蛋白沉淀方法

蛋白沉淀方法

蛋白沉淀是蛋白质分离与纯化的一种常用方法，通过加入化学物质使目标蛋白质与其

它蛋白质或者杂质分离，并沉淀于溶液底部或者浮于溶液表面。本文将从蛋白沉淀的原理、化学物质的选择、实验操作、蛋白沉淀后处理等方面进行介绍。

一、蛋白沉淀的原理

蛋白质的沉淀是基于化学物质与蛋白质之间的物理或者化学相互作用，包括：

1. 盐析沉淀

在高浓度盐溶液中，蛋白质远离其同样带电的水分子，而形成大分子团聚，从而沉

淀。

在酸性环境下，大多数蛋白质通过质子化而失去电荷，降低了疏水性，从而沉淀。

在碱性环境下，蛋白质通常解离出一个氨基酸残基的羧基，从而带有负电荷，易于被

阳离子与之形成沉淀。

4. 有机溶剂沉淀

如乙醇、丙酮、甲醇等，可与蛋白质形成复合物，使其聚合而沉淀。

以上几种原理可单独或结合使用，根据情况进行选择。

二、化学物质的选择

常用的盐类有氯化铵、硫酸铵、硫酸钠等。浓度通常在10-60%之间，具体浓度根据具体实验条件进行选择。

2. 酸类

常用的酸包括二元酸、有机酸等。浓度为0.1-1M之间，酸性度通常为pH 4-6。

3. 碱类

常用的有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇等。浓度通常为50-90%之间，根据实验要求进行选择。

三、实验操作

1. 样品制备

待分离的蛋白质必须经过预处理，通常包括离心、裂解、过滤等步骤。裂解方式可以使用生理盐水、水、甲醇等，使蛋白质从细胞中释放出来。过滤可以使用滤纸、滤膜、分子筛等方式，去除杂质。

2. 化学物质的加入

将选择好的化学物质加入样品中，此时需注意化学物质前后也要进行科学操作，如一些电解质类物质可能带有杂质，需要先进行过滤；有机溶剂可能会引起蛋白质的变性，需加入适量的缓冲液进行保护。

将混合物小心地混合均匀后，离心使混合物分层，此时目标蛋白沉在沉淀层，上清液中还有一些蛋白，需要将其过滤或沉淀以去除杂质。

4. 纯化

将沉淀分解，得到的产物通过离心、层析等步骤进行纯化，最终得到目标蛋白。

沉淀后需要进行洗涤，以去除杂质，保证目标蛋白的纯度和酶效。

2. 沉淀重悬

洗涤后的沉淀需要重悬，在重悬的过程中如果出现不溶性，可以添加一些溶解助剂如尿素、甘油等。

3. 检测

对于最终得到的目标蛋白进行检测，检测包括蛋白含量测定、电泳分析、质谱分析等。

蛋白沉淀是一种简单、易于操作、成本低廉的方法。在蛋白纯化的过程中，要根据样品特点、实验目的等情况选取合适的化学物质进行沉淀，同时需要注意化学物质的前期操作和后续处理，以避免影响目标蛋白的纯度和活性。蛋白质的沉淀是一种通用的分离蛋白质的方法，广泛应用于分离细胞、体液等含有蛋白质的样品。蛋白质沉淀优点在于操作简单、易于处理以及可用于大规模分离。

