分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。
无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2) 高速离心去杂质。
10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离心沉淀。
5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5) 75%乙醇清洗。
加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。
重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6) 核酸洗脱。
加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离心3min，取约600ul上清。
加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。
(5) 溶解DNA。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆技术实验指导
分子克隆技术DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
实验前准备实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。
还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。
本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆部分实验报告
一、实验目的1. 学习分子克隆的基本原理和方法；2. 掌握质粒的提取、纯化、线性化及目的基因的插入等实验操作；3. 熟悉DNA的纯化、鉴定及重组载体的构建等实验技术。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从基因组DNA中分离出来，并在宿主细胞中复制和扩增的过程。
实验过程中，利用限制性内切酶切割目的基因和载体，通过连接酶将二者连接形成重组载体，然后转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pET-28a2. 目的基因：EGFP3. 限制性内切酶：BamHI、EcoRI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA分子量标准：DL20006. DNA纯化试剂盒7. 转化宿主细胞：大肠杆菌DH5α8. LB培养基、氨苄青霉素9. 等等四、实验步骤1. 质粒提取与纯化（1）按照试剂盒说明书提取质粒DNA；（2）用DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA；（3）检测质粒浓度和纯度。
2. 目的基因的线性化（1）用BamHI和EcoRI双酶切目的基因片段和载体；（2）用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物；（3）检测酶切产物浓度和纯度。
3. DNA连接（1）将纯化的目的基因片段和载体进行连接反应；（2）将连接产物转化大肠杆菌DH5α；（3）在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养转化菌。
4. 阳性克隆的筛选（1）提取转化菌的DNA；（2）用BamHI和EcoRI双酶切提取的DNA；（3）电泳检测酶切产物，筛选出与预期大小相符的重组质粒；（4）将重组质粒进行测序验证。
五、实验结果与分析1. 质粒提取与纯化：质粒浓度约为50ng/μl，纯度大于0.8。
2. 目的基因的线性化：酶切产物浓度约为10ng/μl，纯度大于0.8。
3. DNA连接：转化菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长良好。
4. 阳性克隆的筛选：电泳结果显示，重组质粒大小与预期相符。
5. 重组质粒测序验证：测序结果与预期序列一致，表明目的基因已成功插入载体。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
生物研究方法
生物研究方法生物学作为自然科学的一个重要分支，主要研究生命体的结构、功能、进化等方面的问题。
在开展生物学研究过程中，合理选择和应用适宜的研究方法至关重要。
本文将介绍10种常见的生物学研究方法，并对其进行详细描述。
1. 细胞培养法细胞培养法是一种通过体外维持活的细胞的方法。
在细胞培养中，细胞被置于含有营养物质的培养基中，维持其生长繁殖，并可用于观察和控制细胞的过程。
此方法广泛应用于生命科学及医学领域，被广泛应用于药物筛选、细胞生物学、免疫学、分子生物学等方面的研究中。
