分子标记
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
遗传学中的分子标记技术
遗传学中的分子标记技术遗传学是研究遗传现象的一门学科，而分子标记技术则是其中的一个重要领域。
它不仅可以帮助我们研究物种间的遗传联系，还可以应用于医学和农业领域，为人们的生活带来更多便利和进步。
本文将介绍遗传学中的分子标记技术，探讨其在实践中的应用以及未来的发展方向。
一、分子标记技术简介分子标记技术是利用分子水平的遗传标记对个体、品系或群体进行鉴别、分类、分子配对等分析的一种技术。
目前常用的几种分子标记技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、序列标记位点（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）等。
RFLP技术是一种基于DNA序列限制性切割位点的分析方法。
通过将基因组DNA切成不同的长度片段，然后对这些片段进行电泳分离，最后通过DNA探针的帮助确定特定位点的DNA序列。
RAPD技术则是一种无需事先知道DNA序列的技术，通过使用随机序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，经过电泳分离后可以得到特定长度的DNA条带。
SSR技术则是利用序列中重复核苷酸序列的多态性，选取特定的序列扩增后进行电泳分离，得到条带后可以确定所研究物种基因组的遗传变异情况。
SNP技术则是一种最新的分子标记技术，它是基于单核苷酸变异位点的方法，通过测量单个碱基的点突变来分析遗传多样性。
二、分子标记技术的应用1.遗传分析分子标记技术在遗传学研究中可以用于基因型鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评估等方面。
例如，利用SSR技术可以分析豆科作物的遗传多样性，帮助育种学家定位有用的基因，并加速豆科作物的育种进程。
另外，RFLP技术还可以用于协助医学领域的DNA指纹分析，对于识别罪犯身份、证明亲子关系等方面都有巨大贡献。
2.病理学研究在病理学研究中，分子标记技术可以用于检测各种疾病的基因突变、表达谱的差异、重要调节基因的变化等。
例如，SNP技术可以用于筛查患有代谢性疾病的患者，SSR技术可以用于评价肿瘤的恶性程度。
3.农业领域分子标记技术在农业领域中的应用越来越普遍，可以用于作物品种鉴别、繁殖方式分析、作物改良等方面。
分子标记
DNA分子标记 分子标记
是指能反映基因组某种变异特征的DNA片段。 片段。 是指能反映基因组某种变异特征的 片段
因为生物各种性状的差异主要是遗传物质DNA的差异造成， 的差异造成， 因为生物各种性状的差异主要是遗传物质 的差异造成 因而通过DNA分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异， 因而通过 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异 更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体 更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、 的差异。
分子标记是指能反映生物个体多态性的生物 大分子。 大分子。
广义的分子标记包括两类， 广义的分子标记包括两类，即：同工酶标记和 DNA标记，狭义的分子标记仅指 标记， 标记。 标记 狭义的分子标记仅指DNA标记。 标记
同工酶标记
编也有其内在的局限性。 同工酶标记也有其内在的局限性。由于翻译后的 修饰作用、组织特异性和发育阶段性， 修饰作用、组织特异性和发育阶段性，特别是相 对较少的多态性位点， 对较少的多态性位点，使其在应用上受到一定的 限制。 限制。
微卫星DNA（Microsatellite）又称简单 （ 微卫星 ） 重复序列（ 重复序列（Simplified Sequence Repeats） ）
SSR广泛分布于真核生物基因组中，是一种 广泛分布于真核生物基因组中，是一种1~6 广泛分布于真核生物基因组中 个碱基组成的长度为几十个核苷酸的简单重复 序列，在重复序列的两端， 序列，在重复序列的两端，往往是相对保守的 限制性内切酶位点。 限制性内切酶位点。 可根据其两端特异序列设计引物通过PCR反应， 反应， 可根据其两端特异序列设计引物通过 反应 检测简单重复序列重复单位书不同的DNA区域 检测简单重复序列重复单位书不同的 区域 的多肽性。 的多肽性。
分子标记
分子标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组。
④多态性高,自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第1 代分子标记1.1. 1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。
第八章分子标记及其应用
第八章分子标记及其应用第八章分子标记及其应用1) 分子标记的种类与特点1. 遗传标记的种类与特点遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。
