碱性蛋白酶活力分析方法研究_张剑
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探
碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。
1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。
碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。
由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。
研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。
海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。
迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。
海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。
相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。
综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。
首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。
其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。
2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。
大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。
最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。
本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。
Folin法测定碱性蛋白酶活性
混匀，水浴40℃ 20min，冷却后680nm波长处比色 空白对照操作：
在加酪蛋白前加入2.0ml三氯乙酸使酶失活，同时不需加热，其余操作相同。
四、实验操作-- 3、计算
• 1、以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸量（ μg ）为横
坐标作标准曲线图，线性回归，求直线方程和R2，
• 加入三氯乙酸2.0ml终止反应，混匀，置于40℃恒温水浴中沉淀15min。 • 用加入滤纸的漏斗过滤，收集滤液。 • （2）、测定酶活： • 各取1.0ml滤液到另一试管中，加入0.4mol/L Na2CO3 5.0ml，再加入 Folin试剂1.0ml，混匀，置于40℃恒温水浴中20min，冷却后于680nm 波长处比色。 • 具体见下表：
并求斜率的倒数K。
• 2、碱性蛋白酶活力计算 • 酶活力(μg/ml) = K· A· N· 4/10
• K-标准曲线斜率的倒数 A-吸光度值 N - 酶的稀释倍数10000倍
• 4-反应总体积为4mL
10 - 反应时间为10min
• 将两个样品测定结果取平均值后代入公式，计算酶活
五、实验注意事项
二、实验原理
• （3）在一定pH和温度（40 ℃ ）下，蛋白酶液和底物酪蛋 白反应，经过一段时间后，加入三氯乙酸终止酶反应，并使 多余的酪蛋白发生沉淀而与水解产物分开。 • 过滤后，取滤液（含蛋白水解液和三氯乙酸）用碳酸钠碱化，
再加入folin试剂使之显色，蓝色强度与蛋白水解产物的量成
正比，在一定浓度范围内符合比尔定律，因此可以推断出蛋 白酶的活性。 • （4）碱性蛋白酶酶活定义为：上述实验条件下，每分钟水 解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个酶活单位。
碱性蛋白酶(Alkaline protease, AKP)活性测定试剂盒说明书
货号：MS2302 规格：100管/48样碱性蛋白酶（Alkaline protease, AKP）活性测定试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。
此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。
该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
测定原理：在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、0.5mL EP管和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。
临用前加 5mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。
临用前加入 5mL 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。
临用前加 20mL 蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体×1 支，0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培养液：直接测定。
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
碱性蛋白酶活力的测定
实验四碱性蛋白酶活力的测定一、实验原理以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。
溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂和仪器试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、酶液的萃取称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。
2、酶活力的测定样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。
空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL Folin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。
碱性蛋白酶活力的测定
