第26章病毒的检测

二、主要特性

2.抵抗力
对冷及干燥有抵抗力，在干燥的痂皮中，病毒可存活几 个月。100℃耐5-10min，但在潮湿的情况下，60℃ 10min 即可灭活。 对常用消毒剂有抵抗力，但甲醛（0.5%福尔马林）、碘 液（0.01%）、H2SO4（3%）、HCl、石炭酸（3%）作用 一定时间即可灭活（数分钟内）。 直射日光或紫外线亦可使病毒灭活。

荧光标记技术

免疫酶组化染色技术

免疫酶测定法

免疫转印技术
1 2 3 4 5 6 7 8

补体结合试验

补体结合试验

补体结合试验
第五节 病毒核酸的检测

是指利用一些分子生物学技术，如：基因组电 泳分析、核酸杂交、聚合酶链式反应、寡核苷 酸指纹图等，通过检测病毒的核酸，而确证样 本中病毒的存在。

一、主要症状

成年猪一般呈隐性感染，
幼猪感染后，表现为发热及神经症状，无母源抗体的 新生仔猪死亡率达100%，
怀孕母猪感染后，50%可发生流产，死胎或木乃伊胎

一、主要症状

其他动物感染后，有很高的致死率，特征症状为躯体 某部为奇痒。

试验动物中，家兔最敏感。病料皮下接种家兔，2-5天 死亡。
二、主要特征

1.形态特征
痘病毒具有独特的形态结构，大多数痘病毒粒子为砖状， 大小为250nmⅹ250nmⅹ200nm，副痘病毒颗粒则为纺锤 形或椭圆形，大小为260nmⅹ160nm，且外观如缠绕着毛 线的线团。
二、主要特征



病毒颗粒的外层结构之内是哑铃样的芯髓，内含 病毒DNA和若干蛋白，及2个功能不明的侧体。 病毒的囊膜含有宿主细胞的类脂成分及病毒特殊 蛋白， 痘病毒基因组由单分子的双股线状DNA组成

五、病毒的微生物学诊断

①动物实验：用1-2ml适当稀释的脑组织悬液皮下接种家兔，2-5d 后于接种部位出现奇痒症状，最后麻痹致死。 ②鸡胚接种：将含毒材料接种于8-12日龄鸡胚的绒毛尿囊膜，经34d后，可在该膜上见到白色痘泡，胚体头部有小出血点。 ③病毒培养：常用兔肾或猪肾细胞、或鸡胚培养，进一步鉴定可用 抑制抗血清作细胞病变抑制试验或中和试验。 ④病毒鉴定：取神经组织，采用血清学实验（用标准化诊断试剂盒 （ELISA试剂盒）、或做荧光抗体检查）或PCR方法。
二、病毒分布与动物排毒情况

病毒主要存在于神经组织、呼吸粘膜、唾液腺 和下颌淋巴结，（脑实质为病毒分离鉴定的主 要部位，因该部位易保证无菌）， 康复猪可通过鼻腔分泌物和唾液排毒，粪尿内 不带毒。

三、病毒的特性

病毒颗粒呈圆形或卵圆形，具有囊膜，核酸类型为双 股线状DNA。 对酸、碱抵抗力强。pH4-9之间稳定，对乙醚、氯仿等 脂溶剂敏感（因有囊膜）。 对热有抵抗力，55-60℃经30-50min才能灭活，80℃经 3min灭活。50%甘油盐水中4℃保存154天感染力稍有下 降，保存3年，仍有感染力。-15℃保存12周。 伪狂犬病毒只有一个血清型。可凝集小鼠的红细胞。

三、痘病毒的培养

2.病毒在单层细胞上的培养
各种痘病毒均可在同种动物的单层细胞（肾、胚胎组 织、睾丸等）上良好生长，引起CPE或肉眼可见的空斑。
四、传播
痘病毒在动物间的传播途径如下：


皮肤的伤口感染 由污染的环境直接或间接感染（如： 呼吸道感染） 昆虫叮咬感染
五、致病性

引致人与多种动物包括禽类的疾病，表现为持续时间 较长的轻症感染至严重的致死性感染。除猫狗外，各 种动物均有其自己的痘病毒，不过某些病毒可以适应 几种不同的动物。 常用其痘浆进行免疫接种（刺种）。

TCID50、ID50、EID50。
第三节 病毒颗粒的检测


1.电子显微镜 2.血凝实验

电镜下的病毒颗粒

血凝实验
病毒红细胞凝集（HA） 病毒红细胞凝集抑制 （HI）

病毒的血凝实验
第四节 病毒的血清学试验



病毒的中和试验 免疫染色技术 免疫转印技术 补体结合试验


病毒的中和试验

抓取小鼠的方法

小鼠腹腔注射法
三、病毒的理化特性鉴定

病毒的理化特性鉴定是病毒鉴定的重要依据， 一般进行病毒核酸类型鉴定、耐酸性试验、脂 溶剂敏感试验、胰蛋白酶敏感试验等。 通常以细胞或鸡胚为观察体系。

第二节 病毒感染单位的测定

测定样本中病毒的浓度，即病毒的滴度是病毒学中最 重要的技术之一。病毒滴度测定可通过用系列稀释的 病毒接种细胞、鸡胚或动物，检测病毒的增值情况。 常用于病毒滴度测定的技术有：空斑试验、终点稀释 法、转化实验等。
三、疱疹病毒共同特点

