分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法

1.载体构建实用操作技术

1.1菌种的保存—20%甘油菌

2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可）

1.2甘油菌复苏、培养

方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp

的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。

方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。

1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）

适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒

⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清

⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase）

⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免

长时间消化）

⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm

⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之

⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒

⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分

⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。

1.4酶切反应

⑴体系构成（反应体系尽可能小！）

pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17

②10×NEbuff 2 3 3

③10×BSA 3 3

④底物DNA 5 5

⑤内切酶HindⅢ 1 1

XbaⅠ 1 1

Total : 30 ul 30ul

⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时

⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全

⑷65℃灭活内切酶

⑸-20℃保存备用

1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol）

⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重；

⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul

QG /100mg）；

⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，

胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似；

⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物

量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量；

⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）；

⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平

端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm，

1min，以去除剩余的乙醇；

⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴

于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min；

⑻-20℃保存备用。

1.6连接反应

⑴体系构成（反应体系20ul，载体：目的片段=1：3-5，摩尔数比）

反应组份数量（ul）

①dd.H2O 8

②T4 10×buff 2

③载体ＤＮＡ（ul） 1

目的片段（ul）8

④T4DNA连接酶 1

Total : 20 ul

⑵16℃水浴12-16小时（过夜）

⑶直接用于转化或-20℃保存备用

1.7感受态细胞的制备

⑴菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加Amp），37℃振摇4-6 hr，至中对数

期；

⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4℃，4 000-6 000rpm）收菌；

⑶弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴10min，离心

（4℃，4000-6000rpm）；

⑷再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴，12-24hr可用。菌体

沉淀时，重悬操作要轻。

1.8转化

⑴新鲜感受态细胞200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min；

⑵42℃热休克90sec，勿摇动试管，再冰浴2min；

⑶加入液体LB培养基（无抗生素）800ul，37℃温和振摇45-60min；

⑷离心4000-6000rpm，2min，弃去900ul上清；

⑸剩余物重悬细菌，铺Amp板，平放20min，倒置培养10-14hr。

1.9鉴定重组子

常规PCR法鉴定重组子（25ul反应体系，1ul菌液）或抽提质粒DNA酶切鉴定。

⑴PCR反应体系：

试剂数量终浓度

①dd.H2O 17.5 ul

②10×PCR缓冲液 2.5 ul 1×

③MgCl2（25mM） 1.5 1.5 mM

④dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM

⑤上游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM

下游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM

⑥TaqDNA聚合酶(3U/ul) 0.5 ul 0.06U/ul

⑦模板（菌液）1ul

终体积25ul

⑵PCR反应参数：

94℃，5min；

“94℃，30sec、50℃，30sec、72℃，1min”×20-30循环；

72℃，6min；

4℃，保存备用；

⑶电泳鉴定，以挑选阳性重组子，注意阳性、阴性对照的设立。

2.大规模制备质粒DNA（QIAGEN Plasmid Maxi Protocol ）

适于从100~250ml 菌液中制备100-200 ug高拷贝质粒

⑴涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37℃振摇8hr后，取适量菌液

（1/500-1/1000）入100-250ml LB选择性培养基（高拷贝100-250ml LB，低拷贝500ml LB），37℃振摇12-16hr；

⑵收获菌液，4℃离心6 000rpm（6 000g）１5min，弃尽上清；

注意：在此步可将菌（离心沉淀）冻存于-20℃，留待以后操作。

⑶以10ml P1重悬细菌（P1中已加RNase）；

⑷加入10ml P2，颠倒4~6次轻混，室温放置5min（轻混以免剪切基因组DNA，

并免长时间消化）；

⑸加入冰预冷10ml P3，迅速颠倒4~6次轻混，冰上放置20min，以促进沉淀形