1. 选择合适的沉淀剂

（1）样品中蛋白质的种类、分子量和浓度因素；

（2）预期的沉淀率和纯度；

（3）对蛋白质结构和功能的影响。

常见的沉淀剂包括硫酸铵、氯化铵、三氯醋酸、酒精、聚乙二醇等。需要根据实验需要和样品特点选择合适的沉淀剂，通常选择沉淀剂的浓度为15-80%。

要进行蛋白质沉淀前，需要进行样品的预处理以去除杂质，如离心时会将细胞碎片、

油脂等杂质随着上清液去除，或者通过滤器过滤杂质。对于脂肪类物质多的样品，如乳汁、血浆等，需要通过添加油脂酶或者使用有机溶剂去除脂肪酸。对于一些样品中磷脂的含量

很高时，也需要通过加入磷脂酶去除。

3. 操作实践

（1）沉淀时离心速度要慢，沉淀后要轻轻将上清液吸掉，注意不要带上沉淀层；

（2）加入沉淀剂的时候需要均匀混合，沉淀剂的加入要分批进行，每次加入后需要搅拌混合均匀；

（3）对于沉淀后的蛋白质，要及时洗涤以去除杂质。洗涤的次数需要根据每次加入沉淀剂的量和沉淀率进行调整；

（4）在沉淀后重悬样品过程中，需要使用适当的缓冲溶解液将沉淀液缓慢地重悬均匀；

（5）在进行重悬过程中，如果出现蛋白质不溶，则需要加入少量的尿素或甘油加以解决。

4. 后续处理

经过蛋白质沉淀，得到的蛋白质混合物通常还需进一步纯化。纯化方法包括层析、电

泳等，以得到纯净的目标蛋白质。在分析蛋白质的时候，可以用Western blotting、ELISA等方法。

在应用蛋白质沉淀方法时，需要注意如下几点：

（1）不同的蛋白质质量浓度和分子量对沉淀的影响不同，因此得到的蛋白质沉淀需要进行分析鉴定，以验证其是否是目标蛋白质；

（2）在选择沉淀剂时，需要根据不同的蛋白质，选择合适的沉淀剂和浓度；

（3）在操作蛋白质沉淀时，需要注意生物安全，尤其是在操作人员面前禁止打开高浓度化学品的封口，以免化学品溅到面部或其他部位。

蛋白质沉淀是目前分离蛋白质常用的方法，但在应用时需要根据不同的情况和需要选

择合适的沉淀剂，并注意化学品的安全使用，以获得高质量的蛋白质样品。1. 盐析沉淀

盐析沉淀是一种常用的蛋白质分离方法，根据盐浓度的变化，可以使蛋白质失去溶解性，从而沉淀。通常使用的盐包括氯化铵、硫酸铵等。在盐密度的变化过程中，沉淀的准

确性和后续的纯化过程都取决于不同的盐浓度和蛋白质的溶解度。

在一些酸性或碱性环境中，蛋白质会失去原先的电荷，从而沉淀。通常使用的酸包括硫酸、三氯乙酸等，碱包括氢氧化钠、碳酸钠等。酸碱沉淀的优势在于操作简单、快速，并且对蛋白质的结构和功能损害较小。

3. 有机溶剂沉淀

有机溶剂沉淀是利用脂溶性化合物与蛋白质形成复合物来实现蛋白质的分离。常用的有机溶剂包括酒精、甲醇、丙酮等。有机溶剂沉淀的优点在于可获得高纯度的蛋白质，但不同的有机溶剂会对蛋白质的结构和功能产生影响，使用时需要注意。

4. 优化沉淀条件

在进行蛋白质沉淀时，除了选择合适的沉淀剂之外，还需要优化沉淀条件，以保证蛋白质的沉淀率和纯度。如调整沉淀剂的浓度、调整溶液的pH值、改变温度等。

5. 后续处理

在完成蛋白质沉淀后，需要进行洗涤、干燥和纯化等后续处理步骤，以获得高质量的蛋白质样品。在洗涤、干燥和纯化过程中，需要选择合适的化学物质和方法，以保证最终得到的蛋白质样品的纯度和酶效活性。

6. 注意事项

（1）选择合适的沉淀剂，并优化其浓度和条件；

（2）控制pH值，使其符合目标蛋白质的沉淀条件；

（3）沉淀后及时进行洗涤，并且注意洗涤次数；

（4）在沉淀后重悬时，需要使用适当的缓冲液，以免蛋白质发生变性；

（5）在分析蛋白质时，需要选择合适的方法和仪器，以验证获得的蛋白质是否为目标蛋白质。

蛋白质沉淀是一种简单、快速、易于控制的蛋白质分离纯化方法。在蛋白质沉淀时，需要根据具体情况选择合适的沉淀剂和条件，并严格控制实验条件和后续处理步骤。