碱性蛋白酶活力的测定1、实验原理蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2、实验试剂2.1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1 000mL。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：1份福林试剂与2份水混合，摇匀。
2.2. 碳酸钠溶液（Na 2CO3）=0.4mol／l 称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1 000mL。
2.3. 三氯乙酸c（CCl 3·COOH）＝0.4mol／l 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1 000mL。
2.4. 氢氧化钠溶液（NaOH）＝0.5mol／l2.5. 盐酸溶液（HCl）＝lmol／l及0.lmol／l2.6. 硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1 000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1 000mL。
使用溶液：取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1 000mL。
上述各种缓冲溶液，均需用pH计校正。
2.7. 10g／L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol／L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH值缓冲溶液稀释至刻度。
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。
本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。
经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。
酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。
在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。
EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。
抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。
酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能力,Triton X-100强烈抑制酶活力。
该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。
该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和耐盐性。
测定了该酶的N端序列,为FDVIGGNAYT。
本论文纯化的碱性蛋白酶具有耐碱性、耐高温、耐盐及耐有机溶剂等优良的特性,在皮革、洗涤等工业生产中具有应用前景。
蛋白酶比活力实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白酶比活力的概念及测定方法。
2. 掌握利用比色法测定蛋白酶比活力的原理和操作步骤。
3. 通过实验，了解蛋白酶在不同条件下的活性变化，为实际应用提供参考。
二、实验原理蛋白酶比活力是指单位质量的蛋白质所具有的酶活性。
在实验中，通过测定蛋白酶在一定条件下对底物（如酪蛋白）的水解程度，可以计算出蛋白酶的比活力。
本实验采用比色法，通过测定底物水解产生的产物（如酪氨酸）的吸光度变化，间接反映蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白酶样品- 酪蛋白- 0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液- 0.1mol/L Folin-酚试剂- 0.4mol/L三氯乙酸- 0.05mol/L氢氧化钠溶液- 2.5mol/L硼砂缓冲溶液（pH10.5）- 680nm比色计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 移液器- 电子天平- 恒温水浴锅- 10mL具塞试管- 50mL容量瓶- 试管架四、实验步骤1. 准备实验试剂：- 配制0.1mol/L Folin-酚试剂：将钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、硫酸锂、液溴等试剂按比例混合，微火回流加热10小时，加入碳酸钠和蒸馏水，定容至1000mL。
- 配制0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
- 配制0.05mol/L氢氧化钠溶液：按GB601配制。
- 配制2.5mol/L硼砂缓冲溶液（pH10.5）：称取硼酸钠19.08g，加水溶解并定容至1000mL，称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL，取甲液500mL乙液400mL混合，用水稀释至1000mL。
2. 实验操作：- 将酪蛋白溶解于0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中，配制成2%酪蛋白溶液。
- 将蛋白酶样品用0.02mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液稀释至适宜浓度。
- 取10mL具塞试管，加入2%酪蛋白溶液1mL，然后加入蛋白酶溶液1mL，置于37℃恒温水浴锅中反应30分钟。
碱性蛋白酶活力分析方法研究
碱性蛋白酶活力分析方法研究张剑;赵雷敏;康林霞【摘要】通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定.研究比较了不同温度及pH下的酶促反应对酶活力测定方法的影响,结果显示:酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降,40～50℃时相对较稳定;pH降低对碱性蛋白酶活力有着负面影响.在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后,进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中的应用,发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后,测定酶活力时会出现较大偏差,酶活力值不稳定.因此,在配制加酶液体洗涤剂时,应该对各种因素,例如温度、pH以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑.%Activity of liquid alkaline protease was measured by using Folin method. Effects of enzymatic reaction under different temperature and different pH on the enzyme activity assay were investigated and compared. Results showed that as the reaction temperature raises,the enzyme activity increases firstly and then declines j while lowering of the pH of the reaction shows negative impact of the alkaline protease activity. After the optimum conditions for alkaline protease activity assay were identified, the application of the assay method in the determination of enzyme activity of enzymed liquid detergent was further tested. It was discovered that if the enzyme was simply added and mixed with the liquid detergent, the measured enzyme activity of the detergent will appear big deviation and an unstable value. This phenomenon indicated that during the formulation of enzymed liquid detergent, many factors such as the temperature, pH,and the mutual influence of components in the detergent should be comprehensively considered.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2012(042)003【总页数】4页(P192-195)【关键词】蛋白酶;活力分析;福林法;液体洗涤剂【作者】张剑;赵雷敏;康林霞【作者单位】山西大学化学化工学院,山西太原 030006;山西大学化学化工学院,山西太原 030006;山西大学化学化工学院,山西太原 030006【正文语种】中文【中图分类】TQ925+.2酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生，是一种具有催化作用的物质。
碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性
碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的稳定性康林霞;张剑;秦洁;张晟【摘要】研究了利用α-环糊精(α-CD)与聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(F108)之间的主客体识别作用构筑一种空心微球,此微球在水溶液中有碱性蛋白酶存在时,能够将其包裹在内腔中,起到保护作用,提高了其稳定性.结果表明,包裹后的碱性蛋白酶在液体洗涤剂中保存7d时,酶活力是包裹前的2倍.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2014(044)003【总页数】4页(P139-142)【关键词】液体洗涤剂;稳定性;碱性蛋白酶;α-环糊精;自组装【作者】康林霞;张剑;秦洁;张晟【作者单位】山西大学化学学院,山西太原030006;四川大学高分子国家重点实验室,四川成都610065;山西大学化学学院,山西太原030006;四川省种子站,四川成都610041;四川大学高分子国家重点实验室,四川成都610065【正文语种】中文【中图分类】TQ649.6+3酶是一种具有三维结构的蛋白质，对特定底物具有专一性及高效分解的特性。
碱性蛋白酶由于对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果，并能大幅提高洗涤去污力，被广泛应用于液体洗涤剂中。
在洗涤过程中，碱性蛋白酶将顽固的“蛋白质类大分子”降解成肽类以及氨基酸等易于被表面活性剂去除的小分子［1］，以此来达到清洁的效果。
随着人们对洗涤剂环保、高效、不伤手等要求的提高，液体洗涤剂迅速发展起来［2］。
但由于碱性蛋白酶自身的复杂性，当被加入到液体洗涤剂中时，酶的稳定性成了突出的问题［3］。
据报道［4］，为了提高酶储存的存活率，有添加稳定剂(如硼砂和多元醇等)封闭活性端口和将酶制成微胶囊与其他物质隔离等形式，也有添加复合稳定剂来改善酶的稳定性等形式。
但是这些方法操作工艺较为复杂，且对环境有一定影响。
四川大学张晟老师课题组曾报道过利用主客体识别构筑的空心微球可用于药物缓释、酶包裹等领域。
例如，利用海藻酸钠接枝的乙二醇(Alg－g－PEG)与α－环糊精(α－CD)之间的主客体识别作用构筑一种空心微球［5－6］，并进一步证实，这种空心微球可以包裹L－天冬酰胺酶［7］。
蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解碱性蛋白酶活力测定的原理；2、掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1,A0,B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min(准确计时)后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、奖试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）:称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5）；③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④5%三氯醋酸（TCA）溶液。
03实验三碱性蛋白酶活力测定
03实验三碱性蛋⽩酶活⼒测定实验三. 碱性蛋⽩酶活⼒测定【实验⽬的】1. 掌握测定碱性蛋⽩酶活⼒的原理和酶活⼒的计算⽅法。
2. 学习测定酶促反应速度的⽅法和基本操作。
【实验原理】酶活⼒是指酶催化某些化学反应的能⼒。
酶活⼒的⼤⼩可以⽤在⼀定条件下它所催化的某⼀化学反应的速度来表⽰。
