线粒体分离及功能测定
细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚 细胞结构，由核膜、核仁和染色 质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功 分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体 呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿 色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析 ，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器 材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告 ，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环 境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济 的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种 利用连续的密度梯度介 质对细胞进行分离的方 法。
02
在密度梯度离心法中， 细胞悬浮在密度梯度介 质中，然后在离心机中 旋转。
03
由于不同细胞组分的密 度不同，它们在介质中 沉降的速度也不同，从 而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结 构。
线粒体呼吸功能测试方法
线粒体呼吸功能测试方法摘要：一、引言二、线粒体呼吸功能测试方法概述1.线粒体呼吸功能的概念2.线粒体呼吸功能测试的重要性三、线粒体呼吸功能测试方法的分类1.细胞外液方法2.细胞内液方法四、常见线粒体呼吸功能测试实验1.氧消耗实验2.电子传递链活性测定3.丙酮酸脱氢酶活性测定五、实验操作注意事项1.实验环境的控制2.实验材料的准备3.实验过程中的监测六、线粒体呼吸功能测试在疾病研究中的应用1.线粒体呼吸功能与疾病的关系2.线粒体呼吸功能测试在疾病诊断和治疗中的作用七、未来发展趋势与展望1.线粒体呼吸功能测试技术的创新2.跨学科研究与应用八、结论正文：一、引言线粒体是细胞内能量供应的主要场所，线粒体呼吸功能是细胞生存和发展的基础。
线粒体呼吸功能测试是研究细胞能量代谢的重要手段，通过对线粒体呼吸功能的检测，可以深入了解细胞的生理状态和病理变化。
本文将对线粒体呼吸功能测试方法进行综述，以期为相关领域的研究提供参考。
二、线粒体呼吸功能测试方法概述1.线粒体呼吸功能的概念线粒体呼吸功能是指线粒体在氧化磷酸化过程中，通过电子传递链将电子传递给氧，产生能量的过程。
这个过程包括三个阶段：糖酵解、柠檬酸循环和氧化磷酸化。
2.线粒体呼吸功能测试的重要性线粒体呼吸功能测试是评估细胞能量代谢状况的重要指标，对于研究细胞生理、病理生理以及疾病诊断具有重要的意义。
三、线粒体呼吸功能测试方法的分类1.细胞外液方法细胞外液方法主要通过测定细胞培养液中的氧气消耗量、二氧化碳产生量等参数来评估线粒体呼吸功能。
2.细胞内液方法细胞内液方法主要通过测定细胞内氧化还原状态、ATP产量等指标来评估线粒体呼吸功能。
四、常见线粒体呼吸功能测试实验1.氧消耗实验氧消耗实验是通过监测细胞在一定时间内消耗氧气的量来反映线粒体呼吸功能的状况。
2.电子传递链活性测定电子传递链活性测定是通过检测线粒体内膜上电子传递酶的活性来评估线粒体呼吸功能。
3.丙酮酸脱氢酶活性测定丙酮酸脱氢酶是柠檬酸循环的关键酶，其活性可以反映线粒体呼吸功能的状况。
06实验六--细胞器的分离与观察nj
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
实验六细胞器的分离与观察一细胞核的分离与观察二线粒体的分离与观察一实验目的了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术二实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官为了研究各种细胞器的功能首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来
精子线粒体功能检测与男性不育相关性的研究进展
ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２１．０４．１２·生殖检验·精子线粒体功能检测与男性不育相关性的研究进展作者简介：李红林，１９８０年生，男，副主任技师，硕士，主要从事生殖检验研究，Ｅ ｍａｉｌ：ｈａｙｙｌｈｌ＠１６３．ｃｏｍ。
