用重组腺病毒需要的生物安全级别？ ?Q2. 怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？ ?Q3. 感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ ?Q4. 感染腺病毒时所需要的培养基的量？ ?Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？ ?Q6. 病毒的滴度是如何测定的？ ?Q7. 对于体外实验（细胞实验）CsCl纯化或层析柱纯化有必要么？ ?Q8. 重组腺病毒的推荐存储条件是什么？ ?Q9. 腺病毒表达系统承载外源基因的容量？ ?Q10. 腺病毒有多种血清型，哪一种是基因传递中最普遍使用的？ ?Q11. 什么是RCAs？ ?Q12. 目前存在的许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，针对我的实验应该使用哪个系统？ Q1.使用重组腺病毒需要的生物安全级别？ 答：我们所提供的重组腺病毒是E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒。根据NIH官方的参考信息，重组腺病毒的生物安全等级被确定为II级，您只需要BL-II级实验设施，值得注意的是，大多数实验室都具备BL-II级的实验设施。野生型腺病毒可复制，能引起感冒和很强的免疫反应，通常不会引起很严重的疾病。要想获得更多生物安全信息，请参考网站https://www.360docs.net/doc/2216640484.html, 返回Q2.怎么确定我所用的细胞模型可以感染腺病毒？ 答：腺病毒有很广泛的宿主范围。它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染。一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性，因此需要大量的病毒来感染细胞。为了客户的
方便，我们提供含有报告基因的病毒，如Ad-CMV-B-gal 和Ad-CMV-GFP从而方便的进行您的预实验。 返回 Q3.感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ 答：要得到最佳的实验结果，确定腺病毒的最佳用量是非常重要的。如果用量不足，那么不能达到100%的感染效率，如果用量太高，会对细胞有毒害作用或者其他不可预测的效应。我们应该尽量用最小浓度的病毒来达到100%的基因传递效率。这个最佳的浓度因不同的细胞类型而有显著差异。为了确定你的细胞系的最适病毒用量，可以用带报告基因的腺病毒做预实验，如AdCMV-B-gal 或者AdCMV-GFP。用不同稀释倍数的报告基因病毒感染细胞，在感染1-2天后检测感染效率。可以通过B-gal染色或者通过在荧光显微镜下观察细胞的GFP的表达情况来确定可达到100%感染效率但又不会引起细胞表型变化病毒浓度范围。 我们已经针对多种细胞系做了预实验，加入已混合病毒的培养基，6-8小时或者过夜。对于大多数细胞系来说病毒浓度在2 x 105 - 1 x 106 IFU/PFU (infectious unit)/ml培养基都能得到10%的感染效率而且不会有副作用。我们推荐在您实验系统中用报告基因病毒重新摸索一下最适培养基用量。 返回 Q4.感染腺病毒时所需要的培养基的量？ 答：作为参考，我们推荐您按照如下的量加培养基（已混入病毒）： 10cm培养皿：8-10ml/孔6孔板：1ml/孔12孔板：0.5ml/孔24孔板：0.2ml/孔 返回 Q5. VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？ 答：VP(Viral particles) 反映病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒），由于在病毒制备过程中，每次活/死病毒比率都不同，VP并不能反映有活性的病毒的数量。 PFU（plaque formation unit）代表可感染的或者活病毒的数量。能反映实验中所需要的病毒的量。 IFU（infectious unit）相当于PFU 大多数情况下所制备的病毒，VP/PFU比值在20:1到50:1范围。 应用VP（viral particles）做单位会与实际应用的活病毒的数量有很大出入。用IFU或者PFU做单位会得到比较一致的结果。 返回
脊髓灰质炎疫苗
