发酵工程复习

培养基的控制：斜面培养基的主要 材料经化学分析和摇瓶发酵试验合 格后才能用于孢子培养基。 应保证培养基灭菌后的质量。 水份适中有利于孢子生长，因此斜 面培养基使用前应于一定温度下放 置一定时间，使斜面无冷凝水。
供生产用的孢子培养基要用比较单 一的氮源，作为选种或分离用的培 养基则采用较复杂的有机氮源。
4.覆膜氧电极的工作原理
氧气通过透气性的膜渗入电极，在阴极发生还原反应，由于氧化还原反 应产生一定的电流，该电流与被还原的氧成正比，再用变电器把电流值 转换为溶氧值。
用能透过氧分子的薄膜将电极系统与被测定溶液分隔开来，因而避免了 外界溶液的性质及通风搅拌所引起的湍动对测定的影响。
第六章发酵菌种的制备与保藏
发酵工艺学期末整理
王敏敏 龙益如
第七章 发酵过程中的供氧
本章小结
概念：摄氧率、呼吸强度、呼 吸临界氧浓度、搅拌功率。 了解 掌握 1. 影响微生物呼吸临界氧 1. 影响微生物需氧量的因素； 2. 发酵液中氧传递过程中需 要克服的阻力； 3. 影响液相体积氧传递系数 的因素； 4. 搅拌的作用； 5. 溶解氧和Kla的测定方法。 浓度的主要因素 2. 氧在液体中的溶解特性
搅拌功率：搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所 消耗的功率，通常为2～4 KW/m2
问答题： 1.影响微生物需氧量的因素有哪些？并解释其原因。
1.菌种的生理特性 微生物种类:微生物种类不同，其生理特性不同，代谢活动中的需氧量也不同，同样 是需氧菌，细菌、放线菌和真菌的需氧量也不同，一般来说，微生物的细胞结构越简单， 其生长速度就越快，单位时间内消耗的氧就越多。 微生物生长阶段：从菌体的生理阶段看：同一种微生物的不同生长阶段，其需氧量也 不同。从菌体的生长阶段看：菌体生长期的摄氧率大于产物合成期的摄氧率。 2.培养基组成 微生物对不同营养物质的利用情况不同，因而培养基的组成对生产菌种的代谢及需氧 量有显著的影响。碳源的种类和浓度对微生物的需氧量的影响尤为显著；除了碳源物 质直接影响摄氧率外，其他培养基成分，如磷酸盐、氮源对微生物的摄氧率也有一定 的影响。 3.培养液中溶解氧浓度CL 在发酵过程中，培养液中的溶解氧浓度CL＞菌体的C长临时，菌体的呼吸就不受影响， 菌体的各种代谢活动不受干扰；如果培养液中的CL＜低于C长临或C合临时，多种生化代 谢就要受到影响，严重时会产生不可逆的抑制菌体生长和产物合成的现象。 4.培养条件 温度愈适合生长，营养成分愈丰富，其呼吸强度的临界值也相应地增长。最适pH值亦 然。 5.CO2的影响 在发酵过程中，微生物在吸收氧气的同时，也呼出CO2废气，如不及时从发酵液中除 去，势必影响菌体的呼吸，进而影响菌体的代谢活动
衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定 工作，以期菌种的生产性能逐步提高。
菌龄：将菌种接种到某一培养基中群体生长的时间。
种龄：指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或者发酵罐时的培养时间。
从气-液界面至液体液膜阻力，与发酵液的成分和浓度有关。 4)液流阻力（1/K4; 1/KLB）： 液体主流中传递的阻力；与发酵液的成分和浓度有关。
2.耗氧方面的阻力
1）菌丝团周围液膜阻力（1/K5; 1/KLC）：与发酵液的成分和浓度有关。 2）菌丝丛或菌丝团内的扩散阻力（1/K6；1/KA）：与微生物的种类、生理特性状态 有关，单细胞的细菌和酵母菌不存在这种阻力；对于菌丝，这种阻力最为突出。 3）细胞膜的阻力（1/K7;1/KW）：与微生物的生理特性有关。 4）细胞呼吸酶与氧反应阻力（1/K8;1/KR）：氧分子与细胞内呼吸酶系反 应时的阻 力；与微生物的种类、生理特性有关。
3.影响液相体积氧传递系数的因素有哪些？这些因素与Kla有什么关系？ （1）搅拌功率
搅拌转速对KLα 的影响很大，(搅拌比通气速度对KLα 的影响更明显)，对微生物的摄氧 率r也有影响，但对饱和溶氧浓度C*无影响。
（2）空气流速
的空气不经过搅拌叶的分散，而沿着搅拌轴形成空气通道，空气直接逸出发酵罐，此 时搅拌功率不再下降，此时的空气流速称为“气泛点(flooding point)”。此时KLa也 不再增加。
本章小结
• 概念： • 菌种衰退的原因和复壮的方法 • 生产菌种的制备，种子罐级数， 菌龄，接种量，菌种衰退，复壮。 •了解： • 掌握： •种子扩大培养的目的 • 优良种子应具备的条件 •孢子制备和种子制备的过程 • 如何确定发酵级数 •菌种保藏方法的具体步骤 • 影响孢子质量、种子质量的因素 •国内外的保藏机构 • 如何控制种子质量 •菌种衰退的表现 • 种子异常的分析 • 菌种保藏的目的、原理和方法
