北方地区大豆根瘤菌的生物学特性

收稿日期: 2006 01 05; 修订日期: 2006 03 09 基金项目: 沈阳农业大学青年基金项目资助 ( 200409) 作者简介: 刘灵芝 ( 1974 - ), 女, 黑龙江省佳木斯市人, 硕士, 讲师, 主要从事微生物教学与科研。 Te:l 024 - 88849991; T ax: 024- 88487155,
表 2 根瘤菌部分生理生化特性 T able 2 Som e physiological and b iochem ical p roperties of rh izob ia
菌株名 称 St ra in nam e
3- 酮基 乳糖 3- ke to lacto se
淀粉水 解 Sta rch
hydroly sis
葡萄糖 G lucose
+ +++
+ ++
+ +++ +++ +++
++ ++ +++
+ +++ +++ +++ +++
++
碳源 /C arbon source
果糖
麦芽糖
乳糖
Fructose M altose Lactose
++
+
+++
++ +++
+ ++ ++
+ +++
+ + + + ++ + + +
1 材料与方法
1. 1 供试菌株 大豆根瘤 菌菌 株 LK3, LK4, LK5 分离 于辽宁 开
原; 菌株 LB2, LB3, LB4, LB5 分离 于辽 宁本溪; 菌 株 HL 3, H L4, HL5 分离于黑龙 江林口; 菌 株 HH 2, HH 4, HH 5分离于黑龙江海 伦; 菌株 H S1, H S2, H S3 分离于 黑龙江双城。 1. 2 结瘤实验 [ 2]
8. 2
6~ 7
HH 2
4. 1
3~ 4
HH 4
3. 1
9~ 10
HH 5
2. 7
6~ 7
HS3
8. 0
3~ 4
HS2
2. 4
5~ 6
HS1
4. 5
6~ 7
9~ 10 6~ 7 3~ 4 2~ 3 2~ 3 9~ 10 2~ 3 3~ 4
2. 3 生理生化特性 各菌株的生理生化特性见表 2。所有供试菌株均
E- m ai:l lzl iu@ syau. edu. cn
14 2
土壤通报
38 卷
2 结果与分析
将 17株根瘤菌接种到辽豆 15后, 结果表明, 供试 菌株均能与辽豆 15有效结瘤, 菌株平均结瘤数为 47, 说明土著根瘤菌具有较强的结瘤性。但从结瘤情况可
看出, 不同菌株的共生特性存在着明显的差异。其中, 结瘤数最多者 (菌株 H S1)为最少者 (菌株 LK5) 的 6. 1 倍; 植株干重最高者 ( 菌株 HH 4) 为最低者 ( 菌株 LK5) 的 2. 09倍; 根瘤干重最高者 ( 菌株 LB2) 为最低者 ( 菌 株 LK5)的 13倍; 植株全氮量最高者 ( LB4 ) 为最低者 ( LK5) 的 2. 4倍。从实验结果可知, 菌株结瘤数与根 瘤干重之间因根瘤大小不一, 二者没有相关性; 而多数 植株的干重与植株全氮量之间存在着一定的相关性, 这与徐传瑞等 [5]提到的固氮效率高的菌株可以为植 株提供更多的氮素, 因此植株生长更为旺盛, 干重也更 高的观点相符合。实验中部分植株虽干重较大, 但叶 色发黄, 其植株全氮量并不高。因此, 植株干重与全氮 量之间的关系还需进一步考察。
of co lony
nam e
tim e
菌落形成 ( d) Form a tion tim e
of co lony
LK3
3. 6
LK4
13. 5
LK5
7. 9
LB 2
4. 2
LB 3
10. 0
LB 4
6. 95
LB 5
4. 0
H L3
6. 1
H L4
8. 0
3~ 4
来自百度文库H L5
9. 3
9~ 10
HH 1
接种根瘤菌于 YMA 培养液中, 28 摇床培养, 8h 后用 721型 分光光度计测定 光密度值, 持续 测 36~ 42h。以培养时间为横坐标, 光密度值为纵坐标绘制生 长曲线图, 以光密度值倍增时间为菌株世代时间。 1. 4 生理生化实验
3- 酮基乳糖, 淀粉水解, 柠檬酸盐利用实验, 牛肉 膏蛋白胨实验, 明胶水解, 石蕊牛奶反应等按常规方法 进行 [ 3] 。以 上实验均设空白 对照, 3次重 复, 无 菌操 作。 1. 5 碳源利用
-
-
H S3
-
-
-
-
产碱
-
-
-
H S2
-
-
-
-
产酸
-
-
-
H S1
-
-
-
-
产酸
-
-
-
2. 4 碳源利用 靖元孝等 [ 7] 认为慢生型根 瘤菌利用碳源 范围较