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/2216640484.html, 脊髓灰质炎疫苗 作者：邱五七 来源：《大众健康》2002年第09期 脊髓灰质炎就是人们常说的小儿麻痹症，是继天花之后又一种在全球即将消灭的传染病。本病多发于婴幼儿，主要在五岁以下的儿童中传播。 脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的急性传染病。病毒侵入人体后，在咽和肠壁生长繁殖。此病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，均可以引起脊髓灰质炎的发病和流行，其中Ⅰ型最为多见。该病毒在人体外生活力很强，污水及粪便中可存活4～6个月，低温下可长期存活，但对高温及干燥甚敏感，煮沸立即死亡。 此病一年四季均可发生，但以夏秋季为多，世界各国都有发病。肠道传播是本病的主要传播途径。易感者可通过与患者及带毒者（携带脊髓灰质炎病毒但未患病）的密切生活接触被传染，如接触了被患者粪便污染的水、食物、双手、玩具、衣物等，再经口传染。在发病的早期，也可经飞沫传播。 人对脊髓灰质炎病毒普遍易感，感染后绝大部分表现为隐性感染，临床上无任何症状，一部分人可以发热、咽痛、乏力或恶心、腹泻等类似感冒样症状；有少数感染者因病毒毒力强或机体抵抗力低，导致肌肉特别是肢体肌肉发生不对称弛缓性麻痹。个别重症病例病变累及脑干或大脑，危及生命。此病麻痹后最初6个月恢复较快，1～2年内可有不断的改进。若长期肌 力不能恢复，则可能留下肌肉萎缩、肢体畸形等后遗症。 预防此病的最有效的方法是脊髓灰质炎疫苗的预防接种。接种方法为口服脊髓灰质炎疫苗。我国现在使用的疫苗均为三价（含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）疫苗，糖丸剂型每剂1丸，液体剂型每剂2滴。由于脊髓灰质炎发病主要在婴幼儿，故服用疫苗对象主要为5岁以下的儿童。常规免疫接种2月龄开始服用，连续服用3剂三价疫苗，每次至少间隔4周；4周岁时加强免疫1次；部分地区根据当地的实际情况，1.5周岁时加强免疫1次。强化免疫是指在一个相当大的范围内（全国、一个省或一个省的一部分）、在同一时间内，对规定年龄组人群不管是否有服苗史一律投服疫苗。应急免疫主要针对一些常规免疫工作薄弱地区。这些地区一旦发生可疑脊髓灰质炎病例，可迅速在一个大的范围内（一个县及其邻近地区），对特定人群进行免疫。婴幼儿服用脊灰疫苗后只有极少数发生一过性腹泻，可不治自愈。该疫苗只供口服，切勿加在热开水或热的食物内服用。凡发热、腹泻（一日大便>4次）、患急性传染病期间、妊娠期间或有免疫缺陷症或在接受免疫抑制剂治疗期间者均禁止使用。对牛乳及牛乳制品过敏者禁服糖丸剂型疫苗，可服液体疫苗。 我国对脊髓灰质炎的预防接种非常重视，国家领导、卫生部长、各级领导亲自到街道、基层给幼儿喂服脊髓灰质炎糖丸，提高了幼儿对脊髓灰质炎的免疫力。此外，对于此病的预防应
生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法.doc
生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法 (一)制备工艺流程 （1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺 | |猴肾细胞培养 | ←接种病毒（测0%正常细胞对照） | 收获病毒，合并，加MgCl2→ | | 无菌试验→ | ←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40） | B病毒检查（兔肾细胞）→ | ←病毒效价滴定 | |←合并，过滤加MgCl2 | | ←无菌试验 | 分亚批→ | ←柯萨奇病毒检查（乳鼠） | 病毒滴定→ | ←型特异性检查 | B病毒复检（家兔）→ | ←T特征试验 | 分装病毒滴定→ | ←猴体残余致麻痹力试验 | （安全试验）病理切片 | 结核杆菌检查→ | | 分装→ | ←无菌试验 | 病毒滴定→ | → 保存于-20℃待检定合格后 加工糖丸 2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺 地鼠肾 剪碎，胰酶消化
