细胞培养实验报告

动物细胞造就

一.实验目标.

1.控制无菌操纵技巧.

2.控制原代和传代细胞造就.

3.控制细胞冷冻和苏醒技巧.

4.懂得造就成纤维细胞的形态.

二.实验道理.

将动物机体的组织从机体中掏出,经各类酶（经常运用胰蛋白酶）.螯合剂（经常运用EDTA）或机械办法处理,疏散成单细胞,置适合的造就基中造就,使细胞得以生计.发展和滋生,这一进程称原代造就.

细胞在造就瓶长成致密单层后,已根本上饱和,为使细胞能持续发展,同时也将细胞数目扩展,就必须进行传代（再造就）. 传代造就也是一种将细胞种保管下去的办法.同时也是运用造就细胞进行各类实验的必经进程.悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才干分瓶.

对具有移动特征的稳固细胞系或细胞株进行长期保管,一方面可以作为细胞研讨的实验材料,另一方面可以做细胞成品的临盆材料.今朝普遍运用的细胞保管办法是低温冷冻保管法,.细胞的冷冻保管的原则是慢冻快融,如许做是为了防止细胞因为冷冻进程中产生了冰晶而产生细胞决裂.

三.实验器材及药品.

器材：怀孕的小白鼠.造就箱.造就瓶.造就皿.移液器.眼科剪.镊子.酒精灯.离心计心情.水浴锅.倒置显微镜.CO2造就箱.超

净工作台.离心管.高压灭菌锅.试管架等.

药品：小牛血清.DMEM合成造就基.抗生素.DMSO冷冻剂.胰酶.PBS 缓冲液等.

四.实验操纵.

1.消毒灭菌.

将实验所需用到的对象（如枪头.造就皿.眼科剪.镊子以及每小我的实验服等）分散灭菌.烘干.配制75%的酒精以备实验时所需.

2.造就基的配制.

分别取10ml的小牛血清.90ml的DMEM合成造就基,将两种造就基混杂在一路,再向个中参加1ml的抗生素,吹打混匀就得到了细胞造就的造就液.

3.原代造就.

（1）.预备.将实验进程中会用到的对象以及药品全体放在超净工作台长进行紫外消毒灭菌.实验开端前带好乳胶手套,用酒精敌手进行消毒.将怀孕的小白鼠放在酒精中杀逝世,掏出子宫内的胚胎组织.

（2）.剪切与消化.将胚胎组织放于平板中,用眼科剪将组织块剪碎,剪得越碎越好.将剪碎的组织块放于离心管中,参加大约200µl 的胰酶进行消化.也可将其置于37度恒温箱中进行消化.

（3）.分别细胞.消化到一准时光时,假如离心管中的溶液中消失了显著的污浊,可用吸管吸出少许消化液在镜下不雅察,如组织已疏散成细胞团或单个细胞,则应当参加与胰酶等量的造就液终止消化.离心管于离心计心情中离心,弃上清液,得到疏散的细胞.

℃恒温CO2箱造就,瓶口极少拧的松一点.

4.传代造就.

（1）.倒置显微镜下不雅察细胞的形态.倒置显微镜下不雅察造就细胞的长势及密度,依据细胞密度决议传代的稀释倍数.

（2）.收集原代造就的细胞.吸出造就瓶中的旧造就液,并用PBS 冲洗两遍.然后向造就瓶中参加200µl的胰酶进行消化.消化一段时光后用设置装备摆设好的造就液等比例终止消化.然后离心,收集到原代造就的细胞.

（3）.传代细胞的造就.向离心管内参加大约7—8ml的造就液,吹打混匀.将造就液转移到造就瓶中,置于37度恒温CO2造就箱中造就.造就1—2天后于显微镜下不雅察细胞的形态.

5.细胞冷冻保管.

（1）.收集细胞.吸出造就瓶中的旧造就液,并用PBS冲洗两遍.然后向造就瓶中参加200µl的胰酶进行消化.消化一段时光后用设置装备摆设好的造就液等比例终止消化.然后离心,收集细胞.（2）.冷冻.向离心管中参加必定量的造就液以及10%—20%的DMSO冷冻液,吹打混匀并转移到冷冻管中.先将冷冻管在4度冰箱中放置10min,再放在—70度的冰箱中冷冻留宿.

（3）.苏醒.将冷冻的细胞掏出来后,连忙放在40度水浴中,使其快速熔化.并对熔化的细胞进行进一步的不雅察.

五.实验成果.

传代细胞

传代第一次换液细胞

原代第一次的细胞

原代第四天的细胞

冷冻苏醒的细胞

六.实验剖析与评论辩论.

从本次实验的图片可以看出来,实验做得还算成功,细胞根本上没有被污染.在做的进程中必定要异常留意无菌操纵,这是决议实验成功的症结身分.在做原代造就的时刻,必定要将小鼠胚胎的组织块剪得够碎,确保在用胰酶消化后可以得到分别的单个细胞.在做传代造就时,要掌控好胰酶的消化时光.冷冻苏醒时,必定要按照步调进行冷冻,遵守慢冻速溶的原则.