光散射法对蛋白质溶液的检测

光散射的原理
光散射是物质与光相互作用的 多种形式之一，它源于光电磁 波的电场振动导致的分子中电 子产生的受迫振动所形成的偶 极振子。 根据电磁理论，振动着的偶极 振子是一个二次波源，它将产 生振动的自身电磁场，这个电 磁场将以与入射光相同的频率 向各个方向发出辐射，从而产 生光散射现象。
定量分析的依据
迫 切 需 要 改 进 检 测 技 术
三聚氰胺含氮量为66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。凯氏定氮法实际上测 的不是蛋白质含量，是通过测定氮含量来推算蛋白质含量，因此测定的是粗蛋 白，不能够区别蛋白氮和非蛋白氮.牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为它能 冒充蛋白质。
在研究污染物中，我们要想了解植物的耐抗性，怎 么定量的描述呢？通过准确的检测特定蛋白酶的数 量，了解植物对污染物的耐抗性。
共振光散射现象的发生原因在于当入射光与被测物质的粒子相 互作用时，且当入射光的波长接近被测物分子的最大吸收波长 时，散射粒子的光散射强度会有所增加。基于此，Pasternack 等首次提出了在普通的荧光光谱仪上，通过调节合适的激发波 长和发射波长，建立了共振光散射技术，并利用共振光散射信 号的增强值与被测物的浓度在一定范围内呈线性关系，从而被 用于痕量物质的定量分析测定。
检测大分子的技术


蛋白质的检测技术一直是与生命科学发展密切相关的前沿课 题之一。研究普适性好、灵敏度高且操作简便的蛋白质检测新技 术显得越来越迫切。 凯氏定氮法、考马斯亮蓝法。 凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，测试结果比较准确， 但是测定需要经过消化、蒸馏、滴定等步骤，操作繁琐，耗费时 间长。而且它是通过测定氮含量来推算蛋白质含量。 考马斯亮蓝法以标准蛋白，制作标准曲线的和测定方法用显色剂 考马斯亮蓝G-250法快速测定蛋白质。样品的处理方法是，将100 mg 乳粉溶解于1000 mL蒸馏水 ，配成浓度为100 μg/mL蛋白质溶液， 然后按要求进行测定。 共振光散射法（Resonance light scattering, RLS）测定蛋白质大分 子操作简便、快速、灵敏。
光散射检测技术 在蛋白质大分子溶液中的应用
李红兵 12721912
蛋白质在生活中的角色
蛋白质是最基本的生命物质基础，是生物细胞的基 本构成物质，在生物的生命活动中起着重要的作用， 几乎所有的酶都是由蛋白质组成的。它可调节生理 功能、作为药物分子、矿物质、维生素和微量元素 载体并可为给体提供所需能量。此外，酶可以直接 表达生物性状，动植物及微生物细胞内特定酶含量 的变化也是诊断疾病的重要依据，其含量能够反映 机体的健康状况。
光散射测定
1 共振光谱波长的选择
采用RF 5301 PC型荧光分光光度计，设定激发在220～800 nm波长 范围内同步扫描,并根据三种硫酸铵体系的共振光散射谱线，选择 最大共振光散射波长为320nm。
光散射测定
2 探针硫酸铵的作用测试
1）由于盐离子与蛋白质表面的电性相反，从而形成离子对，使蛋白质分 子之间的静电排斥作用减弱，从而相互靠扰，聚集起来； 2）由于蛋白质的亲水性比中性盐的亲水性小，中性盐离子发生水化使蛋白质脱 去水化膜，疏水区域被暴露。疏水区域相互作用使蛋白质分子聚集，形成沉淀。
光散射测定
测定方法：
基于硫酸铵与蛋白质溶液之间的盐析作用，可以使蛋白质 分子凝聚，从而使体系的共振光散射信号增强的现象，提 出了一种新的共振光散射探针—硫酸铵，并将其用于牛血 清白蛋白（BSA）人血清白蛋白（HAS）和卵清蛋白（OVA） 定量测定。同时考察了溶液 pH 值、硫酸铵浓度及干扰离子 对检测的影响。最后将本法用于合成样品和实际血清样品 中总蛋白的测定，并将结果与传统的考马斯亮蓝（CBB）法 得出的结果相比较，发现结果的一致性很好。
光散射测定
3 pH值的选定
光散射测定
理论上讲，蛋白质分子表面所带的静电荷越多，它的溶 解度越大，而当外界环境使其表面静电荷为零时，溶解 度将达到一个相对的最低值。 当将(NH4)2SO4加入到血清蛋白或卵清蛋白溶液中时，溶 液的离子强度发生了变化，导致的蛋白质分子周围电荷 数量的降低。 由于此时蛋白质周围电荷数量下降，导致蛋白质的溶解 度的下降及大粒子的形成，从而使体系的共振光散射强 度增加。综合上述结论，分别选择pH值为3.0, 4.0和3.0作 为BSA，HSA和OVA的最优化酸度。
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蛋白质溶液的性质
蛋白质是高分子化合物，在水中呈胶体。蛋白质是大分 子，外带大部分是极性基团，有水化膜，具有同种电性， 因而在水中能形成稳定的胶体。维持蛋白质溶液稳定的 因素有两个： （1）水化膜：蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可 吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋 白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。 （2）同种电荷：在pH≠pI的溶液中，蛋白质带有同 种电荷。pH＞pI，蛋白质带负电荷；pH＜pI，蛋白质带 正电荷。同种电荷相互排斥，阻止蛋白质颗粒相互聚集， 发生沉淀。 蛋白质要沉淀必须去掉水化膜和表面电荷。
Fra Baidu bibliotek 展望
1光散射测定大分子虽然操作简便，反应灵敏，但也有缺陷。(1) 选择性差:由于共振光散射信号反映的是溶液中整体信号，尤其 在本体溶液中，被分析物和共存干扰物质的信号很难被区分开 来。(2)重现性差，抗干扰能力欠佳，散射信号强度受多种因素 影响，比如入射光强度、溶液的pH、离子强度、温度、介质极 性、折光指数和共存物等。 2现在光散射与高效液相色谱联用已有研究，色谱分离技术以 其高分离效率和高选择性的优势，结合光散射检测的灵敏性， 有望生产出更先进的高效液相色谱分析。 3研究出更有效的减弱干扰因素的探针，将是光散射测定的科 研热点。
4 硫酸铵饱和度的选择
光散射测定
光散射测定
由上图得出结论，分别选择硫酸铵饱和度为60%, 60% 和80%作为BSA，HSA和OVA的最优化饱和度。
光散射测定
5 标准曲线的绘制
光散射的测定
小 结
基于共振光散射现象，提出了一种新的定量测定蛋 白质的探针硫酸铵 硫酸铵与蛋白质由于盐析作用，使蛋白质沉淀，从 而引起了体系共振光散射强度的增强。 将本法用于合成样品和实际血清样品中总蛋白的测 定，并将结果与传统的考马斯亮蓝（CBB）法得出的 结果相比较，发现结果的一致性很好。