酚试剂法测定蛋白质含量实验报告

南方医科大学生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：第七实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

实验日期实验地点第七实验室

合作者指导老师

评分教师签名批改日期

格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的

1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2、熟悉分光光度计的用法。

3、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理

1、双缩脲反应：在碱性溶液中，双缩脲能与Cu2+作用,形成紫红色的络合物,而蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键，在与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。

2、Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

3、在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

三、材料与方法：以流程图示意

1、实验材料

（1）样品

健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L

（2）试剂

牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）；碱性硫酸铜溶液；Folin-酚试剂

2、仪器与器材

V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架

3、实验步骤

（1）图示

图一：Folin-酚试剂法测定蛋白质含量流程图

（2）取6支试管做好标记，再按下表加样：（1为空白对照，2-5作标准，6为待测样品）试剂（ml) 1 2 3 4 5 6

牛血清白蛋白标准液样品液（稀释300倍）蒸馏水

碱性硫酸铜-

-

1.0

2.0

0.20

-

0.80

2.0

0.40

-

0.60

2.0

0.60

-

0.40

2.0

0.80

-

0.20

2.0

-

0.50

0.50

2.0

表一：反应体系设置

（3）加样时顺序加样，在1号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml后开始计时，等待1分钟

再往下一支试管加入等量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。以此类推。

（4）在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之后，待第一支试管加样10分钟后，于第1支试管立即加入0.20mL Folin-酚试剂，并于2s内摇匀。1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，以此类推。

（5）加样完毕后将各试管按顺序每隔1min放一只试管进入水浴箱，40℃水浴10min后取出冷却至室温。

（6）用500nm波长比色，以1号管作空白对照，按顺序依次测定每支试管内溶液吸光度并重复测三次，记下读数，求出平均值，记录数据并计算结果。

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

1、实验现象记录

（1）在向试管中加入2ml碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液澄清，无明显现象

（2）在向试管中加入0.20mL Folin-酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深，水浴后颜色更深，6号试管内溶液颜色介于3、4号试管之间。

2、吸光度数据：

500nm波长吸收度值记录

各管吸光度值A500

测定次数

2 3 4 5 6

1 0.041 0.055 0.080 0.089 0.069

2 0.041 0.056 0.080 0.089 0.067

3 0.041 0.055 0.081 0.089 0.068

各管平均值0.041 0.055 0.080 0.089 0.068

表二：500nm波长吸收度值记录表

根据吸光度数据绘制散点图

图二：500nm波长吸收度值散点图

将测得6号试管吸光度0.068代入标准曲线公式y=0.0006x中，得出样品浓度为113.33µg/ml。

即：C（未稀释蛋白含量） = C（稀释后蛋白质含量）×2×300

= 113.33µg/ml×2×300

= 68000µg/ml = 68.00g/L

正常人血清蛋白浓度参考范围为：60~80g/L

以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落在正常范围内，可认为本次实验成功。

3、讨论

（1）实验中操作严格按照实验要求进行，所测样品结果68.00g/L落在正常范围内，可认为本次实验成功。

（2）误差分析

①在使用加样枪过程中可因试液有少许残留于移液枪头导致操作误差，另外，多次加样也加大了误差。

②因反应的显色随时间不断加深，因此实验中若未能及时将溶液转移至比色皿而导致测定2-6试管时，各组测定的时间间隔不一致，导致误差。

复习思考题：

1、试述Folin-酚试剂法的优点？

2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？

答：1、①反应迅速灵敏，现象明显，便于观察与测定吸光度。

②不同蛋白质之间所得实验结果差异不大，可选取的试剂种类更为丰富。

③操作简单快速。操作更为简便。

2、经过课外查阅资料可得下面结论：

（1）干扰物质：硫酸铵、蔗糖等巯基化合物；酚类及柠檬酸；浓度较高的尿素、胍、乙醚、丙酮、三氯乙酸、硝酸钠、硫酸钠等。

（2）原因：因为Folin-酚试剂法中应用了双缩脲反应，而上述物质均带有干扰双缩脲试剂的基团，因此也会干扰Folin-酚试剂法。

（3）注意：为了避免干扰，操作过程中应防止该类物质进入试管中；当样品酸度高，应增加碳酸钠-氢氧化钠浓度以靠近实验所需的碱性环境，使显色反应更为明显；当存在浓度较高的尿素、胍、乙醚、丙酮、三氯乙酸、硝酸钠、硫酸钠等时，应该做校正曲线。