分子标记

Random primer
RAPD marker
Random primer
Sequencing
specific primer 1
SCAR marker
specific primer 2
SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定
位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（原 因是使用的引物长）。
记。
特点： 1. 遍布，无限 2. 不受外界环境、发育阶段、器官等影响 3. 探针多 4. DNA需求量大，纯度高 5. 技术要求高，成本大
RFLP的基本步骤：
1、DNA的提取 碱法、CTAB、SDS
2、用限制性内切酶酶切DNA
EcoRⅠ
10U
5µgDNA
终体积30-40µl
3、 核酸电泳
4. 核酸杂交
隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克 隆，对其5‘端或3’端进行一步法测序，一般长度为300－ 500bp，平均长度为360±120bp。所获得序列与基因数 据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖




性状标记 （morphological marker） 细胞学标记 （cytological marker） 生化标记 （biochemical marker）
分子标记 ( molecular marker )
形态标记 （morphological marker） 是指那些能够明确显示遗传多样性的外部形 态特征。 特点：1. 简单直观、经济方便 2. 数量少 3. 易受环境影响 4. 一些标记与不良性状连锁 5. 周期长
2 常用分子标记方法
2.1 限制性片段长度多态性标记
（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)
RFLP标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群
体的DNA，然后通过电泳和Southern杂交技术在酶切后形成的 DNA片段中发现这种不同。这种不同就是目的性状的RFLP标
基本步骤：
1、DNA的提取； 2、用随机引物对两个相对性状个体进行PCR扩增；
（1）模板（2）引物 （3）缓冲液（4）Mg2+（5）dNTP（6）耐热 DNA聚合酶 变性、退火、延伸
3、用凝胶电泳分开产物DNA片段；
4、查找特异的与目的性状共分离的DNA片段；
注意事项： 1. 冰上加样操作；
2. 3. 4. 5. 6.
SSR根据简单重复序列外两翼的特定短序列设计引 物，用来扩增重复序列本身，由于重复的长度变化 极大，所以会得到不同长度的片段。如果扩增出来 的某个片段与某个特定性状存在对应关系，则该片
段为该性状的SSR标记。
SSR原理
• 重复单元： 1~ 6bp,如 CA, CTCG • 重复次数：5~ 30 次 • 覆盖长度：10~300 bp
( molecular marker )
分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的 DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记只是指DNA标记。
DNA分子标记有其独特的优势:
(1) 直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发
育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等 问题； (2) 自然界存在许多等位变异，无需人为创造，多态性高 ； (3) 遍布整个基因组，可检测的基因座位是无限的。 以DNA碱基序列变异为基础，是DNA水平遗传变异的直接反映
2.6 表达序列标签标记 （expressed sequence tag，EST）
一个基因组的所有碱基中一般只有大约2％的碱基来 组成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再是一种创 建基因目录的有效途径。大量的实验证明，cDNA的大规 模测序才是了解基因组的先驱。
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EST标记技术的原理是将mRNA反转录成cDNA并克
5’锚定引物 3’锚定引物 NNNN（CA）n （CA）n NN CACACACACACA GTGTGTGTGTGT
GTGTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACA NN n（CA） （CA）n NNNN 3’锚定引物 5’锚定引物
3’锚定引物 的PCR产物
5’锚定引物 的PCR产物