Minisatellites：小卫星序列遗传标记的种类与特点1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。
2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。
3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。
4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。
2. DNA分子标记DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。
2.1 分子标记的优点1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;3）多态性高，自然存在，无须专门创造；4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。
2.2 分子标记的类型分三大类:1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragmentlength polymorphism ），限制性片段长度多态性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等第三节分子标记的应用1. RFLP标记RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。
基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。
《分子标记的应用》课件
通过检测犯罪现场遗留的生物样本中的分子标记，为犯罪调查提供 证据和线索。
遗传疾病研究
利用分子标记研究遗传性疾病的发病机制和家族遗传规律，为法医学 中的遗传疾病分析提供支持。
THANKS
分子标记技术的种类
01
限制性片段长度多态性（RFLP）
利用限制性内切酶切割基因组DNA，产生不同长度的片段，再通过电
泳和 Southern 杂交技术检测多态性。
02
微卫星标记
利用串联重复的DNA序列在不同个体间的变异来标记基因组，具有高
度多态性和遗传稳定性。
03
单核苷酸多态性（SNP）
检测单个核苷酸位点的变异，是最常见和应用最广泛的分子标记之一。
通过分子标记技术，可以鉴定 家禽品种间的遗传差异，为品
种选育提供依据。
分子标记还可以用于研究家禽 繁殖和生长等重要经济性状的 遗传基础，为育种提供理论支
持。
通过分子标记辅助选择，可以 快速准确地选择具有优良性状 的个体，提高家禽生产效益。
分子标记在兽医学中的应用
分子标记在兽医学中主要用于动物疾病诊断、抗病育种 和药物研发等方面。
利用分子标记技术快速筛选具有潜在活性的药物候选物，提高药 物研发效率。
药物靶点发现
通过研究分子标记与药物反应的关系，发现新的药物作用靶点， 为新药研发提供方向。
药物疗效评估
利用分子标记监测药物治疗过程中的生物标志物变化，评估药物 疗效和安全性。
分子标记在法医学中的应用
身份鉴定
利用DNA分子标记进行个体身份鉴定，在法医鉴定、亲子鉴定等领 域具有重要应用。
种群遗传多样性分析
分子标记可以揭示种群内的遗传变异，了解种群的遗传结构、变 异水平和进化历史。
分子标记
1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。
① 随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )
RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
分子标记
RFLP标记多态性的分子基础
Southern blotting
RFLP实验流程
移
自显影
RFLP 图谱
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP的应用：
1. 分类及遗传多样性研究
2. 遗传图谱的建立
遗传图谱(genetic map)指某一物种的染色体图谱(即连锁图谱)，
分子标记 Molecular Marker
遗传标记
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 1. 形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、
穗形、粒色或芒毛等的相对差异。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的 外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
2. 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱 基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
DNA标记多态性分子基础示意图
分子标记的类型
① 基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction
fragment length polymorphism,即限制性长度片
Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要
分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分 析。 RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。 但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标
记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力
随机引物PCR产物多态性的分子基础
类型1为显性标记，是最常见的多态 性，类型2、3、4为共显性标记，但 较少见
分子标记技术知识讲解
苷酸多态性） • 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几
个核苷酸的差异，从分子水平上单个核苷酸的差 异进行检测具有重要意义 • 检测SNPs方法a.随机扩增DNA（RAPD）法
的需要量大，在很大程度上限制了该 技术的应用
2.2 第二代分子标记技术
随机引物PCLeabharlann 标记• RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，DNA随机扩增多态性）
• RAPD具有技术简单、检测迅速、灵敏度 高、特异性强、检测容易、DNA样品用量 少的优点，但RAPD为显性遗传，侧你在 共迁移问题，并且重复性较差
1.1分子遗传标记
• 从广义上，是指可遗传并可检测的 DNA序列或蛋白质
• 从狭义上，是指DNA标记，这个界现 在别广泛采纳
• 具有分辨率好和信息量大等优势的分 子遗传标记目前已广泛应用于生物基 因组研究以及生物遗传育种、进化起 源、分类等诸多方面。
1.2DNA分子标记的定义及特征
• 定义：指能反映生物个体或种群间基 因组中某种差异特征的DNA片段，它 直接反映基因组DNA间的差异
• ISSR在引物设计上比SSR简单，无需知道 DNA序列就可用引物扩增，还比RFLP、 RAPD、SSR提供的遗传信息更多，但多 数情况下，不能区别一个位点扩增的DNA 片段
特异引物PCR标记
• SSR（Simple Sequence Repeats,简 单重复序列）
• SSR基本原理：根据微卫星序列两端 互补序列设计引物，通过PCR反应扩 增微卫星片段，由于核心序列串联重 复数目不同，因而能够用PCR的方法 扩增出不同长度的PCR产物，将扩增 产物进行凝胶电泳，根据分离片段的 大小决定基因型并计算等位基因频率
分子标记技术
CAPACITY
RFLPs
HiSpeed sequ
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP SSRsAFLPs RAPDs
1985
1990
1995
2000
2 分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。
2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
都有害； ✓ 探针的制备、保存和发放也很不方便； ✓ 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA
分子标记原理和技术
分子标记原理和技术分子标记原理和技术是一种用于研究和检测生物分子的方法。
分子标记是通过给生物分子附上一种特定的标记物，使其能够被观察和测量。
分子标记技术在生物医学研究、临床诊断、药物研发和环境监测等领域都有广泛的应用。
分子标记的原理是利用化学反应将标记物与待检测的生物分子结合起来，然后通过适当的方法观察或检测标记物。
常见的标记物有荧光染料、放射性同位素、酶和金纳米粒子等。
标记物的选择要考虑其化学性质、稳定性、检测灵敏度和特异性等因素。
分子标记技术有很多种，下面列举几种常见的技术：1.荧光标记：荧光标记是最常用的分子标记技术之一、通过给生物分子附加荧光染料，可以通过荧光显微镜观察其分布和表达水平。
荧光标记还可以用于流式细胞术、酶联免疫吸附实验等。
荧光标记可以选择多种不同的荧光染料，如草莓红、FITC和PE等。
2.放射性标记：放射性标记是利用放射性同位素将标记物与生物分子结合起来。
这种标记方法可以通过放射性计数器或放射影像技术来检测，具有极高的灵敏度。
常用的放射性同位素有3H（氚）、14C（碳14）和32P（磷32）等。
3.酶标记：酶标记是利用酶与底物之间的反应来检测生物分子。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
酶标记技术可以通过底物的颜色变化或荧光信号来观察酶的活性和分布。
4. 化学标记：化学标记是利用特定化学反应将标记物与生物分子结合起来。
常见的化学标记方法有SNAP标记、CLIP标记和Biotin-avidin 标记等。
化学标记的优点是反应选择性高，标记物的稳定性和特异性好。
5.金纳米粒子标记：金纳米粒子标记是一种新兴的分子标记技术。
金纳米粒子可以通过调节粒子大小和表面修饰来实现对生物分子的特异性识别。
金纳米粒子标记可以通过紫外-可见吸收光谱或扫描电镜观察。