李红林，傅广波，吕述彦（南京医科大学附属淮安第一医院生殖医学中心，江苏淮安２２３３００）摘要：精子线粒体是唯一含有独立基因组的细胞器，通过氧化磷酸化产生的适量活性氧（ＲＯＳ）和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）维持精子活力、获能、顶体反应和ＤＮＡ完整性。
精子线粒体膜电位（ＭＭＰ）水平的变化、ｍｔＤＮＡ突变或缺失均可引起精子能量合成障碍，是临床评估特发性男性不育的重要指标。
该文综述精子线粒体功能检测与男性不育相关性的研究进展。
关键词：精子线粒体；不育；活性氧；线粒体膜电位；线粒体ＤＮＡ中图分类号：Ｒ４４６ 文献标志码：Ａ 不孕不育症指育龄夫妇未采取任何避孕措施，有规律性生活１２个月内女方未获得临床妊娠［１］。
据ＷＨＯ估计全球约有１．９亿人患有不孕不育症［２］，其中约５０％是由男方因素导致的不育症［３］。
临床工作中，男性不育症的筛查和诊断主要是依据精液量、精子浓度、精子活力和精子形态等指标的检验结果［４ ５］，但大约３０％～５０％的特发性男性不育症患者的精液常规检验指标却完全正常［６］。
线粒体是唯一含有独立基因组的细胞器，通过氧化磷酸化产生的适量活性氧（ＲＯＳ）和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）维持精子活力、获能、顶体反应和ＤＮＡ完整性［７］。
精子线粒体损伤会引发能量合成障碍，导致精子质量和功能下降、甚至消失。
现对近年来应用精子线粒体分子结构和功能检验指标评估男性生育力的研究进展作一综述，为男性不育症发病机制的研究以及精子线粒体功能检测指标的临床应用提供参考。
１ 精子线粒体功能与ＲＯＳ精子细胞中线粒体数超过１０３个／细胞。
精子发育成熟过程中，随着其他细胞器和细胞质的消失，线粒体的数量和结构也发生显著变化，当精卵结合形成受精卵时，精子线粒体会通过自噬途径被完全降解清除［８］。
差速离心分离线粒体
差速离心法分离线粒体课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)6．转移上清液至新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
细胞生物学实验叶绿体和线粒体的分离
叶绿体和线粒体的分离及活体染色
实验步骤（叶绿体部分）
叶绿体悬浮液： 1，选取鲜嫩的菠菜叶，清洗后除去叶梗及粗的叶脉，称适量叶子放于研钵中，加 入5ml 0.35M氯化钠溶液，研磨制成匀浆液。 2，将匀浆液通过6层纱布过滤到烧杯中。 3，取4 ml滤液在1000 rpm 4℃下离心2 min。弃去沉淀。 4，将上清在3000 rpm 4℃下离心5 min，弃去上清液，所得到的沉淀就是叶绿体。 5，沉淀用适量的氯化钠溶液重新悬浮。 6，滴此悬液在载玻片上，在普通显微镜和荧光显微镜下观察，再取一份滴加0.01 ％吖啶橙染色后放于荧光显微镜下观察。
叶绿体和线粒体的分离及活体染色
实验原理：
1、 差速离心（适用于不同沉降速度的颗粒分批分离） 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在
不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法。 一个颗粒在一个固定离心力的作用下的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密
度，也同悬浮颗粒介质的粘稠度有关。 当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大
徒手切片： 将菠菜叶置于载玻片上，加上2滴0.35 M氯化钠溶液，用手术刀片与水平方向
成30度角将菠菜叶切削成一个斜面（尽可能选择较薄的部分切），用盖玻片轻轻 压平后在显微镜下观察边缘部分。
滴加吖啶橙染色染色2分钟，洗去余液，加盖盖玻片后用荧光显微镜观察。
叶绿体和线粒体的分离及活体染色
实验结果（叶绿体部分）
和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上转速下再进行离心，又得到第二部分较大、 较重颗粒的“沉淀”及含较小和较轻颗粒的“上清液”，如此多次离心处理，即能 把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心 （2—3次），才能得到较纯颗粒。
细胞质内线粒体dna测量方法
细胞质内线粒体dna测量方法
细胞质内线粒体DNA的测量方法主要包括以下步骤：
1. 细胞中线粒体DNA的分离：采用适当的细胞分离技术将线粒体从细胞质中分离出来。
2. DNA扩增：采用聚合酶链式反应（PCR）技术对线粒体DNA进行扩增，以获得足够的DNA进行后续分析。
