碱性蛋白酶活力分析方法研究_张剑
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
向另外 3 支试管内分别加入 0. 4 mol·L － 1 的三氯 乙酸溶液 2 mL，充分摇匀，使反应停止，过滤，除去沉
·193·
开发与应用
日用化学工业
第 42 卷
淀的酶蛋白和酪蛋白。 从每一支反应完毕的试管中取滤液 1 mL 分别注
入 4 支新试管中，各管加入 0. 4 mol·L － 1 的碳酸钠溶 液 5 mL，混匀后室温放置 10 min； 然后在各试管中加 入福林酚试剂 1 mL，每滴加一滴试剂必须立即混匀， 在40 ℃ 水浴保温 20 min 显色，用分光光度计在之前 所查阅最大吸收波长处读取吸光度。 1. 3. 3 酶活力计算
的应用，发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现较大偏差，酶活力值不稳定。因此，在配制加酶液体
洗涤剂时，应该对各种因素，例如温度、pH 以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑。
关键词： 蛋白酶； 活力分析； 福林法； 液体洗涤剂
中图分类号： TQ925 + . 2
文献标识码： A
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
UV － 2602 型 紫 外 可 见 分 光 光 度 计，尤 尼 柯 （ 上 海） 仪器有限公司； Z － 561 型电热恒温水浴锅，上海胜 启仪器仪表有限公司； AL204 分析天平，梅特勒 － 托利 多仪器（ 上海） 有限公司。碱性蛋白酶，市售； 福林酚 试剂，上海荔达生物科技有限公司； 洗衣液 1 和洗衣液 2，均为市售； 无水碳酸钠（ AR） 、三氯乙酸（ AR） 、四硼 酸钠（ AR） 、氢氧化钠（ AR） 、磷酸二氢钠（ AR） 、磷酸氢 二钠 （ AR ） 、盐 酸 （ AR ） 、干 酪 素 （ BR ） 、L － 酪 氨 酸 （ BR） ，均为市售。
酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生， 是一种具有催化作用的物质。蛋白酶类制剂是最早也 是得到最广泛使用的洗涤剂酶品种［1］，主要应用于衣 物洗涤剂和洗碗机专用洗涤剂中。蛋白酶能够促进去 除衣领和袜子附着的皮肤角质层污渍、血渍、人体分泌 物和含蛋白质的食物渍，而且衣物上蛋白质黏附的其 他污垢，在蛋白污垢被分解的同时也随之脱落［2］。现 在洗涤剂中使用的蛋白酶，主要为碱性蛋白酶。碱性 蛋白酶是指在 pH 为碱性的条件下水解蛋白质肽键的 酶类，其最适 pH 一般在 9 ～ 11 这一区间，属内肽酶中 的丝氨酸蛋白水解酶类［3］。
1. 3 分析测定
经查阅文献，得知酶促反应结束后溶液最大吸收 波长为 680 nm。 1. 3. 1 吸光常数测定
称取 1 g 酪 氨 酸 （ 预 先 在 105 ℃ 烘 箱 内 烘 至 恒 量） ，以 1 mol·L － 1 的盐酸溶解后定容到 100 mL，再用 水稀释 100 倍，即得到 100 mg · L － 1 的酪氨 酸 溶 液。 按照表 2 所示配制出质量浓度（ ρ） 梯度系列标准液。
开发与应用
耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。因此，迄 今为止国际上碱性蛋白酶活力的测定，尚无一个统一 的评价方法和单位，这也间接地影响到了碱性蛋白酶 在工业界的进一步推广和使用。
作者通过福林法测定酶活力，具体步骤是在测定 酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪 氨酸反应，以 吸 光 度 为 横 坐 标，以 酪 氨 酸 浓 度 为 纵 坐 标，得到标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林 酚试剂作用，测其吸光度，再在标准曲线上推算出相当 于多大浓度的酪氨酸，计算出酶活力单位。在测定酶 活力实验完成后，探究反应条件对酶活力的影响： 将酶 促反应的温度分别设置到等间距温度，采用相同方法 测定酶活力的相对大小，从而测出蛋白酶最适反应温 度； 接着将酶促反应的 pH 分别设置在等间隔数值，亦 采用相同方法测定不同 pH 下酶活力的大小，即可求 得蛋白酶最适 pH［5］。并进一步探索了该方法在液体 洗涤剂酶活力测试中的具体应用。以期今后在对碱性 蛋白酶进行活力测定时能快速择出最佳测试手段，从 而可提升以后测定过程的准确性并为碱性蛋白酶在工 业中的使用提供有效依据。
1. 2 溶液的配制
Na2 HPO4 － NaH2 PO4 缓冲溶液： 按表 1 所示配方 配 制，a 为 0. 2 mol·L － 1 的 Na2 HPO4 溶 液，b 为 0. 2 mol·L － 1 的 NaH2 PO4 溶液。
表 1 缓冲溶液配方
Tab. 1 Buffer solution formulation
ρ / （ mg·L － 1 ） 0 10 20 30 40 50
1. 3. 2 蛋白酶活力测定 福林法： 取 4 支试管，每管中加入酶液 1 mL，第 1