分子标记技术在生物学研究中扮演着重要角色，能够帮助科学家观察和分析生物分子的功能和相互作用。
此外，分子标记技术还被广泛应用于临床诊断和药物研发领域，例如用于检测肿瘤标记物、鉴定药物靶点和筛选药物库。
分子标记名词解释
分子标记名词解释
分子标记 ( Molecular Marker) 是指用于遗传分析、基因组学研究、生物信息学等方面的一类技术工具。
它可以是 DNA、RNA、蛋白质等分子，也可以是其他生物分子，如多糖、脂类等。
分子标记既可以是标记基因 (marker gene),也可以是其他非编码 RNA(ncRNA) 或蛋白质。
分子标记技术广泛应用于遗传多样性分析、基因组学研究、生物信息学等领域。
其中，遗传多样性分析包括遗传图谱构建、单核苷酸多态性 (SNP) 分析、微卫星标记分析等;基因组学研究包括基因组组装、基因组注释、基因组比对等;生物信息学则利用分子标记进行基因预测、蛋白质结构预测、基因表达分析等。
常见的分子标记技术包括：基因测序、分子标记辅助选择、基因组芯片、蛋白质组芯片、生物信息学分析等。
其中，基因测序是目前分子标记技术中最前沿、最常用的技术之一。
它可以通过测序获取基因组序列信息，为基因组学研究和生物信息学分析提供更多的信息资源。
分子标记的名词解释
分子标记的名词解释分子标记是一种用于识别和定位生物分子的技术。
它通过在目标分子上附着特定的标记物（通常是化学物质）来实现。
这些标记物可以使科学家们追踪和可视化目标分子的位置、数量和活性，从而帮助我们更好地理解生物学过程和疾病的发展机制。
以下将进一步解释分子标记的原理和应用。
一、原理分子标记的原理基于分子生物学的相关技术，主要包括荧光标记、放射性标记和化学标记等。
其中，荧光标记是应用最为广泛的分子标记方法。
荧光标记是将目标分子与带有荧光染料的分子结合，使目标分子能够发出荧光信号。
荧光标记技术非常灵敏，能够在细胞或组织的微观尺度上检测目标分子的存在和定位。
它可以通过荧光显微镜等设备观察和记录分子的空间分布、动态变化以及相互作用情况。
二、应用1. 生命科学研究分子标记技术在生命科学研究中有着广泛的应用。
例如，在细胞生物学中，科学家们可以用分子标记技术追踪细胞内的特定蛋白质、核酸或化学分子。
通过观察它们的分布和相互关系，可以揭示细胞内部分子的信号传递、运输和相互作用机制，进而更好地理解生命的基本过程。
2. 疾病诊断和治疗分子标记技术也在临床医学中被广泛应用。
例如，利用荧光标记技术，可以精确地检测和定位肿瘤细胞、病毒、细菌等疾病相关的分子标记物。
这些标记物的出现可以帮助医生们早期发现疾病，进行准确的诊断，并且在治疗中提供指导。
同时，分子标记技术还可以用于评估药物对特定疾病标记物的影响，为精准医疗提供重要的依据。
3. 生物工程和食品安全在生物工程和食品安全领域，分子标记技术也发挥着重要作用。
例如，利用PCR技术与荧光标记相结合，可以进行基因突变、检测和定量分析。
这不仅可以应用于基因工程的研究和应用，还可以在食品安全中检测和鉴定转基因成分，确保食品的质量和安全性。
4. 化学和材料科学分子标记技术在化学和材料科学领域也有着广泛的应用。
例如，在材料表面修饰方面，科学家们可以利用分子标记技术实现在金属或化合物表面附加分子标记物，从而改变其表面性质和功能。
几种分子标记技术
SNP标记技术的应用实例
疾病关联研究
SNP标记技术广泛应用于疾病关联研究，通过检测SNP位 点，可以揭示疾病的遗传机制，为疾病的预防、诊断和治 疗提供依据。
药物研发
SNP标记技术可以用于药物研发，通过检测SNP位点，可 以预测个体对药物的反应差异，为个体化用药提供依据。
生物进化研究
SNP标记技术也可以用于生物进化研究，通过检测不同物 种或种群的SNP位点，可以揭示物种的遗传差异和进化关 系。
分子标记技术的应用领域
01
02
03
04
遗传育种
用于标记和选择具有优良性状 的基因，提高育种效率和品质
。
生物分类
用于区分不同物种、亚种和种 群，研究生物多样性和进化关
系。
疾病诊断
用于检测和诊断遗传性疾病、 癌症和其他重大疾病，为个性
化治疗提供依据。
药物研发
用于筛选和鉴定具有药效的分 子靶点，加速新药研发进程。
几种分子标记技术
contents
目录
• 简介 • RFLP标记技术 • AFLP标记技术 • SSR定义
01
分子标记技术是指利用生物分子 的特征来标记和识别生物体的技 术。
02
它通过检测生物体内特定基因或 蛋白质的表达水平，来反映生物 体的遗传特征、生理状态和环境 适应能力。
RFLP标记技术的优缺点
优点
RFLP标记技术具有高特异性、高稳定 性，是早期应用广泛的分子标记技术。
缺点
RFLP标记技术操作繁琐、成本较高， 且检测时间长，限制了其在实际应用 中的推广。
RFLP标记技术的应用实例
植物遗传育种
RFLP标记技术广泛应用于植物遗传 育种领域，用于鉴定品种纯度、遗传 多样性分析以及基因定位等。
分子标记
遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位 点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或 发生分子量变化。增加或缺少的PCR产物则为RAPD标记。
1990, Williams, et al. found.