地鼠肾细胞悬液 37℃,3天细胞培养液，pH7.0～pH7.2 单层细胞 洗涤细胞，去除牛血清 10-4～10-5浓度病毒感染细胞 32～34℃培养2～3天 收获病毒液（收二次） 按1:2000加入甲醛 22℃，8天 灭活病毒液 合并，安全及效力试验 原液 加入亚硫酸氨钠 半成品 分装 成品 检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验， 防腐剂、试剂及残余牛血清含量等） 合格成品 (二)生产方法： 病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。 1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺 作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6 Log TCID50/m L，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。 ①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。 ②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。 微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，
第3章病毒习题
第三章病毒习题 填空题： 1．病毒的存在范围是病毒能够感染并在其中复制的___宿主种类和组织细胞种类___。 2．从原核生物中分离的病毒统称噬菌体，它们包括___噬菌体___、___噬蓝(绿)藻体___和___支原体噬菌体___等。 3．病毒属名的词尾是___virus___、科名的词尾是___viridae___、亚科名的词尾是___virinae___，目名的词尾是___virales___。 4．纯化的病毒制备物应保持其___感染性___和___理化性质的均一性___。 5．血凝抑制试验是根据特异性的病毒抗体与病毒表面蛋白作用可能抑制___病毒的血细胞凝集___性质设计的。 6．螺旋对称病毒体的直径是由___蛋白质亚基的大小___决定的，而其长度则是由___病毒核酸分子的长度___所决定的。 7．病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为___结构蛋白___和___非结构蛋白___两类。 8．病毒包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过___β-N-糖苷键___将糖链的___N-乙酰葡萄糖胺___与肽链的___天冬酰胺残基___—连接形成。 9．由一步生长曲线可获得病毒繁殖的两个特征性数据，即潜伏期和裂解量。前者为___病毒吸附于细胞到子代病毒释放___所需的最短的时间，后者为___每个受染细胞释放的子代病毒___的平均数目。 10．病毒的复制过程依其发生事件顺序分为以下___吸附___、___侵入___、___脱壳___、___病毒大分子合成___和___装配与释放___5个阶段。 11．动物病毒进入细胞的方式包括___移位___、___内吞___、___病毒包膜与细胞质膜融合___、___依赖抗体的增强作用___等。 12．动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录要经过包括___5’末端加帽___、___3’末端聚腺苷化___、___甲基化___和___拼接___等修饰才能成熟为功能性mRNA。 13．病毒的非增殖性感染有___流产感染___、___限制性感染___和___潜伏感染___3种类型。 14．流产感染的发生或是由于病毒感染的细胞是___非允许细胞___或是由于感染的病毒是___缺损病毒___。 15．有生物活性的缺损病毒包括___干扰缺损病毒___、___卫星病毒___、___条件缺损病毒___和___整合的病毒基因组___4类。 16．溶源性转变是指原噬菌体所引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表型的改变，包括___细胞表面性质的改变___和___致病性转变___。 17．根据病毒感染机体所引起症状的明显程度，可分为___显性感染___和___隐性感染___o 18．毒力是特定的病毒___致病性的强弱___，它是___病毒株___的特征。 19．亚病毒包括___类病毒___、___卫星病毒___、___卫星RNA ___和___朊病毒___。 20．动物病毒感染抑制宿主细胞DNA复制的原因是___为病毒DNA合成提供前体___、___为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和／或复制蛋白___和___细胞蛋白质合成被抑制的次级效应___。 选择题（4个答案选一）： 1．病毒显著区别于其他生物的特征是( (2) )。 (1)具有感染性 (2)独特的繁殖方式 (3)体积微小 (4)细胞内寄生 2．病毒纯化方法均是根据病毒的基本理化性质建立的，包括( (2) )。 (1)病毒的核酸是DNA或是RNA (2)病毒的主要化学组成是蛋白质 (3)病毒含有脂类和糖类 (4)病毒体积微小 3．病毒物理颗粒计数方法测定的是( (3) )。 (1)有活力的病毒数量 (2)无活力的病毒数量 (3)有活力的病毒与无活力病毒数量的总和 (4)致病性的病毒数量 4．