管作为对照（ 在同样条件下，将酶以外的种种因素所 引起的变化，如底物、试剂等本身所产生的颜色称为空 白，在此时用管调节分光光 度 计 的 吸 光 度 为“0 ”，使 其 他 3 管在分光光度计上读得的吸光度值直接代表酶的 活力） 。在第 1 支试管中加入 0. 4 mol·L － 1 的三氯乙 酸溶液 2 mL，使酶在没有遇到底物时已失去活性。在 4 支试管内各加入 1 mL 酪蛋白溶液（ pH = 7） ，将 4 支 试管同时放入 40 ℃ 水浴准确保温 10 min。
酶溶液： 取 1. 0 mL 液体蛋白酶加入 100 mL 容量 瓶中，用 pH = 10. 5 的缓冲液稀释至刻度，摇匀，再从 中取 1. 0 mL 溶液加入 100 mL 容量瓶中，用同此 pH 的缓冲液稀释至刻度，摇匀，在室温下放置 1 h，即为稀 释 100 × 100 倍的酶液。在做 pH 影响的试验中，酶液 应该选用所需的 pH 缓冲液稀释。
DOI:10.13218/j.cnki.csdc.2012.03.017
第 42 卷第 3 期 2012 年 6 月
日用化学工业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 42 No． 3 June 2012
碱性蛋白酶活力分析方法研究
张 剑，赵雷敏，康林霞
（ 山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006）
摘要： 通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定。研究比较了不同温度及 pH 下的酶促反应对酶活力测定方法
的影响，结果显示： 酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降，40 ～ 50 ℃ 时相对较稳定； pH 降低对碱性蛋白酶活力
有着负面影响。在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后，进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中
表 2 酪氨酸质量浓度梯度系列标准液 Tab. 2 Series of standard solution of tyrosine mass concentration
gradient
编号 1 2 3 4 5 6
V（ 酪氨酸） / mL 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5
V（ 水） / mL 5 4. 5 4. 0 3. 5 3. 0 2. 5
文章编号： 1001 － 1803（ 2012） 03 － 0192 － 04
Study on alkaline protease activity assay
ZHANG Jian，ZHAO Lei － min，KANG Lin － xia
（ College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi University，Taiyuan，Shanxi 030006，China）
蛋白酶制剂作为一种生物催化剂，测定其酶活力
值是研究酶的特性及其应用的先决条件。早期文献 中，酶的活 性 以 任 意 各 种 形 式 来 表 示，如 吸 光 度 的 变 化、还原基团的增加，以 mg 或 μg 表示的被转化底物 的质量。这些参数和各种时间单位（ 如 1 min，30 min） 相关联。1961 年世界生物化学协会酶学委员会用国 际单位 U 来定义酶的活性，定义为在一定的标准条件 下，1 U 即每分钟催化 1 mol 底物的酶量［4］。有关酶基 本的国际单位（ SI） ，世界临床化学家协会数量和单位 委员会定义了一个基本单位，katal，定义为在测定体系 中，每秒钟催化 1 mol 底物的催化转化反应速率所需 要的酶的数量，但这个单位并不常用。由于许多实际 的原因，对于许多酶反应的监控并不能够完全通过消
pH
Va / mL
Vb / mL
6. 0
12. 3
87. 7
6. 5
31. 5
68. 5
7. 0
61. 0
39. 0
7. 5
84. 0
16. 0
8. 0
5. 3
94. 7
pH = 10. 5 的缓冲溶液： c 液为称取硼酸钠Baidu Nhomakorabea 硼砂） 1. 908 g，加水溶解并定容至 100 mL； d 液为称取氢氧 化钠 0. 4 g，加水溶解并定容至 100 mL。使用液： 取 c 液 50 mL，d 液 40 mL，混匀，用水稀释至 100 mL。