4
RAPD
Williams等1990年创立。 RAPD 标记技术就是用一个（有时用两个）随 机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因 组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传 材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发 生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能 导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导 致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若 PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。
1974, Grodzicker, et al. found.
基本步骤
DNA提取 DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和 位臵转移到易操作的滤膜上
用放射性同位素或非放射性 物质标记的DNA作探针与膜 上的DNA杂交（Southern blot）
放射性自显影或酶学检测 显示出不同材料对该探针 的限制性酶切片段多态性
SF - seminal fluid DNA; MB - Matina Brunswick's DNA; S1 - DNA from suspect one; S2 - DNA from suspect two; FD - DNA from Fiona Dandenong as a control. a. Sean Upfield b. Suspect 1 c. Suspect 2 d. Fiona Dandenong e. Matina Brunswick
分子标记技术
应非定点地扩增DNA片段；
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。
RAPD技术流程：
RAPD分子标记的应用
RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东 栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花， 月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉 米，水稻等多种植物中广泛应用。
RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；
探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA 概念：RAPD技术建立于PCR技术的基础 之上，它是利用一系列不同的随机排列碱 基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研 究的基因组DNA进行PCR扩增，这些引 物在一定的退火条件下，
以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
单核苷酸多态性标记(SNP)
以特定序列为核心的分子标记技术
线粒体DNA分子标记(mtDNA)
三. 几种分子标记介绍
1.限制性片段长度多态性标记 Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP：限制性片段长度多态性，为第一代 多态性记。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分
第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA， 随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代 分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
分子标记
分子标记概念广义分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义分子标记概念只是指DNA标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异代数类型概念原理优点缺点主要应用第一代RFLP 限制性片段长度多态性限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生，那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。
1.标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响。
2.RFLP 标记的等位基因是共显性的，不受杂交的影响，可区分纯合基因与杂合基因。
3.可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。
1.标记技术需要酶切, 对DNA 质量要求高；RFLP 的多态性程度偏低。
2.分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境都有害。
3.探针的制备、保存和发放也很不方便。
4.分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
1.遗传学图的构建结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。
2.基因定位利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。
3.遗传多态性分析运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。
细胞质遗传研究RFLP技术是对DNA序列自然变异的直接检测，只需选择适当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性，从而能较好地应用于细胞质遗传的研究。
分子标记
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