描述螺旋对称壳体特征的参数有( (2) )。 (1)核酸的相对分子质量 (2)螺旋长度与直径 (3)螺旋的外观 (4)蛋白质亚基大小 5．ssRNA能够按照它的极性或意义分为( (2) )。 (1)感染性核酸和非感性核酸 (2)正链RNA、负链RNA和双意RNA (3)反意RNA和正意RNA (4)基因组RNA 和非基因组RNA 6．以下病毒中在细胞核内复制的有( (1) )。 (1)腺病毒 (2)痘病毒 (3)小RNA病毒 (4)嗜肝DNA病毒 7．T4噬菌体的的装配包括的亚装配过程有( (3) )。 (1)2个 (2)3个 (3)4个 (4)5个 8．构成机体病毒感染的因素包括( (2) )。
脊髓灰质炎疫苗常识
脊髓灰质炎疫苗常识 【导读】脊髓灰质炎疫苗剂型有糖丸、液体、糖浆和胶囊4种剂型。常见的有糖丸和液体疫苗，但以糖丸疫苗应用最为广泛。每剂疫苗中都含有脊髓灰质炎疫苗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型减毒活病毒抗原。 脊髓灰质炎活疫苗是由人工进行组织培养而制成，它作为脊髓灰质炎的自动免疫剂，服后血液中产生抗体，在肠道组织也产生局部抵抗力。第一个成功的脊髓灰质炎疫苗出现在1953年。 在小儿麻痹症全国基金会的支持下，索尔克医生（Dr. Jonas Salk）在实验室里成功地培育出了全部三种脊髓灰质炎毒株。索尔克把病毒杀死制成疫苗，并于1952年在患脊髓灰质炎康复的儿童身上进行了实验，结果被实验者血液中脊髓灰质炎抗体增加了。接着，索尔克在自己、妻子和孩子身上进行了接种实验，结果他们体内出现了相应的抗体，并且没有患上脊髓灰质炎。 1954年，美国有200万儿童接受了索尔克的疫苗实验，结果表明这种疫苗保护儿童免受脊髓灰质炎侵害的有效率在80%到90%左右。随后，这种所谓的灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）成为了对脊髓灰质炎标准的预防手段。
索尔克的疫苗效果很好，但还不是足够好，它还不能有效阻断病毒的传播。1950年代，辛辛那提大学的萨宾（Albert Sabin）同样也在小儿麻痹症全国基金会的支持下进行疫苗的研究。与索尔克的疫苗不同，萨宾把脊髓灰质炎病毒在猴子的肾脏细胞中一代又一代的培养，直到筛选出不能致病的毒株。得到的疫苗称为口服（减毒）脊髓灰质炎疫苗（OPV）。 1960年代，萨宾的疫苗得到了许可证。这种疫苗采用口服滴剂的形式，比索尔克的疫苗的针剂注射方式简单，并且能够有效阻断病毒在人群中的传播，它很快取代了索尔克的疫苗，成为了预防脊髓灰质炎的主要手段。 脊髓灰质炎疫苗的剂型有哪些？ 脊髓灰质炎疫苗剂型有糖丸、液体、糖浆和胶囊4种剂型。常见的有糖丸和液体疫苗，但以糖丸疫苗应用最为广泛。每剂疫苗中都含有脊髓灰质炎疫苗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型减毒活病毒抗原。 脊髓灰质炎疫苗的接种对象有哪些？ 主要是小于5岁的儿童、新生儿出生后即可服用。 脊髓灰质炎疫苗为什么要连续服3次？ 在初次免疫脊髓灰质炎疫苗时，2月龄，3月龄和4月龄各服1次，连服3次是因为每剂疫苗中都含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒，尽管在制造的过程中，三个型之间的病毒量配比已考虑到它们在肠道中的竞争感染能力，但仍存在着一定的型间的干扰作用。尤其是Ⅱ型对Ⅰ、Ⅲ型的干扰作用更为明显。所以在服用3次TOPV后，中和抗体阳转率和抗体滴度才能达到满意的效果。 脊髓灰质炎疫苗接种后有什么反应？ 服用脊髓灰质炎糖丸疫苗后一般无任何不良反应，它是一种非常安全、有效的疫苗。但极个别儿童服用可能出现发热、呕吐、皮疹或轻度腹泻等反应。一般持续时间都很短，症状便可消失。
病毒载体
基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件： 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 2、介导外源基因的转移和表达； 3、对机体不致病。 然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。 基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。 然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型： 重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。
病毒性肝炎