Abstract： Activity of liquid alkaline protease was measured by using Folin method． Effects of enzymatic reaction under different temperature and different pH on the enzyme activity assay were investigated and compared． Results showed that as the reaction temperature raises，the enzyme activity increases firstly and then declines； while lowering of the pH of the reaction shows negative impact of the alkaline protease activity． After the optimum conditions for alkaline protease activity assay were identified，the application of the assay method in the determination of enzyme activity of enzymed liquid detergent was further tested． It was discovered that if the enzyme was simply added and mixed with the liquid detergent，the measured enzyme activity of the detergent will appear big deviation and an unstable value． This phenomenon indicated that during the formulation of enzymed liquid detergent，many factors such as the temperature，pH，and the mutual influence of components in the detergent should be comprehensively considered． Key words： protease； protease activity assay； Folin method； liquid detergent
收稿日期： 2012 － 03 － 09； 修回日期： 2012 － 05 － 19 作者简介： 张 剑（ 1967 － ） ，女，教授，博士，电话： 13834110276，E － mail： zhangjian0923@ vip． sina． com。
·192·
第3 期
张 剑，等： 碱性蛋白酶活力分析方法研究
蛋白溶液： 称取 0. 5 g 酪蛋白，在研钵中碾碎，磁 力加热搅拌直到完全溶解，定容至 100 mL。储存于 4 ℃ 冰箱内（ 有效期通常为 3 d，最好是现配现用） 。
碳酸钠溶液： 称取无水碳酸钠 4. 24 g，用水溶解并 定容至 100 mL，即为 0. 4 mol·L － 1 的碳酸钠溶液。
·193·
开发与应用
日用化学工业
第 42 卷
淀的酶蛋白和酪蛋白。 从每一支反应完毕的试管中取滤液 1 mL 分别注
入 4 支新试管中，各管加入 0. 4 mol·L － 1 的碳酸钠溶 液 5 mL，混匀后室温放置 10 min； 然后在各试管中加 入福林酚试剂 1 mL，每滴加一滴试剂必须立即混匀， 在40 ℃ 水浴保温 20 min 显色，用分光光度计在之前 所查阅最大吸收波长处读取吸光度。 1. 3. 3 酶活力计算
的应用，发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现较大偏差，酶活力值不稳定。因此，在配制加酶液体
洗涤剂时，应该对各种因素，例如温度、pH 以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑。
关键词： 蛋白酶； 活力分析； 福林法； 液体洗涤剂
中图分类号： TQ925 + . 2
文献标识码： A
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
UV － 2602 型 紫 外 可 见 分 光 光 度 计，尤 尼 柯 （ 上 海） 仪器有限公司； Z － 561 型电热恒温水浴锅，上海胜 启仪器仪表有限公司； AL204 分析天平，梅特勒 － 托利 多仪器（ 上海） 有限公司。碱性蛋白酶，市售； 福林酚 试剂，上海荔达生物科技有限公司； 洗衣液 1 和洗衣液 2，均为市售； 无水碳酸钠（ AR） 、三氯乙酸（ AR） 、四硼 酸钠（ AR） 、氢氧化钠（ AR） 、磷酸二氢钠（ AR） 、磷酸氢 二钠 （ AR ） 、盐 酸 （ AR ） 、干 酪 素 （ BR ） 、L － 酪 氨 酸 （ BR） ，均为市售。
酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生， 是一种具有催化作用的物质。蛋白酶类制剂是最早也 是得到最广泛使用的洗涤剂酶品种［1］，主要应用于衣 物洗涤剂和洗碗机专用洗涤剂中。蛋白酶能够促进去 除衣领和袜子附着的皮肤角质层污渍、血渍、人体分泌 物和含蛋白质的食物渍，而且衣物上蛋白质黏附的其 他污垢，在蛋白污垢被分解的同时也随之脱落［2］。现 在洗涤剂中使用的蛋白酶，主要为碱性蛋白酶。碱性 蛋白酶是指在 pH 为碱性的条件下水解蛋白质肽键的 酶类，其最适 pH 一般在 9 ～ 11 这一区间，属内肽酶中 的丝氨酸蛋白水解酶类［3］。