基本简介细胞标记（cytological markers）主要是染色体核型（染色体鼠数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)，这类标记的缺点是数目有限。
目前，还未发现用其进行小麦抗叶锈基因的标记。
生化标记(biochemical markers)主要包括同工酶和储藏蛋白。
生化标记具有经济方便的优点，但其标记数有限。
DAVlD【6】等曾利用生化标记内肽酶同工酶EP-Dld作为遗传标记对以Thatcher为背景的小麦抗叶锈病近等基因系进行连锁分析，发现EP-Dld与Lr19紧密连锁，重组值为(0.01士0.09)个作图单位。
WINZELER【7】等利用含Lr19的小麦抗叶锈病近等基因系，发现生化标记内肽酶同工酶EP-Dl的无效等位基因EP-Dlc可以作为与Lr19紧密连锁的生化标记，遗传距离为(0.33士0.33)cM。
分子标记与形态标记、细胞标记、生化标记相比较，有以下几方面的优点:①在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制。
②数量多，遍及整个基因组。
③有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。
在标记小麦抗叶锈病基因方面，分子标记可以在更深层次上揭示小麦抗锈遗传机制。
通过找到与抗锈基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因，而且可以在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这为了解抗源和抗病品种中所含有的抗性基因提供了更为迅速、稳定、可靠的方法。
理想要求折叠理想的分子标记必须达以下几个要求：⑴具有高的多态性；⑵共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；⑶能明确辨别等位基因；⑷遍布整个基因组；⑸除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；⑹选择中性（即无基因多效性）；⑺检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；⑻开发成本和使用成本尽量低廉；⑼在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1 概述 2 常用分子标记技术原理及操作 3 分子标记在园艺植物中的应用
1 概述 1.1 基本概念
世间万物－遗传多样性（遗传变异） 遗传多样性（遗传变异）：遗传信息的总和，种内不同群体
之间或者一个群体内不同个体的遗传变异的总和。
遗传标记：是指可追踪染色体、染色体某一节段或者某个基 因座在家系中传递的任何一种遗传特性。是表示遗传多样性的有 效手段，可以明确反映遗传多态性的生物特征。它具有两个基本 特征，即可遗传性和可识别性。
SSR根据简单重复序列外两翼的特定短序列设计引 物，用来扩增重复序列本身，由于重复的长度变化 极大，所以会得到不同长度的片段。如果扩增出来 的某个片段与某个特定性状存在对应关系，则该片
段为该性状的SSR标记。
SSR原理
• 重复单元： 1~ 6bp,如 CA, CTCG • 重复次数：5~ 30 次 • 覆盖长度：10~300 bp
核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或是某一区段互 补）的两条多核苷酸链，通过碱基互补配对原则形成稳定的双链分子的 过程。若其中的一条链被认为标记上，该标记可以通过某种特定方法检 出，即成为所谓的探针。探针是指经特殊化合物标记的、特定的、已知 的核苷酸序列。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了 同样标记，可被检测出来。这样，我们以特定的已知核苷酸序列为探针 就可以在诸多的核苷酸序列中找到所需核苷酸。核酸杂交包括Southern 杂交、Northern杂交。 蛋白质分子杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理来进行检测的， 称为Western杂交。
细胞学标记 （cytological marker） 细胞有丝分裂的中期和早后期染色体的 核型和染色体显带技术。 特点：1. 不受环境影响 2. 能进行一些重要基因的染色体区域定 位 3. 材料来源难
生化标记 （biochemical marker） 主要包括同工酶、等位酶和贮藏蛋白标记，是指 利用植物代谢过程中的具有特殊意义的生化成 分或产物进行遗传多样性标记的技术。 特点：1. 表现近中性，对植物经济性状一般没有 大的不良影响； 2. 直接反映基因产物的差异，受环境影 响小； 3. 有些生化大分子分离困难
5’锚定引物 3’锚定引物 NNNN（CA）n （CA）n NN CACACACACACA GTGTGTGTGTGT
GTGTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACA NN n（CA） （CA）n NNNN 3’锚定引物 5’锚定引物
3’锚定引物 的PCR产物
5’锚定引物 的PCR产物
建立于PCR 技术基础之上的一种技术。它分别以具有相 对性状的基因组DNA为模板，以一个10bp随机寡核苷酸作引 物进行PCR扩增反应，在扩增产物中查找与目的性状相连锁 的DNA片段（即差异片段），获得的片段就是目的性状的 RAPD标记。
特点： 1. 试验步骤少； 2. 没有物种特异性； 3. 技术简便； 4. DNA样品量少； 5. 易发现多态性； 6. 显现标记 7. 重复性不高； 8. 存在‘端或3’端进行一步法测序，一般长度为300－ 500bp，平均长度为360±120bp。所获得序列与基因数 据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖
2.6 表达序列标签标记 （expressed sequence tag，EST）
一个基因组的所有碱基中一般只有大约2％的碱基来 组成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再是一种创 建基因目录的有效途径。大量的实验证明，cDNA的大规 模测序才是了解基因组的先驱。