2. 分子克隆法分子克隆法是一种通过构建基因工程技术进行分子重组的方法。
该方法通过重复操作，将特定的基因分离、扩增、重组到载体中，构建到表达系统中，从而进行相关研究。
分子克隆技术具有重要的生物学研究应用价值，如基因挖掘、蛋白结构解析、基因组学及药物研发等方面。
3. 蛋白质分离与纯化法蛋白质分离与纯化法是一种将混合的蛋白质物质分离开来，并提高纯度的方法。
这种方法可以通过物理和化学方法，如凝胶电泳、电子显微镜、柱层析等，分离目标蛋白质，并提高其纯度。
该技术广泛应用于生命科学及医学领域，如药物制剂、蛋白质互作定位、酶催化机理研究以及研制治疗性蛋白质等方面。
4. 免疫印迹法免疫印迹法是一种检测、鉴定特定蛋白质的方法。
该方法主要通过对蛋白溶液进行电泳分离，并用对应的抗体进行检测，为研究某些蛋白质的分子机制、生物学功能、结构与功能等方面提供了重要的方法。
5. 定量PCR法定量PCR法是一种重要的分子生物学实验方法，其主要办法是利用荧光探针，通过定量分析模板DNA的扩增速率和PCR产物的含量，来确定DNA、RNA等模板分子在混合物中的相对数量。
该技术被广泛应用于基因表达、基因副本数检测、微生物检测以及病毒载量监测等方面。
6. 数据挖掘法数据挖掘法是一种用于提取生物学数据背后的统计信息和模式的方法。
通过使用机器学习技术，如神经网络、支持向量机、随机森林等，对数据进行分析和模式识别，可以得到特殊的生物学功能，例如鉴定蛋白质功能相关性、预测靶标物分子等方面。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程分子克隆是将DNA分子从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
这种技术广泛应用于生物学研究和生物工程领域。
下面将详细介绍分子克隆的实验流程。
1.提取DNA首先，需要从源生物体中提取所需的DNA。
这可以通过不同的方法来完成，例如琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR和基因组DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要是目标基因的完整、纯净的样本。
2.回收DNA片段将提取的DNA片段和载体（例如质粒）切割，以回收想要克隆的DNA 片段。
常用的酶剪切酶包括限制性内切酶和退火酶。
将酶切割后的DNA片段与载体的切割端黏合，形成重组DNA。
3.转化纯化将重组DNA转化到宿主细胞中。
通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
这可以通过脉冲电击、热激转化或化学转化来实现。
这一步的目的是将重组DNA导入到宿主细胞中，以便宿主细胞可以复制和表达克隆的DNA。
4.鉴定克隆细胞通常，我们通过选择性培养、荧光染色、PCR检测等方法来鉴定具有克隆DNA的细胞。
在选择性培养基上生长可以表明细胞成功地接受了重组DNA。
此外，如果重组DNA带有可观察的荧光标记，可以使用荧光显微镜进行观察。
PCR检测可以验证目标基因的存在。
5.扩增克隆细胞选取鉴定出的克隆细胞进行扩增。
这可以通过将克隆细胞培养在含有选择性抗生素的培养基上来实现。
只有带有插入DNA的细胞可以在这种培养条件下生存。
选择性培养的目的是增加克隆细胞的数量，以便后续的实验。
6.提取插入DNA从扩增的克隆细胞中提取含有插入DNA的重组质粒。
通常使用薄膜过滤法将细菌细胞去除，然后使用DNA提取试剂盒从细菌残渣中提取质粒。
提取的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化和鉴定。
7.鉴定插入DNA使用不同的试验方法来鉴定插入DNA的准确性和完整性。
这可能包括核酸测序、酶切鉴定、PCR扩增等。
通过这些方法可以验证克隆的DNA是否与目标基因的序列完全一致。
8.进一步应用得到插入DNA后，可以进行进一步的应用，例如重组蛋白表达、基因改良、产生转基因生物等。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆是现代生物学领域的一项核心技术，也是基因研究、药物研发和农业开发过程中必不可少的手段之一。
在这篇指南中，我将会简要介绍如何进行分子克隆实验，以帮助初学者更好地理解、掌握这项技术。
同时，我也建议实验者在进行实验前，详细阅读当地的安全操作规程，并在合适的实验室环境中进行操作。
一、材料准备在进行分子克隆实验前，我们需要准备以下材料和试剂：1. DNA的扩增产物和载体DNA2. 限制性内切酶3. T4 DNA连接酶4. 细菌菌种5. 热激酶6. 磷酸缓冲液7. 离心管、PCR管、琼脂糖凝胶和电泳槽等相关实验器材。
二、实验步骤1. PCR扩增将目标DNA扩增出来，制备扩增产物。
同时，也需要提纯产物，将其溶于蒸馏水中，以备后续操作。
2. DNA限制性内切酶切割选择两种限制酶，将目标DNA和载体DNA分别切割。
切割产品应该能够被T4 DNA连接酶形成连接。