3. DNA序列分析：对扩增后的线粒体DNA进行序列分析，以确定基因序
列和突变的存在性及其相对频率。
4. 参考序列比对：将测得的线粒体DNA序列与已知的参考序列进行比对，以确定两者之间的差异。
5. 突变位点确定：通过比对结果，确定线粒体基因组中基因序列和突变的存在性及其相对频率，以及位点突变。
通过以上步骤，可以对细胞质内线粒体DNA进行测量和分析，以了解其在生物学和医学研究中的意义和应用。
线粒体的分离与鉴
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• 三、实验材料 • (一) 材料 猪肝 • （二）器材 冷冻高速离心机、解剖刀剪、 小烧杯、冰浴、漏斗、匀浆器等。 • （三）试剂 • 1.0.9%灭菌的生理盐水。 • 2. 1%詹纳斯绿 B 染液。 • 3. 0.25mol/L 蔗糖缓冲液 • 4. 0.34mol/L 蔗糖缓冲液 • 5.固定液：甲醇：冰醋酸(9：1) • 6.姬姆萨染液
• 六、注意事项
• 1. 注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分的生理活性。 最好在在 0～4℃或冰浴中进行。
• 2. 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加 入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下 沉过快，影响后面的离心分层效果。 • 3. 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果 较好。
• 七、作业
• 1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在 0～4℃ 进行？
• 2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查 是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒 体的纯度。要获得高活性的线粒体，在线粒体提 取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？ 根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方 法。
• 四、实验操作 • 1. 制备肝细胞匀浆： • 称取肝组织 20g，剪碎，用预冷到 0～ 4℃的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液洗涤数次。 然后在 0～4℃条件下，按每克肝加 5ml 冷 的0.25mol/L 蔗糖缓冲溶液将肝组织匀浆化， 蔗糖溶液应分数次添加。匀浆液用 两层纱 布过滤备用。
• 2. 离心：先将 5ml 0.34mol/L 缓冲蔗糖溶
• •
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依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗 粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而 分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次 是线粒体。
线粒体提取
二.植物线粒体的制备 1.原理
ATP
2.制备方法 差速分离法
用500-2000×g短时间(约10min)离心 以去除沉淀的细胞碎片 等固体物质保留上清液
将上清液在11 000—20 000×g 下离心，以沉淀线粒体。
沉淀线粒体
3.材料 本次使用绿豆芽。植物的各个部分都可用
来制备线粒体，但应该避免那些组织坚实、细 胞壁老化及含叶绿体的材料。最好采用黄化幼 苗或贮藏组织。用作制备线粒体的材料应该是 新鲜、生长势旺盛。
介质中，常含有： ① 0.25-0.4mol/L蔗糖或甘露醇，使与细胞溶液成等渗的； ② 50mmol/L的pH7-8缓冲液（通常用tris),以中和酸性的
细胞内含物； ③ 巯基化合物如10mmol/L的二硫苏糖醇或巯基乙醇，以
减少在活性中心具有半胱氨酸残基的酶因氧化而失活； ④10mmol/L浓度Mg2+,以阻止细胞质和细胞器中核蛋白体
（2）线粒体悬浮液蛋白含量测定 取两支试管，准确加入0.1ml线粒体悬浮液，0.9ml蒸 馏 水 ， 5ml 考 马 斯 亮 蓝 G-250 ， 摇 匀 ， 放 2min ， 于 595nm下比色。
（3）结果计算 根据所测吸光度，在标准曲线上查相应的蛋白质含 量，即为0.1ml线粒体悬浮液中蛋白质g数，再转变为 mg数即可。