接种量：在微生物接种过程中，接入种子的体积与接种后培养液的体积之比。
接种：将菌种或种子液接入种子罐或发酵罐的过程。 双种：两个种子罐种子接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
问答题：
1.优良种子应具备的条件
‣ 生长活力强，延滞期短；(接种后在发酵罐中能迅速生长)
‣ 生理形态稳定； ‣ 浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求； ‣ 无杂菌污染，保证纯种发酵； ‣ 生产能力稳定。
3.影响孢子质量的因素控制
1、培养基 a）培养基的原材料的产地、品种、加工方法和用量对孢 子质量都有一定影响。 b）水质波动引起孢子质量不稳定。 2、培养条件 a) 温度 温度过低，菌种生长发育缓慢。 温度过高会使菌丝过早自溶。 b) 湿度 相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量均有影响。放线菌一般 要求相对湿度较低；真菌一般要求相对湿度较高。
KLa随空气流速的增加而增大，当空气流速增加到某一值时，由于空气流量过大，通入
（3）发酵液理化性质 KLa与发酵液的表观黏度η app 成反比，发酵液中添加糖、花生饼粉等有机物质，能降低 KLa。但某些少量的醇、酮和酯反而会使KLa 值提高。 加入电解质，KLa值提高，并随浓度增加而增大。 加入消沫剂，由于分布于气液界面，增大氧传递阻力，使KLa下降，但泡沫的减少又改 善了通气状况，最终会有效的改善发酵液的通气效率。 （4）泡沫 在发酵过程中，由于通气和搅拌的作用引起发酵液出现泡沫。在黏稠的发酵液中形成 的流态泡沫比较难以消除，影响气体的交换和传递。 （5） 空气分布器形式和发酵罐结构 采用鼓泡分布器可提高通气效率，当空气流量增加到一定值时，有无鼓泡器对空气的 混合效果无明显的影响，且多孔鼓泡器易堵塞。 空气流量较大，单孔分布器加之有搅拌器造成发酵液的翻动和湍流，对空气起到了很 好的分散作用。
覆膜溶解氧电极测溶氧浓度
了解：
1.影响微生物呼吸临界氧浓度的主要因素 ① 微生物的种类与培养温度：不同的微生物其呼吸临界氧浓度不同，同 一种微生物在不同的培养温度下其呼吸临界氧浓度也不相同。 ② 微生物的生长阶段：次级代谢产物的发酵过程可分为菌体生长阶段和 产物合成阶段，两个阶段的呼吸临界氧浓度分别以C长临和C合临表示， 随菌种的生物学特性不同，两者表现出不同的关系 ③ 发酵液的理化性质、发酵罐的结构：牛顿型培养液－－无影响。（如 细菌和酵母菌培养液，黏度低）；非牛顿型培养液－－与搅拌器的直 径和转速有关。（如大部分放线菌、真菌培养液，黏度高） 2.氧在液体中的溶解特性 氧在液体中，温度越高溶解度越低，溶液越浓溶解度越低，氧分压越高 溶解度越高。 3.双模理论 氧气的溶解过程是一个由气相进入液相的过程，为实现这一过程，氧气 需要跨过由气-液界面构成的屏障，在界面的一侧有气膜，另一侧为液膜， 氧的溶解需要经过这两层膜才能实现。因此，根据这一模型建立起来的 气体溶解理论称为双膜理论。
2.如何确定发酵级数
n级种子罐——n+1级发酵 发酵级数对发酵影响：1.种子级数少，可简化工艺和控制，减少染菌机会；2.种子级数太少，接种量小，发 酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会；3.级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般 2-4级。4.在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。 影响发酵级数的因素：(1)菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度；(2) 发酵规模，（3）工艺要求，（4） 接种量的影响。 对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。生长较慢的菌种,二级种子罐扩大培养，也称三 级发酵。