在T4 DNA连接酶形成连接的基础上，我们需要将其转化到大肠杆菌等细菌中进行培养。
3. DNA连接将切割后的DNA和载体DNA混合，加入T4DNA连接酶，进行DNA连接。
连接成功后，进行质粒的转化操作。
4. 质粒转化将DNA与转化者（例如大肠杆菌）一起培养几个小时，使其在培养基中繁殖生长。
之后，分离转化菌落，进行鉴定。
5. 鉴定正式的及相关标签元素为了确保成功的分子克隆，在选取符合需要的转化菌落后，除了进行相关的鉴定，还需要使用相关的标签元素。
这些标签元素可以用于识别有效的重组表达载体，并进行大规模的表达。
三、实验注意事项1. 选取嵌合体目标和载体的选择应按照相关配对的要求进行。
在酶切反应中，应注意酶的用量。
同时，也需要注意处理过程中不要将酶污染。
2. 进行DNA限制性内切酶切割时，应注意温度和反应时间。
3. 在进行DNA连接后，将混合物放置于水浴中，沸腾数分钟，以便DNA连接的更加稳定。
在连接DNAs之前，应该对酶进行热灭活。
4. 质粒转化后，为了鉴定高效的表达，需要进行多次筛选和鉴定。
克隆实验细则
准备：1、瓶子、量筒、钥勺、天平、摇床等；2、50ml离心管、1.5mL的离心管，125uL的PCR管、各种枪头、培养皿；3、超净工作台、酒精灯、蜡带封口膜、铝箔。
LB培养基：（1L)胰化蛋白胨：10g，Tryptone酵母提取物：5g，yeast extractNaCl：10g放好药品（100mL的培养基，加入200uL的20mg/mL的X-Gal，50uL的50mg/mL的IPTG,50uL 的100mg/mL的Amp以后，振荡均匀，高压蒸汽灭菌120℃(注意：高压灭菌，瓶盖要松，用胶带黏住两端），22min。
在60℃时，转紧瓶盖，拿出置于实验台上。
固体培养基：LB固体培养基1L,和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度下降到55℃之前加好抗生素，并且倒板。
LB固体培养基倒板：1、配制：1000mL培养基加入1.5g琼脂粉。
2、抗生素的加入：高压灭菌锅后，待温度降到60℃，将培养基拿出置于超净工作台中，大概降到55℃（手可以触摸加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并且充分摇匀。
3、倒板：一般10mL到1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外灯下照10—15min。
4、保存：用封口胶封边，并倒置用铝箔包裹放于4℃保存，一个月内使用。
一般克隆实验：超净工作台开启紫外提前半个小时1、 DNA目的片段:T-vector： 0.5uL①DNA : 4.5uL③2、加入5uL SolutionI ②（离心）。
（注意步骤1和2：在冰上操作，慢慢加入，因为不稳定）3、 16℃反应1h左右，如果目的片段太长，可以延长时间。
（零下20℃保存）。
4、 10uL上述体系中然后和50uL大肠杆菌感受态cell，冰上静置30min，不可剧烈振动。
(同时开启水浴锅，将SOC液体培养基放置在37℃烘箱中待用）5、 42℃水浴1min后，冰上静置1min。
6、将55uL的上述混合液体加入到500uL的SOC液体培养基中，摇床摇菌，37℃，振荡培养基1h或者1h以上（180r）。
分子克隆与表达实验
分子克隆与表达实验流程1.选取菌株从保存的海冰细菌中随机选取某几株，挑取其单菌落于发酵培养基（2216）活化培养，1d后将活化的菌株5ml接入70ml发酵培养基中，12℃，100rpm摇床培养，大约4~5d后对菌株在4℃下，12000rpm进行离心，收集菌体，于4℃保存。
2.提取菌株全基因组在超净工作台上取120μl离心后的菌株悬浮于400μl的1×TE缓冲液中，加入10%SDS 100μl和2mg/mL的溶菌酶20μl，混匀后置于37℃保温1h，加入5M 的NaCl 70μl充分混匀，置于65℃水浴10min，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，离心（12000rpm、8min），取上层水相于新离心管中并加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）充分抽提，取上层水相加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70%的乙醇淋洗两次，倾去乙醇，真空干燥后溶于25μl的1×TE缓冲液。
对全基因组进行电泳检验，其余的置-4℃冰箱保存备用。
3.根据目的蛋白设计引物本实验研究的是小分子蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）、硫氧还蛋白（Trx）和谷氧还蛋白（Grx）。
根据这三种蛋白的基因用Primer5设计引物。