1. 3 分析测定
经查阅文献，得知酶促反应结束后溶液最大吸收 波长为 680 nm。 1. 3. 1 吸光常数测定
称取 1 g 酪 氨 酸 （ 预 先 在 105 ℃ 烘 箱 内 烘 至 恒 量） ，以 1 mol·L － 1 的盐酸溶解后定容到 100 mL，再用 水稀释 100 倍，即得到 100 mg · L － 1 的酪氨 酸 溶 液。 按照表 2 所示配制出质量浓度（ ρ） 梯度系列标准液。
开发与应用
耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。因此，迄 今为止国际上碱性蛋白酶活力的测定，尚无一个统一 的评价方法和单位，这也间接地影响到了碱性蛋白酶 在工业界的进一步推广和使用。
作者通过福林法测定酶活力，具体步骤是在测定 酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪 氨酸反应，以 吸 光 度 为 横 坐 标，以 酪 氨 酸 浓 度 为 纵 坐 标，得到标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林 酚试剂作用，测其吸光度，再在标准曲线上推算出相当 于多大浓度的酪氨酸，计算出酶活力单位。在测定酶 活力实验完成后，探究反应条件对酶活力的影响： 将酶 促反应的温度分别设置到等间距温度，采用相同方法 测定酶活力的相对大小，从而测出蛋白酶最适反应温 度； 接着将酶促反应的 pH 分别设置在等间隔数值，亦 采用相同方法测定不同 pH 下酶活力的大小，即可求 得蛋白酶最适 pH［5］。并进一步探索了该方法在液体 洗涤剂酶活力测试中的具体应用。以期今后在对碱性 蛋白酶进行活力测定时能快速择出最佳测试手段，从 而可提升以后测定过程的准确性并为碱性蛋白酶在工 业中的使用提供有效依据。
1. 2 溶液的配制
Na2 HPO4 － NaH2 PO4 缓冲溶液： 按表 1 所示配方 配 制，a 为 0. 2 mol·L － 1 的 Na2 HPO4 溶 液，b 为 0. 2 mol·L － 1 的 NaH2 PO4 溶液。
表 1 缓冲溶液配方
Tab. 1 Buffer solution formulation
ρ / （ mg·L － 1 ） 0 10 20 30 40 50
1. 3. 2 蛋白酶活力测定 福林法： 取 4 支试管，每管中加入酶液 1 mL，第 1
管作为对照（ 在同样条件下，将酶以外的种种因素所 引起的变化，如底物、试剂等本身所产生的颜色称为空 白，在此时用管调节分光光 度 计 的 吸 光 度 为“0 ”，使 其 他 3 管在分光光度计上读得的吸光度值直接代表酶的 活力） 。在第 1 支试管中加入 0. 4 mol·L － 1 的三氯乙 酸溶液 2 mL，使酶在没有遇到底物时已失去活性。在 4 支试管内各加入 1 mL 酪蛋白溶液（ pH = 7） ，将 4 支 试管同时放入 40 ℃ 水浴准确保温 10 min。
酶溶液： 取 1. 0 mL 液体蛋白酶加入 100 mL 容量 瓶中，用 pH = 10. 5 的缓冲液稀释至刻度，摇匀，再从 中取 1. 0 mL 溶液加入 100 mL 容量瓶中，用同此 pH 的缓冲液稀释至刻度，摇匀，在室温下放置 1 h，即为稀 释 100 × 100 倍的酶液。在做 pH 影响的试验中，酶液 应该选用所需的 pH 缓冲液稀释。
DOI:10.13218/j.cnki.csdc.2012.03.017
第 42 卷第 3 期 2012 年 6 月
日用化学工业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 42 No． 3 June 2012
碱性蛋白酶活力分析方法研究
张 剑，赵雷敏，康林霞
（ 山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006）
摘要： 通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定。研究比较了不同温度及 pH 下的酶促反应对酶活力测定方法
的影响，结果显示： 酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降，40 ～ 50 ℃ 时相对较稳定； pH 降低对碱性蛋白酶活力
有着负面影响。在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后，进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中
表 2 酪氨酸质量浓度梯度系列标准液 Tab. 2 Series of standard solution of tyrosine mass concentration
gradient
编号 1 2 3 4 5 6
V（ 酪氨酸） / mL 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5
V（ 水） / mL 5 4. 5 4. 0 3. 5 3. 0 2. 5
文章编号： 1001 － 1803（ 2012） 03 － 0192 － 04