测定酶活⼒实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以⽤单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表⽰，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的⽣成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移⽽逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活⼒，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋⽩酶在碱性条件下，可以催化酪蛋⽩⽔解⽣成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发⽣福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，⽣成钨蓝和钼蓝的混合物，⽽呈现出不同深浅的蓝⾊。
）利⽤⽐⾊法即可测定酪氨酸的⽣成量，⽤碱性蛋⽩酶在单位时间内⽔解酪蛋⽩产⽣的酪氨酸的量来表⽰酶活⼒。
【实验材料】1.实验器材电热恒温⽔浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨⼝回流瓶中加⼊50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏⽔、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏⽔及数滴液体溴，开⼝继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕⾊瓶中暗处保存。
使⽤前加4倍蒸馏⽔稀释。
(2)1%酪蛋⽩溶液：称取酪蛋⽩1克于研钵中，先⽤少量蒸馏⽔湿润后，慢慢加⼊0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，⽤蒸馏⽔洗⼊100ml容量瓶中，放⼊⽔浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容⾄100ml，保存于冰箱内。
基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用[发明专利]
![基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4e9f47c5e2bd960591c6775e.png)
专利名称：基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其应用
专利类型：发明专利
发明人：张剑,徐淑宜
申请号：CN202011273110.7
申请日：20201114
公开号：CN112301023A
公开日：
20210202
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于蛋白质工程改造技术领域,具体涉及一种基于分子动力学计算修饰的2709碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。
本发明通过对来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶通过计算机模拟，用分子动力学方法研究2709碱性蛋白酶的动态结构特征，这是目前唯一能够从原子水平上来研究2709碱性蛋白酶结构与分子动力学与酶功能关系的有效方法。
通过分子动力学计算后，选择合适位点进行蛋白质工程改造，获得了适合洗涤剂工业应用的2709碱性蛋白酶突变体。
本发明的蛋白酶突变体在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且稳定性更好，不仅具有良好的去污作用，还具有和洗涤剂中各组分兼容性好，可广泛应用于洗涤工业领域。
申请人：山西大学
地址：030006 山西省太原市小店区坞城路92号
国籍：CN
代理机构：太原申立德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：郭海燕
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钙离子与碱性蛋白酶的相互作用及机理研究
钙离子与碱性蛋白酶的相互作用及机理研究李静;张剑;赵永祥【摘要】The interaction of calcium ions and alkaline protease was studied. The mechanism of action was investigated by dynamic light scattering (DLS)and fluorescence spectroscopy. Results show that calcium ions have a certain activation effect on the activity of alkaline protease,in which calcium chloride activates the activity of alkaline protease more significantly than calcium formate. DLS experiments show that calcium ion and alkaline protease are mainly combined by electrostatic force. With the addition of calcium ions,the average particle size of the alkaline protease molecules decreased,and the hydrophobic structure gradually shift to the interior of the enzyme molecule,which is beneficial to the improvement of alkaline protease activity. The binding of calcium ions to alkaline protease was studied by fluorescence spectroscopy. Results show that the quenching mechanism of calcium ions to alkaline protease is a static quenching. Calcium ions form a stable complex with alkaline protease. The binding ability is strong,and the process can be spontaneous.