引物名称与序列引物名称引物序列，方向5′——3′合成规格(OD)GST1(1) TTTATGGYGTMCCKCTTTCTC 2GST1(2) CA TGCTSCA TATTSATTAWCTG 2GST2(1) AGTSTCGCCGTTTAATCAACC 2GST2(2) YKCATY AAKYTGCTCRCCMSC 2GST3(1) TTTA TGGCGTACCTCTTTCTCC 2GST3(2) CGGTAA TACCTAACTGCTCAGC 2GST4(1) TCTGTTACCTCGCCTTAT 2GST4(2) AAAGCCA TTATCTTCTGC 2GST5(1) ACTTA TTTGGAGCA TTGAGCGG 2GST5(2) TCGGCGGTTCAAGAAAAG 2Trx1(1) AAGAATTCA TGAGCGAGAAAATAATCC 2Trx1(2) CGCAAGCTTTTAAAGA TTGTTTTCTA 2Trx2(1) AAGAATTCA TGAGCGAGAAAATAATC 2Trx2(2) CTCAAGCTTTTAGA TGTTGTTTTCTA 2Trx3(1) CGGAGAGCCA TA TGAGCGAGAA 2Trx3(2) TTGTTTAAATCTCGAGATTGTTTTCT 2Grx1(1) GTGTTATCTGGTGGTA TGG 2Grx1(2) TTGTGCTGCTGCGTTTTG 24.PCR扩增以菌株的全基因组为模板，对上述引物进行PCR，从中寻找含有目的基因的菌株，对含有目的基因的菌株进行验证并保种。
分子克隆技术的操作流程
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分子克隆组装实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习分子生物学中最基本的技术——分子克隆的操作过程。
2. 掌握基因克隆的概念，了解基因克隆的基本原理和方法。
3. 熟练掌握DNA提取、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定等分子克隆实验操作。
4. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因（或DNA片段）与载体DNA连接，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
本实验采用分子克隆组装技术，将目的基因插入载体中，实现基因克隆。
三、实验材料1. 基因组DNA提取试剂盒2. 限制性内切酶3. DNA连接酶4. 载体DNA5. 目的基因片段6. 转化宿主细胞7. LB培养基、琼脂糖、氨苄青霉素等四、实验步骤1. 提取目的基因片段和载体DNA（1）取适量基因组DNA，按照试剂盒说明书进行提取。
（2）取适量载体DNA，按照试剂盒说明书进行提取。
2. 限制性内切酶切割（1）将目的基因片段和载体DNA分别用限制性内切酶进行切割。
（2）酶切反应体系：10×酶切缓冲液5μl，限制性内切酶1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至50μl。
（3）酶切条件：37℃反应2小时。
3. DNA连接（1）将酶切后的目的基因片段和载体DNA进行连接。
（2）连接反应体系：10×连接缓冲液5μl，DNA连接酶1μl，酶切后的目的基因片段5μl，酶切后的载体DNA5μl，加双蒸水至50μl。
（3）连接条件：16℃反应4小时。
4. 转化宿主细胞（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
（2）转化条件：42℃热激45秒。
5. 筛选和鉴定（1）将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。
（2）挑取单克隆菌落，提取质粒DNA。
（3）对提取的质粒DNA进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体。
（4）对阳性克隆进行测序，验证插入序列的正确性。
五、实验结果1. 成功提取目的基因片段和载体DNA。
2. 目的基因片段和载体DNA经限制性内切酶切割后，酶切图谱与预期相符。
分子克隆实验指南引用
分子克隆实验指南引用分子克隆，听起来是不是很高大上，其实它就像是科学家们的拼图游戏。
想象一下，实验室里各种试管、培养皿，气氛热火朝天，简直像个疯狂的厨师在调制特制的“分子大餐”。
今天咱们就来聊聊这门看似复杂但其实充满乐趣的技术。
要说分子克隆，咱们得知道，它其实就是把特定的DNA片段“复制”到另一个载体里，像是把心爱的照片放进相框。
你可能会问，为什么要这样做呢？好吧，想象一下，你有一张绝世好照片，想给好朋友分享，当然得好好保存，不然可能就被风吹走了。
在分子克隆的过程中，首先得从目标生物中提取DNA。
这一步就像是找到了一块宝藏，得小心翼翼地挖掘出来。
提取的过程可能会让人觉得像是做实验的“魔法”，各种试剂的加持，DNA就像小精灵一样被召唤出来。
哇，这时候你可不能掉以轻心，得确保你的操作稳稳的，避免那些可恶的污染，真是让人抓狂的事。