0-4℃（2—4 ℃）以减少 自溶变化。这些变化是由 于把正常区隔开来的酶和 底物混合到一起的结果。
匀浆液用4层纱布过滤
残渣 弃 （部分未破碎的组分）
上清液 12000g 离心15min
上清液 弃
加3ml悬浮液，悬浮线粒体
滤液 3000g 离心10min
沉淀 弃
（细胞碎片、细胞核等） 沉淀 留 （线粒体）
细胞线粒体分离
细胞线粒体分离在进行细胞线粒体分离实验时，确保实验步骤的准确性和实验环境的无菌性是至关重要的。
以下是一个基本的线粒体分离流程，以及一些重要的注意事项。
实验材料：1. 新鲜的组织或细胞样品2. 预冷的线粒体缓冲液（MB）3. 预冷的分离介质（例如Percoll或Nycodenz）4. 离心管和离心机5. 显微镜和细胞计数器实验步骤：1. 收集新鲜的组织或细胞样品，并用预冷的MB缓冲液冲洗以去除任何残留物。
2. 将组织或细胞样品放入离心管中，并加入足够的预冷MB缓冲液以覆盖样品。
3. 用锋利的刀片将组织或细胞样品切成小块，然后使用研磨器将其研磨成匀浆。
4. 将匀浆通过纱布或棉签过滤，以去除大的颗粒和细胞残骸。
5. 将过滤后的匀浆转移到离心管中，并加入足够的预冷分离介质。
6. 以适当的离心速度离心样品，以分离出线粒体。
7. 使用显微镜和细胞计数器对离心后的样品进行观察和计数，以确保获得了足够的线粒体数量。
8. 将分离出的线粒体用于后续的实验或保存以备后用。
注意事项：1. 在整个实验过程中，要确保使用的所有溶液都是预冷的，以避免线粒体的热损伤。
2. 在切割、研磨和过滤组织样品时，要尽量减少对线粒体的机械损伤。
3. 离心速度和时间要根据实验条件进行调整，以确保最佳的线粒体分离效果。
4. 在使用显微镜和细胞计数器进行观察和计数时，要确保样品的代表性，并避免误差的产生。
5. 实验过程中要避免污染，包括对溶液、器具和操作者的污染。
所有使用的器具都应经过消毒处理，并在无菌环境下操作。
6. 线粒体是细胞内的亚细胞结构，其功能与细胞的能量代谢密切相关。
因此，线粒体分离实验的结果可以反映细胞的生理状态，对于研究细胞的能量代谢、疾病机制等方面具有重要的意义。
7. 线粒体分离实验的难度较大，需要操作者具备较高的实验技能和经验。
因此，在进行实验前，应充分了解实验原理、熟悉操作流程，并严格按照实验步骤进行操作。
8. 在实验过程中，应注意安全问题。
实验五 线粒体的分离与观察
离心技术概述
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受 到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离 技术。
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到 一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相 当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
离心力g＝1.11×10-5n2r
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速（
r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。 离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心
（一）差速离心
（differential centrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离 不同大小的细胞和细胞器。
实验五 线粒体的分离与观察
一、实验目的
1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。
(1)匀浆(Homogenization)低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质( 即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离 心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉 淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和 密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整 个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉 淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.