Study on alkaline protease activity assay
ZHANG Jian，ZHAO Lei － min，KANG Lin － xia
（ College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi University，Taiyuan，Shanxi 030006，China）
蛋白酶制剂作为一种生物催化剂，测定其酶活力
值是研究酶的特性及其应用的先决条件。早期文献 中，酶的活 性 以 任 意 各 种 形 式 来 表 示，如 吸 光 度 的 变 化、还原基团的增加，以 mg 或 μg 表示的被转化底物 的质量。这些参数和各种时间单位（ 如 1 min，30 min） 相关联。1961 年世界生物化学协会酶学委员会用国 际单位 U 来定义酶的活性，定义为在一定的标准条件 下，1 U 即每分钟催化 1 mol 底物的酶量［4］。有关酶基 本的国际单位（ SI） ，世界临床化学家协会数量和单位 委员会定义了一个基本单位，katal，定义为在测定体系 中，每秒钟催化 1 mol 底物的催化转化反应速率所需 要的酶的数量，但这个单位并不常用。由于许多实际 的原因，对于许多酶反应的监控并不能够完全通过消
pH
Va / mL
Vb / mL
6. 0
12. 3
87. 7
6. 5
31. 5
68. 5
7. 0
61. 0
39. 0
7. 5
84. 0
16. 0
8. 0
5. 3
94. 7
pH = 10. 5 的缓冲溶液： c 液为称取硼酸钠Baidu Nhomakorabea 硼砂） 1. 908 g，加水溶解并定容至 100 mL； d 液为称取氢氧 化钠 0. 4 g，加水溶解并定容至 100 mL。使用液： 取 c 液 50 mL，d 液 40 mL，混匀，用水稀释至 100 mL。
Abstract： Activity of liquid alkaline protease was measured by using Folin method． Effects of enzymatic reaction under different temperature and different pH on the enzyme activity assay were investigated and compared． Results showed that as the reaction temperature raises，the enzyme activity increases firstly and then declines； while lowering of the pH of the reaction shows negative impact of the alkaline protease activity． After the optimum conditions for alkaline protease activity assay were identified，the application of the assay method in the determination of enzyme activity of enzymed liquid detergent was further tested． It was discovered that if the enzyme was simply added and mixed with the liquid detergent，the measured enzyme activity of the detergent will appear big deviation and an unstable value． This phenomenon indicated that during the formulation of enzymed liquid detergent，many factors such as the temperature，pH，and the mutual influence of components in the detergent should be comprehensively considered． Key words： protease； protease activity assay； Folin method； liquid detergent
收稿日期： 2012 － 03 － 09； 修回日期： 2012 － 05 － 19 作者简介： 张 剑（ 1967 － ） ，女，教授，博士，电话： 13834110276，E － mail： zhangjian0923@ vip． sina． com。
·192·
第3 期
张 剑，等： 碱性蛋白酶活力分析方法研究
蛋白溶液： 称取 0. 5 g 酪蛋白，在研钵中碾碎，磁 力加热搅拌直到完全溶解，定容至 100 mL。储存于 4 ℃ 冰箱内（ 有效期通常为 3 d，最好是现配现用） 。
碳酸钠溶液： 称取无水碳酸钠 4. 24 g，用水溶解并 定容至 100 mL，即为 0. 4 mol·L － 1 的碳酸钠溶液。