遗传标记 （Genetic marker）
• 性状标记
（morphological marker）
• 细胞学标记
（cytological marker）
多态性少 标记数量有限 以 基因表达结果（表现型） 为基础，是对基因的间接 反映
• 生化标记
（biochemical marker）
• 分子标记
探针的标记：同位素标记、生物素标记（地高辛 标记，Digoxigenin）
重物
吸水纸 杂交膜 支持物
Whatman 3MM 滤纸
转移缓冲液
注意事项： 1. DNA要完整，纯度要高 2. 气泡 3. 多种酶
2.2 随机扩增多态性DNA
(random amplified polymorphic DNA，RAPD)
1.3 DNA分子标记产生的分子基础
基因组DNA
PCR技术： polymerase chain reaction
引物
DNA聚合酶
DNA片段体外扩增
限制性内切酶： restriction endonuclease
电泳：带电荷的物质在电场中的趋向运动。 核酸电泳：核酸分子由于带负电荷，在电场中向阳极 定向运动。根据核酸电泳的介质可以分为琼脂糖凝胶 电泳和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳。 同一种核酸分子由于大小、 电荷数相同，在电场电势和介 质阻力固定的情况下，应当具 有相同的迁移速率，而不同大
DNA质量；
反应灵敏，防止污染； 影响因子多，要调体系； 琼脂糖凝胶---聚丙烯酰胺凝胶； 转变为别的标记
DNA指纹技术 (DNA fingerprinting，DNF)
原理与RAPD技术相同， 不同的是，在DNF分析中， 引物浓度更高，引物长度更短， 一般6个碱基，产物片段比较小 且极为丰富，往往用聚丙烯酰 胺凝胶电泳，DNF通常会产生
非常复杂的带型。
任意引物PCR(Arbitary primer PCR，AP-PCR) 武断的选择一个非特异性引物，在标准的 PCR体系中，首先在不严格的条件下使引物与 待分析的DNA序列通过错配而复性，如果两个 引物之间的序列符合扩增的条件则可以进行扩 增，再后期严格的扩增条件下产生指纹图。 引物的选择：M13-20测序引物 影响因素：盐浓度、复性温度、模板浓度、引物 浓度
SCAR的操作过程：
RAPD标记技术分析； 回收特异RAPD扩增片段； RAPD产物克隆与测序； RAPD产物特异引物设计； 特异引物引导下的PCR反应； 电泳获得SCAR标记。
2.4 简单序列重复标记 （simple sequence repeat，SSR）
真核生物基因组含有分散重复序列和串连重复序列两种类型的重复 序列。根据重复序列的长度、拷贝数和位置等又将串连重复序列分为卫 星DNA（基序长100－300bp）、小卫星DNA （基序长10－60bp）、 微 卫星DNA（基序长1－6bp，如 CA、 CTCG ）等几种类型。
核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或是某一区段互 补）的两条多核苷酸链，通过碱基互补配对原则形成稳定的双链分子的 过程。若其中的一条链被认为标记上，该标记可以通过某种特定方法检 出，即成为所谓的探针。探针是指经特殊化合物标记的、特定的、已知 的核苷酸序列。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了 同样标记，可被检测出来。这样，我们以特定的已知核苷酸序列为探针 就可以在诸多的核苷酸序列中找到所需核苷酸。核酸杂交包括Southern 杂交、Northern杂交。 蛋白质分子杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理来进行检测的， 称为Western杂交。
1. 2.
3.
4. 5.
特点： 数量多且平均分布； 位于内含子中； 共显现遗传； 结果重复性高； 引物问题
SSR 多态性
2.5 简单重复序列间区标记 （inter-simple sequence repeat, ISSR）
进行SSR反应需要知道两侧序列以设计引物，但大多 数情况下这些序列并不知道。为了解决这一问题，提出 了ISSR标记。 设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物，这些引物 的3‘端或5’端加上2－4个随机核苷酸，通过PCR反应，对 两个相距较近，方向相反的重复序列之间的DNA序列进 行扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辩，扩增带多 为显性表现。
1.2 DNA分子标记的发展历史及类型
第一类分子标记：以Southern杂交为基础的分子标记技 术 RFLP（1974） 第二类分子标记：以PCR为基础的分子标记技术 SSR（1982）、RAPD（1990）、AP-PCR（1990）、 AFLP （1993）、 ISSR （1994）、 SAGE （1995） 第三类分子标记：以单核苷酸多态性为基础的分子标记技 术 SNP（1998）、SRAP（2001）、TRAP（2003）
小的核酸分子迁移率不同，从
而加以分离。
三种情况： 1. DNA 序列酶切位点（或PCR引物结合位点） 处的碱基发生突变，导致酶切位点（或者PCR引物结 合位点）消失、酶切产物（或者扩增产物）减少。
2Kb 3Kb W M W M
W
2Kb M
3Kb
酶切产物电泳
PCR扩增产物电泳
2. DNA 序列酶切位点（或PCR引物结合位点）之间缺失（或插入）了 一段核苷酸序列，或者是酶切位点（或者PCR引物结合位点）之间的串 联重复单元数目发生了改变，导致酶切产物（或者扩增产物）片段长度 发生了改变。

细胞学标记 （cytological marker） 细胞有丝分裂的中期和早后期染色体的 核型和染色体显带技术。 特点：1. 不受环境影响 2. 能进行一些重要基因的染色体区域定 位 3. 材料来源难

生化标记 （biochemical marker） 主要包括同工酶、等位酶和贮藏蛋白标记，是指 利用植物代谢过程中的具有特殊意义的生化成 分或产物进行遗传多样性标记的技术。 特点：1. 表现近中性，对植物经济性状一般没有 大的不良影响； 2. 直接反映基因产物的差异，受环境影 响小； 3. 有些生化大分子分离困难
建立于PCR 技术基础之上的一种技术。它分别以具有相 对性状的基因组DNA为模板，以一个10bp随机寡核苷酸作引 物进行PCR扩增反应，在扩增产物中查找与目的性状相连锁 的DNA片段（即差异片段），获得的片段就是目的性状的 RAPD标记。
特点： 1. 试验步骤少； 2. 没有物种特异性； 3. 技术简便； 4. DNA样品量少； 5. 易发现多态性； 6. 显现标记 7. 重复性不高； 8. 存在共迁移问题
园艺植物分子标记
1 概述 2 常用分子标记技术原理及操作 3 分子标记在园艺植物中的应用
1 概述 1.1 基本概念
世间万物－遗传多样性（遗传变异） 遗传多样性（遗传变异）：遗传信息的总和，种内不同群体
之间或者一个群体内不同个体的遗传变异的总和。
遗传标记：是指可追踪染色体、染色体某一节段或者某个基 因座在家系中传递的任何一种遗传特性。是表示遗传多样性的有 效手段，可以明确反映遗传多态性的生物特征。它具有两个基本 特征，即可遗传性和可识别性。
4Kb W M 5Kb W M 5Kb 4Kb
1Kb
1Kb
5Kb 4Kb W M W M1 W M1 W M 5Kb 4Kb M2 5Kb 4Kb 3Kb
4Kb
5Kb 3Kb
M2
3. 单核苷酸突变，即DNA序列发生了单碱基转换（A与T或C与G）或 颠换（A、T与C、G）
W M W M …ATCGAATGCGC… …ATCGATTGCCC… …ATCGAATGCAC… …ACCGAATGCGC…
操作步骤： 1. DNA的提取 2. PCR反应：先宽松后严格 3. 电泳观察分析
2.3 序列特征扩增区域
(sequence characterized amplified region，SCAR)
先做RAPD或DNF分析，然后把标记片段测序，根据片 段两端的序列设计一对特定引物（通常16-24个碱基），再对 具有相对性状的两个基因组进行PCR特异扩增，这样就可把 与相对性状对应的序列单一扩增出来。这样的DNA片段与原 先的性状存在对应关系，就称为该性状的SCAR标记。