疱疹病毒在外界环境中不易存在，一般需要密 切接触才能传染。尤其是通过交配、舔等导致 的粘膜感染。 在集约化养殖的牛、鸡、猪场中最易发生。

伪狂犬病毒

又名猪疱疹病毒1型，属于疱疹病毒甲亚科，是疱疹病 毒科中感染动物范围广泛，致病性最强的一种。猪、 （鼠）为该病毒的天然宿主。并作为贮主。可感染牛、 羊、犬、猫等其他动物，人类有抗性。 是引起多种动物以发热、脑脊髓炎以及奇痒（猪除外） 为特征的一种疫病。
。
第三节 疱疹病毒科

到目前为止，几乎所有的家畜、家禽均有各自的疱疹 病毒，但一种家禽可感染几种疱疹病毒，一种疱疹病 毒亦可感染几种动物，该病毒分布极其广泛，除家畜、 家禽外，水生动物亦可感染。
一、分类

疱疹病毒分 4个亚科。疱疹病毒甲亚科、乙亚科、 丙亚科及未定名亚科，每个亚科又分若干属。
二、形态
第26章 病毒的检测
病毒检测对于病毒研究和诊断十分重要。检测病毒 的方法共有如下几类： 第一节 病毒的分离与鉴定 第二节 病毒感染单位的测定 第三节 病毒颗粒的检测 第四节 病毒的血清学检测 第五节 病毒的分子检测与诊断
第一节 病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定包括：



病料的采集与准备 病毒的分离与培养 病毒的形态学观察 病毒的理化特性鉴定 病毒的血清学检测 病毒的分子学检测
1
2
3
4
5
2000bp 1000bp

PCR电泳图
本章小结

动物病毒检测最经典的方法是分离与鉴定病毒。此外 还包括病料的采集、接种与培养、形态学观察、理化 特性测定、血清学与分子学鉴定等基本过程。 测定病毒滴度的方法常用空斑实验和终点稀释法。 电子显微镜技术可直接检测样本中的病毒颗粒，血凝 实验用于检测具有血凝特性的病毒。 常用的血清学试验方法有中和试验、血凝抑制试验、 补体结合实验、免疫染色技术、酶联免疫吸附试验等。 病毒核酸的检测可直接提供病毒存在的证据，主要有 PCR、核酸杂交、DNA芯片等技术。
二、病毒的分离与培养

细胞培养、鸡胚及实验动物常用来分离 与培养病毒，其中细胞培养是最常用的 方法。 一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒 分离。

正常细胞
病变细胞（CPE）

引起禽类疾病的病毒一般用鸡胚来分离。根据 病毒的种类，选择适当的接种途径和鸡胚日龄。 常选用9-12日龄鸡胚。（卵黄囊6-8日龄3cm 、 尿囊腔9-10日龄、尿囊膜9-13日龄、羊膜腔10 日龄3-3.5cm ）
一、病料的采集与准备
一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪 便等，主要因动物及病毒的种类而异。 为保证病毒分离成功的几率，采集的样本都要做适当 处理后才增值。 组织脏器，研磨后加抗生素，离心取上清，作为接种 材料； 浓汁、粪便等应加高浓度抗生素处理2-4h或过夜，离 心取上清。作为接种材料。
第一节 痘病毒科
一、分类

根据病毒的特征、自然宿主和特异性抗原，痘病毒科 又分为2个亚科，即 ：

各属的哺乳动物痘病毒在形态、结构、生理生化及抗 原性方面差异不大，在免疫学上亦存在或多或少的交 叉反应。 各种禽痘病毒之间在抗原性上亦极其相似，且存在各 种交叉关系。


但是，禽痘病毒和哺乳动物痘病毒之间不能交叉感染 和交叉免疫。

（2）病理切片：
将绒尿膜固定制作切片，用苏木素和伊红染色，在上 皮细胞内可以见到嗜酸性包涵体。
七、常见的痘病毒

1.鸡痘病毒
致病性：可分为三种病型，即皮肤型、白喉型和混合型。
① 皮肤型：在鸡冠、肉髯和眼皮等处，产生一种特殊的 痘子。 ② 白喉型：主要在口腔和咽喉部分，先在粘膜上生成一 种黄白色小结节，后逐渐融合形成一层黄白色干酪样的假 膜。
中和抗体：动物受到病毒感染后，在体内产生抗体，如果该抗体 能与相应的病毒粒子发生特异性结合，使其丧失感染力，这种抗 体称为中和抗体。

中和试验：是根据抗体能否中和病毒的感染性而建立起来的一种 免疫学方法。其基本过程为：先将抗血清与病毒混合，经过适当 时间的作用后，接种于宿主系统和方法见前。

根据样本的稀释度和空斑数，计算每毫升空斑 形成单位（PFU），即可确定病毒的滴度。 在计算时，仅仅计数含20-100个空斑的培养板。 超过100个空斑会导致计数不准确。

二、终点稀释法

可用于测定几乎所有种类的病毒滴度。包括某 些不能形成空斑的病毒. 本方法还可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。
三、痘病毒的培养

1.痘病毒科在发育的鸡胚绒毛尿囊膜上生长，多数可 在膜上形成痘斑。痘斑的形态、颜色、大小以及形成 的时间因痘病毒的种类而异，可根据痘斑的特征，对 病毒作出初步鉴定。如：
①粘液瘤病毒及天花病毒：引起的痘斑小，而且独立分散，呈 灰白色。 ②牛痘及痘苗病毒：引起（中央）出血、坏死性痘斑。 ③兔纤维瘤病毒：在绒毛尿囊膜上引起极微小的病变，甚至肉眼 难以见到。