此外，发酵罐的结构，特别是发酵罐的高与直径的比值，对氧的吸收和传递有较 大的影响。高位发酵罐，即适当增加发酵罐的高度(D:H=1:7) ，以求增加气-液 接触时间，提高氧的溶解度。 搅拌器组数和间距对溶氧的影响：一般来说，当H/D = 2. 5 时，用多组搅拌器 可提高溶氧系数10%， 当H/D = 4并采用较大的空气流速和较大的功率时，多组 搅拌器可提高溶氧系数25%。 若搅拌器之间相互位置不恰当，则流型和空气分布情况将发生变化，就会引起溶 氧系数的大幅度降低。
4.搅拌的作用
① 使发酵罐内的温度和营养物质浓度达到均一，使组成发酵液的三相系统充分 混合； ② 把引入发酵液中的空气分散成小气泡，增加了气-液间的传质面积“a” ，提 高KLa 值； ③ 增强发酵液的湍流程度，降低气泡周围的液膜厚度和流体扩散阻力，从而提 高氧的传递速率； ④ 减少菌丝结团，降低菌丝丛内扩散阻力和菌丝丛周围的液膜阻力； ⑤ 可延长空气气泡在发酵罐中的停留时间，增加氧的溶解量。 ⑥ 但是，如果搅拌速度过快，由于剪切力增大，会损伤菌丝体，影响菌丝体的 正常代谢，同时还会浪费能源和促进泡沫形成。
名词解释：
生产菌种的制备：即菌种的扩大培养,就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种
接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量 的纯种培养过程。
种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数 菌种衰退：是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 菌种复壮：狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从
5.溶解氧和Kla的测定方法（工业生产）
不停气测定法 需测定通入发酵罐的空气流量和尾气中的氧气含量 摄氧率= 单位时间通入罐内的氧气量-单位时间内发酵罐排出的氧气量 发酵液体积
[空气流量×60/22.4×1000×(0.21-排气中氧含量)]
=
发酵液体积
r KLa = C* - CL
注意：公式中C*是指发酵液中的饱和溶氧浓度，要根据发酵罐中的操作 压力进行折算。
3、斜面培养时间和冷藏时间 a)培养时间 培养时间应控制在孢子成熟阶段，不宜提早或延迟。 b)冷藏时间 对孢子的生产能力有较大影响；冷藏时间越长，生产能力下降越多；原则：宜短不宜长 4、接种量 接种量要求适中（接种后Hale Waihona Puke Baidu落均匀分布整个斜面）。
4.影响种子质量的因素及控制
1、培养基 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大； 各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。 2、pH pH值稳定；选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量。 培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。 3、培养条件 足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量。（前期少，后期多） 搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化 变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。丝状微生物不宜剧烈搅拌。 4、种龄 通常种龄应取菌种处于对数生长期、菌体还未达到最大值时的培养时间为宜。 5、接种量
3. 双模理论
4. 覆膜氧电极的工作原理
名词解释： 摄氧率（r）：单位体积发酵液每小时消耗氧的量，单位为mmol/(L· h)
呼吸强度（QO2 ）：单位重量的干菌体每小时消耗氧的量，单位为
mmol/(g· h)
呼吸临界氧浓度：当溶氧浓度低时，呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加，
当溶氧浓度达某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增加而变化，此时的溶 氧浓度称为呼吸临界氧浓度，以C临界表示。
2.发酵液中氧传递过程中需要克服的阻力
1、供氧方面的阻力
1)气膜阻力（ 1/K1 ;1/KG）： 气体穿越气-液界面的气膜阻力，与空气情况有关。 2)气液界面阻力（1/K2;1/KI）： 只有具备高能量的氧分子才能透到液相中去，而其余的则返回气相。与空气情况有 关。
3)液膜阻力（1/K3; 1/KL）：