咱们要用限制酶来切割DNA，听起来是不是有点像下厨时剁菜？其实就是把大块的DNA“切”成合适的小块，方便后续的拼接。
然后，再把这些小片段连接到载体上，载体就像个可爱的“家”，让DNA片段能在其中安稳扎根。
连接的过程就像是把不同的乐器组合成一支和谐的乐队，咱们的DNA片段就是主唱，载体则是默默支持它的乐手。
然后，转化过程来了，想象一下把这支乐队送到一场大型音乐会上。
通过转化，咱们把载体连同DNA片段转入细菌中，真是个大动作。
细菌们就像是新来的“小伙伴”，它们会开始繁殖，把这个新来的“主唱”带进自己的基因组里。
哎呀，这过程真是紧张又激动，心里小鹿乱撞的感觉。
在这个过程中，咱们还得筛选出成功的转化菌株，真是个挑战。
想象一下，你得从一大堆小伙伴中找出那几位特别出色的，简直是给自己增添了不少麻烦。
你可能会用抗生素来筛选，这就像是给小伙伴们设定了一个小门槛，只有表现最好的能留下来，真是个智慧的考验。
好，成功筛选后，咱们就可以大展身手，开始分析和验证了。
通过测序，你能知道自己拼的这块“拼图”是不是完美无瑕，能不能在科学的舞台上大放异彩。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
常用分子克隆实验方法-推荐下载
常⽤分⼦克隆实验⽅法-推荐下载常⽤分⼦克隆实验⽅法I⼀、植物总DNA的⼩量提取⽅法1：提取吸附法。
⽆须巯基⼄醇、氯仿等有毒物质，产物⽆须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加⼊液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨⾄略粘稠的组织匀浆，⽤⼤⼝1ml吸头将所有溶液移⾄1.5ml离⼼管中，55℃⽔浴30min；(2) ⾼速离⼼去杂质。
10,000rpm离⼼5min，取约600ul上清⾄新1.5ml离⼼管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加⼊1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加⼊总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离⼼沉淀。
5000rpm离⼼1min，轻轻倒掉上清，并⽤吸⽔纸轻吸离⼼管⼝，再⽤移液枪吸⾛⼤部分残余液体；(5) 75%⼄醇清洗。
加⼊1ml75%⼄醇，5000rpm离⼼30s，轻轻倒掉上清，⽤吸⽔纸稍吸离⼼管⼝。
重复该步骤⼀次，再5000rpm离⼼30s，然后⽤移液枪吸⾛管底的残液，晾⼲5min；(6) 核酸洗脱。
加⼊约55ul TE（PH8.0）⾄管底，轻轻重悬硅⼟，静置3min，10,000rpm离⼼1min，⽤⼩枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
⽅法2：CTAB法，此为在经典⽅法基础上，经过摸索改进，提⾼了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加⼊液氮充分研磨3-5min，稍后加约1mlCTAB提取液，继续研磨⾄略粘稠的组织匀浆，⽤⼤⼝1ml吸头移⾄1.5ml离⼼管，65℃⽔浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离⼼3min，取约600ul上清。
加⼊1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离⼼3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加⼊预冷的1倍异丙醇或2倍⼄醇，轻混匀，6000rpm离⼼3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加⼊1ml 75%⼄醇，再吸掉上清，重复⼀次，倒置于吸⽔纸或横放于离⼼管架上晾⼲5min。
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分子克隆及细胞培养基本实验方法1.载体构建实用操作技术1.1菌种的保存—20%甘油菌2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。
（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可）1.2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。
方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。
1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase）⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化）⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。