EST标记技术的原理是将mRNA反转录成cDNA并克
4Kb W M 5Kb W M 5Kb 4Kb
1Kb
1Kb
5Kb 4Kb W M W M1 W M1 W M 5Kb 4Kb M2 5Kb 4Kb 3Kb
4Kb
5Kb 3Kb
M2
3. 单核苷酸突变，即DNA序列发生了单碱基转换（A与T或C与G）或 颠换（A、T与C、G）
W M W M …ATCGAATGCGC… …ATCGATTGCCC… …ATCGAATGCAC… …ACCGAATGCGC…
DNA质量；
反应灵敏，防止污染； 影响因子多，要调体系； 琼脂糖凝胶---聚丙烯酰胺凝胶； 转变为别的标记
DNA指纹技术 (DNA fingerprinting，DNF)
原理与RAPD技术相同， 不同的是，在DNF分析中， 引物浓度更高，引物长度更短， 一般6个碱基，产物片段比较小 且极为丰富，往往用聚丙烯酰 胺凝胶电泳，DNF通常会产生
操作步骤： 1. DNA的提取 2. PCR反应：先宽松后严格 3. 电泳观察分析
2.3 序列特征扩增区域
(sequence characterized amplified region，SCAR)
先做RAPD或DNF分析，然后把标记片段测序，根据片 段两端的序列设计一对特定引物（通常16-24个碱基），再对 具有相对性状的两个基因组进行PCR特异扩增，这样就可把 与相对性状对应的序列单一扩增出来。这样的DNA片段与原 先的性状存在对应关系，就称为该性状的SCAR标记。
Random primer
RAPD marker
Random primer
Sequencing
specific primer 1
SCAR marker
specific primer 2
SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定
位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（原 因是使用的引物长）。
1.2 DNA分子标记的发展历史及类型
第一类分子标记：以Southern杂交为基础的分子标记技 术 RFLP（1974） 第二类分子标记：以PCR为基础的分子标记技术 SSR（1982）、RAPD（1990）、AP-PCR（1990）、 AFLP （1993）、 ISSR （1994）、 SAGE （1995） 第三类分子标记：以单核苷酸多态性为基础的分子标记技 术 SNP（1998）、SRAP（2001）、TRAP（2003）
1.3 DNA分子标记产生的分子基础
基因组DNA
PCR技术： polymerase chain reaction
引物
DNA聚合酶
DNA片段体外扩增
限制性内切酶： restriction endonuclease
电泳：带电荷的物质在电场中的趋向运动。 核酸电泳：核酸分子由于带负电荷，在电场中向阳极 定向运动。根据核酸电泳的介质可以分为琼脂糖凝胶 电泳和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳。 同一种核酸分子由于大小、 电荷数相同，在电场电势和介 质阻力固定的情况下，应当具 有相同的迁移速率，而不同大
SCAR的操作过程：
RAPD标记技术分析； 回收特异RAPD扩增片段； RAPD产物克隆与测序； RAPD产物特异引物设计； 特异引物引导下的PCR反应； 电泳获得SCAR标记。
2.4 简单序列重复标记 （simple sequence repeat，SSR）
真核生物基因组含有分散重复序列和串连重复序列两种类型的重复 序列。根据重复序列的长度、拷贝数和位置等又将串连重复序列分为卫 星DNA（基序长100－300bp）、小卫星DNA （基序长10－60bp）、 微 卫星DNA（基序长1－6bp，如 CA、 CTCG ）等几种类型。
( molecular marker )
分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的 DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记只是指DNA标记。
DNA分子标记有其独特的优势:
(1) 直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发
育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等 问题； (2) 自然界存在许多等位变异，无需人为创造，多态性高 ； (3) 遍布整个基因组，可检测的基因座位是无限的。 以DNA碱基序列变异为基础，是DNA水平遗传变异的直接反映
非常复杂的带型。
任意引物PCR(Arbitary primer PCR，AP-PCR) 武断的选择一个非特异性引物，在标准的 PCR体系中，首先在不严格的条件下使引物与 待分析的DNA序列通过错配而复性，如果两个 引物之间的序列符合扩增的条件则可以进行扩 增，再后期严格的扩增条件下产生指纹图。 引物的选择：M13-20测序引物 影响因素：盐浓度、复性温度、模板浓度、引物 浓度
探针的标记：同位素标记、生物素标记（地高辛 标记，Digoxigenin）
重物
吸水纸 杂交膜 支持物
Whatman 3MM 滤纸
转移缓冲液
注意事项： 1. DNA要完整，纯度要高 2. 气泡 3. 多种酶
2.2 随机扩增多态性DNA
(random amplified polymorphic DNA，RAPD)
遗传标记 （Genetic marker）
• 性状标记
（morphological marker）
• 细胞学标记
（cytological marker）
多态性少 标记数量有限 以 基因表达结果（表现型） 为基础，是对基因的间接 反映
• 生化标记
（biochemical marker）
• 分子标记
性状标记 （morphological marker） 细胞学标记 （cytological marker） 生化标记 （biochemical marker）
分子标记 ( molecular marker )
形态标记 （morphological marker） 是指那些能够明确显示遗传多样性的外部形 态特征。 特点：1. 简单直观、经济方便 2. 数量少 3. 易受环境影响 4. 一些标记与不良性状连锁 5. 周期长
基本步骤：
1、DNA的提取； 2、用随机引物对两个相对性状个体进行PCR扩增；