线粒体的主要功能
线粒体的主要功能线粒体的主要功能：能量转化；三羧酸循环；氧化磷酸化；储存钙离子；除了合成ATP 为细胞提供能量等主要功能外，线粒体还承担了许多其他生理功能。
什么是线粒体线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为“powerhouse”。
其直径在0.5到1.0微米左右。
除了溶组织内阿米巴、篮氏贾第鞭毛虫以及几种微孢子虫外，大多数真核细胞或多或少都拥有线粒体，但它们各自拥有的线粒体在大小、数量及外观等方面上都有所不同。
线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。
除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
线粒体的主要功能是什么1、能量转化线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。
线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化，分别对应有氧呼吸的第二、三阶段。
2、三羧酸循环糖酵解中生成的每分子丙酮酸会被主动运输转运穿过线粒体膜。
进入线粒体基质后，丙酮酸会被氧化，并与辅酶A结合生成CO2、还原型辅酶Ⅰ和乙酰辅酶A。
3、氧化磷酸化NADH和FADH2等具有还原性的分子（在细胞质基质中的还原当量可从由逆向转运蛋白构成的苹果酸-天冬氨酸穿梭系统或通过磷酸甘油穿梭作用进入电子传递链）在电子传递链里面经过几步反应最终将氧气还原并释放能量，其中一部分能量用于生成ATP，其余则作为热能散失。
4、储存钙离子线粒体可以储存钙离子，可以和内质网、细胞外基质等结构协同作用，从而控制细胞中的钙离子浓度的动态平衡。
线粒体迅速吸收钙离子的能力使其成为细胞中钙离子的缓冲区。
线粒体是如何增值的线粒体的增殖是通过已有的线粒体的分裂，有以下几种形式：1、间壁分离，分裂时先由内膜向中心皱褶，将线粒体分类两个，常见于鼠肝和植物产生组织中。
大鼠肝线粒体的分离
一.实验目的用差速离心法分离动物细胞线粒体。
二.实验原理线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，是能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次在分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。
三.大鼠肝线粒体的分离实验用品(一)、材料大鼠肝脏(二)、试剂1．生理盐水。
2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
3．0．25mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7．4)：0．1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10ml；0．1 mol/L盐酸 8．4ml；加重蒸水到 100ml；加蔗糖到0.25 mol/L。
蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖4．0．34mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7．4)；5．固定液：甲醇-冰醋酸(9：1)6．姬姆萨染液：Giemsa粉0．5g，甘油33ml，纯甲醇33ml。
实验六细胞器的分离与观察
0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、
甲基绿
Байду номын сангаас
-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离
（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹 部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组 织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。 匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的 蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相， 在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能， 保持酶的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
D 10000g x20min
E 105000g x120min
（2）离心：低温离心机中进行。 每次离心前 一定要在天平（托盘天平）上将两离心管配平。 第一次以600g离心10min。将其上清夜移入 Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待 后面使用(分离线粒体)。沉淀使用1ml预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次 1000g离心10min。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速
（r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。
离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离 心
实验二 鼠肝细胞核及线粒体提取和显微观察
实验二线粒体差速离心法分离技术细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心方法，可将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)是在低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取。
[实验要求]1．了解并掌握差速离心法分离技术及原理。
2．熟悉线粒体的Janus green B染色方法，并做出分析。
[实验原理]差速分离由低速到高速离心使细胞内各种组分逐渐沉降。
先用低速离心使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心才能不断纯化。
詹纳斯绿(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜。
詹纳斯绿解离后带有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上。