%研究了Ca2+与碱性蛋白酶的相互作用,并通过动态光散射(DLS)实验和荧光光谱法探讨其作用机理.实验结果表明,Ca2+对碱性蛋白酶的活性具有一定的激活作用,其中CaCl2较Ca(HCO2)2对碱性蛋白酶酶活的激活作用更加显著.动态光散射实验表明,Ca2+与碱性蛋白酶主要通过静电作用力结合,Ca2+的加入使得碱性蛋白酶分子的平均粒径减小,疏水结构逐渐向酶分子内部转移,有利于碱性蛋白酶活性的提高.利用荧光光谱研究Ca2+与碱性蛋白酶的结合作用,结果表明Ca2+对碱性蛋白酶的猝灭机制属于静态猝灭,Ca2+与碱性蛋白酶形成稳定的复合物,且结合能力很强,结合过程能够自发进行.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2018(048)001【总页数】7页(P1-7)【关键词】碱性蛋白酶;钙离子;活性;动态光散射;荧光光谱【作者】李静;张剑;赵永祥【作者单位】山西大学化学化工学院,山西太原 030006;山西大学化学化工学院,山西太原 030006;山西大学化学化工学院,山西太原 030006【正文语种】中文【中图分类】O629.8碱性蛋白酶是碱性条件下水解蛋白质肽键的一类酶制剂[1]，不同来源的碱性蛋白酶在洗涤剂、制革、医药、酿造等行业中都有重要的用途[2]。
纤维素酶活力测定条件研究及其在洗涤剂中的应用
纤维素酶活力测定条件研究及其在洗涤剂中的应用于跃;张剑;何德志【摘要】采用纤维素酶羧甲基纤维素(CMC)酶活的测定方法,研究了温度、pH、波长及吸光度等条件对纤维素酶活力测定的影响.结果表明,在温度为50℃,pH =6,吸收波长为530 nm及吸光度为0.2～0.4的条件下,测得的纤维素酶活力数值较为稳定.在上述优选条件下添加液体洗涤剂和洗衣粉背景,考察该方法能否用于液体洗涤剂和洗衣粉中纤维素酶活力的测定.研究结果显示,此方法适用于液体洗涤剂和洗衣粉中纤维素酶活力的测定,但需严格控制洗涤剂或洗衣粉溶液的温度和pH.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2015(045)008【总页数】5页(P457-461)【关键词】洗涤剂;纤维素酶;活力分析【作者】于跃;张剑;何德志【作者单位】山西大学化学化工学院,山西太原030006;山西大学化学化工学院,山西太原030006;山西大学化学化工学院,山西太原030006【正文语种】中文【中图分类】TQ649.6+6纤维素酶根据酶功能的差异被分为3大类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[1] 。
纤维素酶因其特殊的去污机理[2] ，一直以来吸引着人们的研究热情，尤其是它在洗涤剂工业中的应用。
纤维素酶与蛋白酶及脂肪酶等酶的去污原理不同，它主要作用于纤维素的无定形区[3] ，能够有效地软化和水解纤维素分子与水及污垢形成的凝胶结构，并释放凝胶结构中的污垢，在起到良好洗涤效果的同时还保持了织物的色泽及强度。
随着人们对洗涤剂要求的提高，添加纤维素酶的洗涤剂也日益增多。
但由于纤维素酶自身的结构特点，容易形成分子间氢键[4] ，使纤维素酶不溶于水及一般的有机溶剂，对其活力的测定造成很大的困难。
国内外有许多关于纤维素酶活力测定的报道[5，6]，很多研究者根据各自的实验目的采用了不同的方法来测定缓冲液条件下纤维素酶的活力，使得测定方法具有多样化，如棉线切断法、滤纸法、分光光度法等[7] ，但至今也没有统一的纤维素酶活力的测定方法。
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1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
UV － 2602 型 紫 外 可 见 分 光 光 度 计，尤 尼 柯 （ 上 海） 仪器有限公司； Z － 561 型电热恒温水浴锅，上海胜 启仪器仪表有限公司； AL204 分析天平，梅特勒 － 托利 多仪器（ 上海） 有限公司。碱性蛋白酶，市售； 福林酚 试剂，上海荔达生物科技有限公司； 洗衣液 1 和洗衣液 2，均为市售； 无水碳酸钠（ AR） 、三氯乙酸（ AR） 、四硼 酸钠（ AR） 、氢氧化钠（ AR） 、磷酸二氢钠（ AR） 、磷酸氢 二钠 （ AR ） 、盐 酸 （ AR ） 、干 酪 素 （ BR ） 、L － 酪 氨 酸 （ BR） ，均为市售。
pH
Va / mL
Vb / mL
6. 0
12. 3
87. 7
6. 5
31. 5
68. 5
7. 0
61. 0
39. 0
7. 5
84. 0
16. 0
8. 0
5. 3
94. 7
pH = 10. 5 的缓冲溶液： c 液为称取硼酸钠（ 硼砂） 1. 908 g，加水溶解并定容至 100 mL； d 液为称取氢氧 化钠 0. 4 g，加水溶解并定容至 100 mL。使用液： 取 c 液 50 mL，d 液 40 mL，混匀，用水稀释至 100 mL。
Abstract： Activity of liquid alkaline protease was measured by using Folin method． Effects of enzymatic reaction under different temperature and different pH on the enzyme activity assay were investigated and compared． Results showed that as the reaction temperature raises，the enzyme activity increases firstly and then declines； while lowering of the pH of the reaction shows negative impact of the alkaline protease activity． After the optimum conditions for alkaline protease activity assay were identified，the application of the assay method in the determination of enzyme activity of enzymed liquid detergent was further tested． It was discovered that if the enzyme was simply added and mixed with the liquid detergent，the measured enzyme activity of the detergent will appear big deviation and an unstable value． This phenomenon indicated that during the formulation of enzymed liquid detergent，many factors such as the temperature，pH，and the mutual influence of components in the detergent should be comprehensively considered． Key words： protease； protease activity assay； Folin method； liquid detergent