1.4酶切反应⑴体系构成（反应体系尽可能小！）pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）①dd.H2O 17 17②10×NEbuff 2 3 3③10×BSA 3 3④底物DNA 5 5⑤内切酶HindⅢ 1 1XbaⅠ 1 1Total : 30 ul 30ul⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全⑷65℃灭活内切酶⑸-20℃保存备用1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol）⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重；⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ulQG /100mg）；⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似；⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。
此步不离心。
DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量；⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）；⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm，1min，以去除剩余的乙醇；⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min；⑻-20℃保存备用。
1.6连接反应⑴体系构成（反应体系20ul，载体：目的片段=1：3-5，摩尔数比）反应组份数量（ul）①dd.H2O 8②T4 10×buff 2③载体ＤＮＡ（ul） 1目的片段（ul）8④T4DNA连接酶 1Total : 20 ul⑵16℃水浴12-16小时（过夜）⑶直接用于转化或-20℃保存备用1.7感受态细胞的制备⑴菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加Amp），37℃振摇4-6 hr，至中对数期；⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4℃，4 000-6 000rpm）收菌；⑶弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴10min，离心（4℃，4000-6000rpm）；⑷再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴，12-24hr可用。
菌体沉淀时，重悬操作要轻。
1.8转化⑴新鲜感受态细胞200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min；⑵42℃热休克90sec，勿摇动试管，再冰浴2min；⑶加入液体LB培养基（无抗生素）800ul，37℃温和振摇45-60min；⑷离心4000-6000rpm，2min，弃去900ul上清；⑸剩余物重悬细菌，铺Amp板，平放20min，倒置培养10-14hr。
1.9鉴定重组子常规PCR法鉴定重组子（25ul反应体系，1ul菌液）或抽提质粒DNA酶切鉴定。
⑴PCR反应体系：试剂数量终浓度①dd.H2O 17.5 ul②10×PCR缓冲液 2.5 ul 1×③MgCl2（25mM） 1.5 1.5 mM④dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM⑤上游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM下游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM⑥TaqDNA聚合酶(3U/ul) 0.5 ul 0.06U/ul⑦模板（菌液）1ul终体积25ul⑵PCR反应参数：94℃，5min；“94℃，30sec、50℃，30sec、72℃，1min”×20-30循环；72℃，6min；4℃，保存备用；⑶电泳鉴定，以挑选阳性重组子，注意阳性、阴性对照的设立。
2.大规模制备质粒DNA（QIAGEN Plasmid Maxi Protocol ）适于从100~250ml 菌液中制备100-200 ug高拷贝质粒⑴涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37℃振摇8hr后，取适量菌液（1/500-1/1000）入100-250ml LB选择性培养基（高拷贝100-250ml LB，低拷贝500ml LB），37℃振摇12-16hr；⑵收获菌液，4℃离心6 000rpm（6 000g）１5min，弃尽上清；注意：在此步可将菌（离心沉淀）冻存于-20℃，留待以后操作。