内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色。
詹纳斯绿B也可对活细胞进行染色，在显微镜下可观察到细胞内的线粒体因具有细胞色素氧化酶系统，它可使染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在细胞质中的染料被还原呈无色。
线粒体质量检测流程
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以下是一般的线粒体质量检测流程：1. 样本采集根据研究目的和实验设计，选择合适的样本类型，如细胞、组织或体液。
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组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）：
Components Final concentration
Tris-HCl 50mM pH7.4
NaCl 150mM
EDTA 2mM
EGTA 2mM
Triton X-100 0.2%
NP-40 0.3%
PMSF 100uM
NaVO3 1mM
NaF 250mM
Leupeptin 10ug/ml
Aprotinin 2ug/ml
DTT 1mM
组织线粒体的分离
1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓
冲液中，
2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分，
3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎，
4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次，
5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中，
6) 重复上面步骤一次，
7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体，
8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次，
9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours），
10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。
分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法)
低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration
Hepes(KOH) 20mM pH7.2
Sucrose 210mM
Mannitol 70mM
EDTA 1mM
EGTA 1mM
MgCl2 1.5mM
KCl 10mM
DTT 1mM
（注：用前加入蛋白抑制剂混合物，包括100uM PMSF 等）
收获细胞，PBS 洗一次，转入 1.5ml 管中，加入适量低渗缓冲液，冰上浸
泡约1hour, 并不时混匀。
然后用Dounce 匀浆器手工匀浆，其间用台盼蓝检查细胞活性状况，至细胞破碎50%左右停止匀浆。
3000 rpm（约1000g）4℃离心10min,转移上清至新管中，继续12,000 rpm 离心15min，沉淀即为细胞线粒体。
用提取缓冲液清洗一次，80℃冻存备用或直接裂解
线粒体体外功能分析
（1）线粒体耗氧测定：
a) 测定介质（Measuring buffer）：225mM 甘露醇，70mM 蔗糖，1mM EDTA，
0.1% BSA，10mM 磷酸钾缓冲液，pH7.4 。
b) 测定步骤：
1) 预热生物测氧仪并调节氧电极至需体积（2ml），测定温度为25℃。
2) 在反应槽中加入2ml 纯水，使仪器稳定8～10mins，调节仪器最大相对氧浓
度，然后加入少许保险粉，耗尽水溶液中的氧，调节仪器氧零值。
3) 清洗反应槽，然后加入反应介质，开始测定。
介质体积＝反应总体积（2ml）－组织线粒体悬浮液体积。
4) 加入提取的线粒体悬液（一般组织线粒体约60ul，终浓度1mg/ml），记录一段
时间基线后加入外源底物琥珀酸（2.5mM），出现IV 态呼吸，记录约两分钟后，加入ADP（100mM）3ul，出现III 态呼吸，待ADP 完全消耗后线粒体
又恢复到IV态呼吸。
5) 线粒体呼吸控制率（Respiratory Control Rate, RCR），即加入ADP 时（III 态）
的呼吸速率与ADP 耗竭后（IV 态）的呼吸速率之比，RCR 反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。
线粒体膜电位和ROS产生的测定：
a) 测定介质（PT-1 buffer）：250 mM 蔗糖，10 mM Hepes pH7.4，0.5mM KH2PO4，
2uM 鱼藤酮和4.2mM 琥珀酸钾。
b) 测定方法：在石英杯中加入3ml 反应介质，加入线粒体悬液（终浓度
0.5mg/ml），然后加入罗丹明123（终浓度30nM），混匀后，于25℃孵育5min 后，
开始实时监测荧光强度变化（激发波长520nm,发射波长527nm）。
最后在反应体
系中加入mCCCP (终浓度1uM)，以达到完全解偶联，使线粒体膜电位完全丧失，
记录荧光强度的变化。
该荧光强度变化反应线粒体膜电位的高低。
测定线粒体ROS 产生与测定膜电位的体系基本一致，不同是加入的荧光探针是CM-H2DCF （终浓度500nM），混匀后，同样孵育5min，开始实时检测荧光强度变化（激发
波长500nm，发射波长520nm）。
最后在反应体系中加入antimycin A(终浓度50uM)
作为最大量ROS产生的对照。
曲线的斜率即代表线粒体ROS产生的速率。
组织ATP 水平的测定
按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：
1) 取小块组织（约50～100mg）放入玻璃匀浆器中，加入适当比例的裂解液（lysis buffer），冰浴充分匀浆以确保组织完全裂解；
2) 裂解后，12,000 rpm 4℃离心10min，取上清，考蓝定量蛋白浓度，用于后续
测定；
3) 取适当量的ATP 检测试剂，按照1：100 的比例用ATP 检测稀释液稀释ATP
检测试剂，配成ATP 检测工作液，冰浴暂时保存；
4) 加100ul ATP检测工作液到检测孔中（96 孔板），室温放置3～5min，以使本
底的ATP 全部被消耗掉；
5) 在检测孔中加上10～100ul 样品或标准品，迅速用移液器混匀，至少间隔2s
后，立即用luminometer 测定；
6) 根据标准曲线计算出样品中的ATP浓度，并换算成nmol/mg蛋白的形式。
7) 标注曲线用已知浓度的ATP标准溶液按同样方法进行测定和建立。