病毒性肝炎题库 一、单选题 3、对HBeAg阳性母亲生下的新生儿预防处理，最好的方法是:（D） A·丙种球蛋白 B·乙肝疫苗C·高效价乙肝免疫球蛋白 D·乙肝疫苗十高效价乙肝免疫球蛋白 E·乙肝疫苗十丙种球蛋白 4、某医务工作者在给一HbeAg阳性患者采血时，不小心刺破手指，下列哪项处理最 为重要:（D） A·立即酒精消毒 B·接种乙肝疫苗 C·肌注高效价乙肝免疫球蛋白 D·肌注高效价乙肝免疫球蛋白，接种乙肝疫苗 E·定期复查肝功能和HBV-IgM 5、当患者血清中只有抗-HBs、抗-HBc、抗-HBe阳性时应考虑:（D） A·急性乙型肝炎 B·慢性乙型肝炎 C·重型肝炎 D·急性乙型肝炎恢复期 E·乙肝病毒慢性携带者 6、关于HBV-DNA的描述哪项是正确的:（D） A·HBV-DNA是单链环状DNA B·HBV-DNA是双链线状DNA C·游离型HBV-DNA是指血清中除HBV颗粒以外形式存在的游离HBV-DNA D·整合到肝细胞基因组中的HBV-DNA称整合型HBV-DNA E·和HBsAg一样，HBV-DNA阳性只代表有HBV感染，与病毒的复制无关7、有关HAV感染与基因变异的概念，哪项是错误的:（B） A·HAV可分为4个基因型 B·与基因型相对应也有4个血清型 C·HAV感染后可刺激抗体产生特异性IgM和IgG抗体 D·IgM抗体仅存在于感染后6个月之内是近期感染标志 E·IgG抗体可保存多年，是过去感染的标志 10、下述哪项不是HBV的结构成分:（C） A·HbsAg B·HbcAg C·HbeAg D·HBV-DNA E·HBV-DNAp 11、HBV X区基因可编码的抗原是:（D） A·HbsAg B·HbcAg C·HbeAg D·HbxAg E·HBV-DNAp 12、HBV感染最早出现的血清学标志物是:（A） A·HbsAg B·抗-HBs C·HbeAg D·抗-Hbe E·抗-HBc 13、针对HBV的特异性抗体申具有免疫保护作用的抗体是:（A） A·抗HBs B·抗HBc C·抗Hbe D·抗HBx E·抗PreS 1 14、代表HBV复制的血清学指标是:（C） A·抗HBs B·抗Hbe C·HbeAg D·HbsAg E·抗PreS 2 15、HBeAg是HBV活动性复制和有传染性的重要标记是因为:（B） A·HBeAg是HBV的核心成分 B·它与DNAp和HBVDNA密切相关 C·仅见于HBsAg时阳性血清中 D·在血清中持续时间较HBsAg为长 E·HBeAg阳性者容易转为慢性 16、下述抗HBe阳性时的临床意义描述错误的是:（E） A·急性自限性肝炎时，与抗HBs同时出现，表现HBV复制减少
腺病毒的制备by王晶晶
腺病毒的制备 简介： 腺病毒(adenovirus)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，基因组长约36kb。基因组上分布着4个早期转录子（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录子负责结构蛋白的编码。其中，E1的缺失可造成病毒在复制阶段的流产，重组腺病毒必须在293细胞等表达E1蛋白的细胞系中包装；E3为复制非必须区，影响病毒的免疫逃逸，其缺失则可以大大地扩大插入容量。 腺病毒在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100％的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞，肺细胞，神经细胞和心脏细胞；容易制得高滴度病毒载体；进入细胞内并不整合到除卵细胞外的宿主细胞基因组中，仅瞬间表达，安全性高。腺病毒载体已成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。 基本概念： RCA： 在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒（replication competent adenoviruses，RCA），RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。这就导致目的基因丢失而被E1区代替。具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株（如A549细胞）上产生病毒的复制和扩增。实验证明，复制型腺病毒(RCA) 数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增，因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。要避免RCA出现，以下两点非常必要： 1）对原始毒种进行1~3轮空斑纯化； 2）尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数，建议建立至少两级病毒种子库。（尤为重要：一旦毒种中发现了RCA，建议重新重组出毒。） 各种常用病毒单位的含义： VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。 IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。 VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。
脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒等相关事件应急处置方案
附件2： 脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒 相关事件应急处置技术方案 为及早发现输入性脊灰野病毒病例和疫苗衍生病毒循环（cVDPVs）病例，迅速采取应急措施阻断病毒的传播和循环，根据《中华人民共和国卫生行业标准-脊髓灰质炎诊断标准》（WS294-2008）、《脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒相关事件应急预案（试行）》、《高危AFP病例和聚集的临床符合病例调查指南》、《全国急性弛缓性麻痹（AFP）病例监测方案》（以下简称《监测方案》）、《甘肃省脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒相关事件应急预案》（以下简称《甘肃省应急预案》），特制定本方案。 一、目的 （一）及时发现脊灰疫苗衍生病毒（VDPVs）、脊灰疫苗衍生病毒循环（cVDPVs）和脊灰野病毒，并迅速采取有效措施，阻断病毒的传播和循环。 （二）规范高危急性弛缓性麻痹（AFP）病例、脊灰临床符合病例以及脊灰疫苗高变异株病例的调查处置。 二、适用范围 本技术方案适用于高危AFP病例、脊灰临床符合病例、VDPVs、cVDPVs和脊灰野病毒的报告、调查和处置工作。 三、脊髓灰质炎疾病概述 （一）病原学
脊灰病毒属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属，按其抗原性不同，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个血清型，型间无交叉免疫。流行病学资料表明，Ⅰ型野病毒引起的传播约占80%～90%，其次为Ⅲ型野病毒，目前世界上已无Ⅱ型野病毒引起的病例。 脊灰病毒在遇热、甲醛、氯和紫外线时迅速失去活力。对乙醚不敏感，对热和干燥甚敏感。使用甲醛、2%碘酊、升汞和各种氧化剂如过氧化氢、漂白粉、高锰酸钾等，均能使其灭活。 （二）流行病学 1.传染源 脊灰的传染源为病人、隐性感染者和病毒携带者。由于病毒携带者、无症状的隐性感染和无麻痹型患者不易被发现，因此在传播该病上起重要作用。本病的潜伏期为2～35天，一般为7～14天。患者自潜伏期末至发病后3～4周都有传染性，发病1～2周排毒率最高，可从70%以上的患者大便中分离出病毒，退热后传染性减小。病毒主要存在于患者的脊髓和脑部，在鼻咽部、肠道粘膜与淋巴结内亦可查到。 2.传播途径 感染者一般通过大便排出病毒，数量多且持续时间长，可达数周至数月；粪—口途径是本病的主要传播途径，在发病的早期咽部排毒可经飞沫传播。
病毒载体的应用
病毒载体的应用 关键词：病毒标准物质标准物质网北京标准物质网 随着病毒载体的发展，病毒载体的应用也越来越广泛，尤其在人类疾病的基因治疗中发挥着重要作用。 1.在肿瘤基因治疗中的应用 根据肿瘤的类型和分布，可采用多种技术来抑制和消除肿瘤细胞。复制缺陷型和条件复制型腺病毒载体已经应用于肿瘤的生物治疗，这主要是通过病毒载体将肿瘤抑制基因、免疫激活基因或凋亡基因导入靶细胞中来实现的。例如腺病毒载体ONYX-015已经应用于多种肿瘤的治疗中，并已经用于Ⅰ期和Ⅱ期临床试验。疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因缺失的病毒载体能够在动物肿瘤模型和肿瘤组织中抑制肿瘤的生长。痘苗病毒载体可以传递很多的肿瘤特异性抗原，并诱导机体产生很强的针对该肿瘤抗原的细胞免疫。 慢病毒介导的RNA干扰、免疫基因的激活也应用于肿瘤的基因治疗中。 2.在疫苗中的应用 腺病毒载体可以迅速刺激机体产生高水平的免疫反应，故常应用于HIVH5N1等病原体疫苗的研制中。如腺病毒载体Ad5就应用于研制HIV疫苗。 美国Merck公司开发的HIV疫苗(MRK Ad5)即采用了Ad5腺病毒载体。虽然Ad5疫苗最终失败，但是为后续的HIV疫苗研制积累了宝贵的经验。现在又开发出了DNA-腺病毒联合免疫的方法，它将腺病毒载体与其他载体联合起来，以实现持久、有效的免疫保护。将外源基因插入疱疹病毒的非必需基因的位置，构建出来的疱疹病毒载体可用于疫苗的研制。HSV最早应用于构建乙肝(HBV)表面抗原的表达，并成功研制出HBV的疫苗。 3.在神经生物学中的应用 疱疹病毒是一种嗜神经性病毒，它在感染外周神经后可逆行进入中枢神经系统，并可建立无细胞毒性的隐性潜伏感染，然后高效、长期地表达外源基因，而不影响神经细胞的功能，所以可利用疱疹病毒载体将外源基因导入中枢和外周神经系统柬治疗神经紊乱和神经疾病。此外，慢病毒载体可以转染非分裂细胞并可以长期表达外源基因。慢病毒载体也被用于神经疾病病理模型的建立，以及表达神经生长因子以促进神经损伤后的修复治疗等。