⑶以10ml P1重悬细菌（P1中已加RNase）；⑷加入10ml P2，颠倒4~6次轻混，室温放置5min（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化）；⑸加入冰预冷10ml P3，迅速颠倒4~6次轻混，冰上放置20min，以促进沉淀形成；⑹4℃离心13 000rpm（20 000g以上）30min（离心前，应再次混合样品）；上清入新管，再次离心13 000rpm（20 000g以上）15min；⑺第二次离心的同时，用10ml QBT缓冲液平衡QIAGEN柱，不需离心（重力引流）；⑻结合：快速移上清（第二次离心）入QIAGEN柱，使其在重力引流下进入树脂（resin）；⑼清洗：30ml QC洗2次（重力引流）；⑽洗脱：15ml QF缓冲液洗脱结合的DNA，将洗脱液收集入新管（可将洗脱液暂时存放于4℃数小时）；⑾沉淀：加入10.5ml 异丙醇（室温，以免增加盐沉淀），混匀，立刻于4℃离心9 500rpm（15 000g）30min（离心前在管底作好标记，此步重要！），小心缓慢地倒出上清（以免弃去DNA沉淀）；注意：此步如果DNA沉淀不可见，可以1.5ml 75%乙醇冲洗管底标记处，然后转移至1.5ml离心管，15 000 rpm（20 000g）30min，此时沉淀往往可见，可重复此步骤1次，以收集尽可能多的质粒DNA⑿再清洗：5ml 70%乙醇（室温，以免增加盐沉淀）洗，离心9 500rpm（15 000g）10min，小心缓慢地倒出上清；⒀空气中干燥沉淀5-10min ，以适当体积的TE,pH8.0 或10mM Tris-Cl, pH8.5 溶解DNA沉淀（注意冲洗管壁，过度吹打会剪切DNA应避免）；⒁琼脂糖凝胶电泳分析；⒂质粒DNA浓度测定（紫外分光光度仪），OD260/OD280=1.6~1.8。
3.细胞培养常规方法3.1 293细胞常规复苏、培养、传代及冻存⑴培养液配制：DMEM，加入NaHCO2 3.7g/L，庆大霉素8万u，调pH至7.0-7.2（比细胞生长所需终末pH低0.2-0.3），定容至1L，0.22um过滤分装即可；⑵293生长要求：DMEM，含2-10%的FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同）；⑶293细胞的复苏：取液氮中冻存的细胞1管，迅速置37℃水浴1-3min融化；转移至10ml离心管加入8ml DMEM 10%，轻轻吹打混匀，低速离心1000rpm，5min；弃上清，加入8ml DMEM 10%重悬细胞；转入25ml 培养瓶补足培养液，置CO2孵箱37℃、5% CO2培养；⑷293细胞的培养：DMEM 10%；⑸293细胞的传代（1：2-3）：弃培养液，NS或无血清培养液洗1-2次，加入适量（数滴，或1-3ml；按培养的293细胞代数而定，代数低时，胰酶适当多加，反之，可能数滴即可）0.25%胰酶消化液，37℃消化1-3min，镜下观察消化情况，待细胞变圆、脱离瓶壁时，轻轻拍打瓶壁，使细胞完全脱离，加入适量培养液轻轻吹打使之分散；转入10ml 离心管，低速离心1000rpm，2-5min；弃上清，加入适量DMEM 10%重悬细胞；转入适当大小培养瓶（1：2-3）并补足培养液，置CO2孵箱37℃、5% CO2培养；⑹293细胞的冻存：取生长对数期的培养细胞，常规消化、离心，细胞沉淀以1-2mlDMEM 10%重悬，计数；重悬细胞10% DMSO、40% FBS，以DMEM 10%补足体积，细胞终浓度为1×106/ml；转入冻存管1.5ml/Tube，封口膜封口，置-80℃冰箱24hr；次日将细胞转入液氮，长期保存。
3.2 L-O2细胞的培养⑴L-O2细胞生长要求：DMEM/1640（1：1）混合培养液，含5-10%的FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同）；⑵L-O2细胞的传代：比例1：3-5；⑶余基本同293细胞。
3.3细胞计数法⑴染色：常规消化、离心，弃上清，加入1或2ml培养液，轻轻吹打重悬细胞，吸20ul细胞悬液，加入760ul NS，加入20ul台盼蓝，混匀，置2-3min；⑵计数板：用96%酒精冲洗计数板后，用擦镜纸擦净，另擦净盖玻片1张，把盖片覆在计数板上，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；⑶加稀释液：滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；⑷镜检：计算四大方格内细胞数，压中线者只计算左线和上线者；⑸计算公式：细胞数=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数；本法：细胞数=4大格细胞总数×105；⑹按培养要求接种培养。