开发与应用
耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。因此，迄 今为止国际上碱性蛋白酶活力的测定，尚无一个统一 的评价方法和单位，这也间接地影响到了碱性蛋白酶 在工业界的进一步推广和使用。
作者通过福林法测定酶活力，具体步骤是在测定 酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪 氨酸反应，以 吸 光 度 为 横 坐 标，以 酪 氨 酸 浓 度 为 纵 坐 标，得到标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林 酚试剂作用，测其吸光度，再在标准曲线上推算出相当 于多大浓度的酪氨酸，计算出酶活力单位。在测定酶 活力实验完成后，探究反应条件对酶活力的影响： 将酶 促反应的温度分别设置到等间距温度，采用相同方法 测定酶活力的相对大小，从而测出蛋白酶最适反应温 度； 接着将酶促反应的 pH 分别设置在等间隔数值，亦 采用相同方法测定不同 pH 下酶活力的大小，即可求 得蛋白酶最适 pH［5］。并进一步探索了该方法在液体 洗涤剂酶活力测试中的具体应用。以期今后在对碱性 蛋白酶进行活力测定时能快速择出最佳测试手段，从 而可提升以后测定过程的准确性并为碱性蛋白酶在工 业中的使用提供有效依据。
收稿日期： 2012 － 03 － 09； 修回日期： 2012 － 05 － 19 作者简介： 张 剑（ 1967 － ） ，女，教授，博士，电话： 13834110276，E － mail： zhangjian0923@ vip． sina． com。
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第3 期
张 剑，等： 碱性蛋白酶活力分析方法研究
蛋白溶液： 称取 0. 5 g 酪蛋白，在研钵中碾碎，磁 力加热搅拌直到完全溶解，定容至 100 mL。储存于 4 ℃ 冰箱内（ 有效期通常为 3 d，最好是现配现用） 。
碳酸钠溶液： 称取无水碳酸钠 4. 24 g，用水溶解并 定容至 100 mL，即为 0. 4 mol·L － 1 的碳酸钠溶液。
表 2 酪氨酸质量浓度梯度系列标准液 Tab. 2 Series of standard solution of tyrosine mass concentration
gradient
编号 1 2 3 4 5 6
V（ 酪氨酸） / mL 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5
V（ 水） / mL 5 4. 5 4. 0 3. 5 3. 0 2. 5
1. 2 溶液的配制
Na2 HPO4 － NaH2 PO4 缓冲溶液： 按表 1 所示配方 配 制，a 为 0. 2 mol·L － 1 的 Na2 HPO4 溶 液，b 为 0. 2 mol·L － 1 的 NaH2 PO4 溶液。
表 1 缓冲溶液配方
Tab. 1 Buffer solution formulation
蛋白酶制剂作为一种生物催化剂，测定其酶活力
值是研究酶的特性及其应用的先决条件。早期文献 中，酶的活 性 以 任 意 各 种 形 式 来 表 示，如 吸 光 度 的 变 化、还原基团的增加，以 mg 或 μg 表示的被转化底物 的质量。这些参数和各种时间单位（ 如 1 min，30 min） 相关联。1961 年世界生物化学协会酶学委员会用国 际单位 U 来定义酶的活性，定义为在一定的标准条件 下，1 U 即每分钟催化 1 mol 底物的酶量［4］。有关酶基 本的国际单位（ SI） ，世界临床化学家协会数量和单位 委员会定义了一个基本单位，katal，定义为在测定体系 中，每秒钟催化 1 mol 底物的催化转化反应速率所需 要的酶的数量，但这个单位并不常用。由于许多实际 的原因，对于许多酶反应的监控并不能够完全通过消
酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生， 是一种具有催化作用的物质。蛋白酶类制剂是最早也 是得到最广泛使用的洗涤剂酶品种［1］，主要应用于衣 物洗涤剂和洗碗机专用洗涤剂中。蛋白酶能够促进去 除衣领和袜子附着的皮肤角质层污渍、血渍、人体分泌 物和含蛋白质的食物渍，而且衣物上蛋白质黏附的其 他污垢，在蛋白污垢被分解的同时也随之脱落［2］。现 在洗涤剂中使用的蛋白酶，主要为碱性蛋白酶。碱性 蛋白酶是指在 pH 为碱性的条件下水解蛋白质肽键的 酶类，其最适 pH 一般在 9 ～ 11 这一区间，属内肽酶中 的丝氨酸蛋白水解酶类［3］。
DOI:10.13218/ki.csdc.2012.03.017
第 42 卷第 3 期 2012 年 6 月
日用化学工业
China Surfactant Detergent ＆ Cosmetics
Vol． 42 No． 3 June 2012
碱性蛋白酶活力分析方法研究
张 剑，赵雷敏，康林霞
（ 山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006）
的应用，发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现较大偏差，酶活力值不稳定。因此，在配制加酶液体
洗涤剂时，应该对各种因素，例如温度、pH 以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑。
关键词： 蛋白酶； 活力分析； 福林法； 液体洗涤剂
中图分类号： TQ925 + . 2
文献标识码： A
摘要： 通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定。研究比较了不同温度及 pH 下的酶促反应对酶活力测定方法
的影响，结果显示： 酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降，40 ～ 50 ℃ 时相对较稳定； pH 降低对碱性蛋白酶活力
有着负面影响。在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后，进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中
向另外 3 支试管内分别加入 0. 4 mol·L － 1 的三氯 乙酸溶液 2 mL，充分摇匀，使反应停止，过滤，除去沉