细菌性疫苗制造技术
细菌性疫苗制造技术 任务一灭活苗的制造流程 菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活 ↓ ↓ 配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ← 浓缩 工序一菌种与种子培养 选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。 工序二菌液的培养 用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。 实例大肠杆菌的菌液培养方法 (1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。 (2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。 (3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。 如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计
病毒性肝炎防治知识归纳总结
病毒性肝炎防治知识归纳总结 一、基本知识 1、什么是病毒性肝炎？ 病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点，肝炎病毒通常分为甲、乙、丙、丁、戊型。以疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分出现黄疸，无症状感染常见。 甲肝和戊肝多为急性发病，预后良好；乙肝和丙肝感染易发生慢性化，危害较大，感染是年龄越小，越容易慢性化；丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 2、我国肝炎现状与挑战 我国是病毒性肝炎的高发地区，发病率高。2010年我国报告病毒性肝炎病例近132万例，死亡884例，位居传染病发病之首，其中乙肝占所有肝炎病例的80%。 2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查结果：1-59岁人群HBsAg 携带率为7.18%，15岁以下儿童HBsAg 携带率为2.08%，与1992年全国病毒性肝炎血清流行病学调查结果相比，我国1～59岁人群HBsAg阳性率下降了2.5百分点，15岁以下儿童下降更明显，下降7～8个百分点。特别是4岁以下儿童携带率已降低0.96%，达到发达国家水平。 根据2006年中国疾病预防控制中心开展的乙肝血清流行病学调查结果估计，全国约有9300万乙肝病毒感染者，每年因该病所致的
直接经济损失至少5000亿人民币。卫生部将乙肝列为重点控制的传染病。 3、肝炎的传播途径 甲肝和戊肝主要经粪-口途径传播，水源或食物被污染可引起暴发流行，也可经日常生活接触传播。 乙肝、丙肝的传播途径包括：血液传播（输血及血制品以及使用污染的注射器或针刺等）；母婴垂直传播；性接触传播。丁肝的传播途径与乙肝相同，但与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 二、病毒性肝炎的预防 1、疫苗是预防乙肝的首选，国家实施新生儿乙肝疫苗预防接种为主的控制策略 接种乙肝疫苗是预防乙肝最安全、有效的措施。全程接种乙肝疫苗后，约80％－95%的人群可产生免疫能力，保护效果可持续20年以上。由于乙肝病毒感染是导致原发性肝癌的主要因素，因此接种乙肝疫苗也可降低原发性肝癌的发生。丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才能发生感染，因而接种乙肝疫苗还可预防丁肝病毒感染。 乙肝疫苗全程免疫需按0，1，6月接种3针。1992年开始实行新生儿乙肝疫苗接种策略，2002年起我国实施新生儿免费接种乙肝疫苗的策略，第1针应在出生24小时内接种，并完成全程接种。2009-2011年，实施对15岁以下人群进行乙肝疫苗查漏补种措施，以