窄, 一般不能利用蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖。本研究 中, 葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖五种供试碳源均 可不同程度地被 17株大豆根瘤菌所利用 ( 表 3) 。在 双糖利用中, 快生菌与慢生菌并未表现出明显的区别。 五种碳源中, 所有菌株对果糖具有较好的利用能力, 而 部分菌株如 LK3、LK5、LB3、HH 2则表现为葡萄糖利用 能力较弱。 2. 5 耐盐性
第 38卷第 1期 2007年 2月
土壤通报 Chinese Journal o f So il Sc ience
V o.l 38, N o. 1 Feb. , 2007
北方地区大豆根瘤菌的生物学特性
刘灵芝, 陈玉玲, 陈志刚, 姜 亮, 吕晓锋
( 沈阳农业大学 土地与环境学院, 沈阳 110161 )
将大豆种子于 95% 乙醇 浸泡 30s, 回收 乙醇, 用 0. 1% 氯化汞浸泡 5m in, 回收氯化汞, 无菌水冲洗三次 后, 置于无菌培养皿中 28 催芽, 待根长至 1cm 时, 以 无菌蛭石为基质, 采用砂培法种植大豆。根瘤菌制成
菌悬液, 接种于已经种上豆种的蛭石表面, 每菌株 3次 重复, 设不接种的大豆为对照。 60天后收集根瘤, 测 定根瘤总数, 根瘤干重, 植株干重及植株全氮量。 1. 3 代时测定
以去掉甘露 醇的 YMA 培养基为 基本培养基, 采 用生长谱法 [ 4] 测定各菌株碳源利用情况。
1. 6 耐盐实验 改变 YMA 液体 培养基中氯化钠 含量, 分 别调至
0, 0. 01% , 0. 2% , 0. 5% , 1. 0% 1. 5% , 2. 0% 。灭菌后 分装各试管 5m ,l 以不接菌为对照。 28 摇床培养 3~ 7 天 观察结 果。 1. 7 耐酸碱度
土壤盐碱化是国内外普遍存在的问题。近年来利 用根瘤菌改善盐碱地的研究日趋活跃。因此, 选育耐 盐性强的根瘤菌对改善盐碱地有着积极意义。实验表 明, 所分离根瘤菌均可在无盐培养液中生长, 而少量氯 化钠的添加则有助于根瘤菌的生长。供试菌株均可在 0~ 0. 5% 氯化钠中生长, 当氯化钠浓度达到 1% 时, 绝 大多数根瘤菌生长受到抑制, 氯化钠浓度达到 2% 时, 所有菌株均不生长。 17株根瘤菌中, 仅 HH 4 菌株可 在 1. 5% 氯化钠中生长, 表现出一定程度的耐盐性 ( 表
为使豆科作物高产, 就必须选育出与豆科植物相 匹配的大豆根瘤菌, 因此, 豆科植物与大豆根瘤菌的共 生特性、大豆根瘤菌的生物学特性的研究在菌剂应用 中具有实际意义。
本研究在北方不同地区, 从大豆种植区分别采集 和分离到多株大豆根瘤菌菌株, 并依据其生长特性, 筛 选出有代表性 17株菌株, 在相同条件下研究其生物学 特性, 以期为北方地区大豆根瘤菌的生产应用研究提 供参考依据。
采用 YMA液体培养基, 灭菌后调节 pH 值分别为 4. 0, 5. 0, 6. 0, 7. 0, 8. 0, 9. 0, 10. 0. 培养 7天后观察结 果。
1. 8 温度敏感实验 采用 YMA 液体培 养基, 接种后, 分别 置于 4 ,
13 , 22 , 30 , 39 , 46 培养 7天后观察结果。 2. 1 共生特性
表 4 根瘤菌的耐盐性
T able 4 N aC l tolerance of indigenous rh izob ia
菌株
N aC l(% )
Str a in LK 3 LK 4 LK 5 LB2 LB3 LB4 LB5 HL3 HL4 HL5 HH 1 HH 2 HH 4 HH 5 H S3 H S2 H S1
HH4可耐受 1. 5% 氯化钠, 菌 株 HH 4, HH 2可在 13 ~ 39 生长。
关 键 词: 大豆; 根瘤菌; 生物学特性
中图分类号: Q939 11+ 4
文献标识码: A
文章编号: 0564 3945( 2007) 01 0141 04
北方是我国大豆主产区, 根瘤菌作为一类重要的 土壤微生物类群, 在大豆的氮素营养等方面起着不可 替代的作用。自 1896 年诺贝 ( Nobbe) 证明用根瘤菌 纯培养接种使豆科植物增产以来, 根瘤菌在农业生产 中的应用逐渐受到重视。随着无公害农业的发展, 接 种高 效大豆根 瘤菌, 将产生更 显著的社 会与环 境效 益 [ 1] 。
表 1 根瘤菌的生长特性 T able 1 G row th ch aracteristics of rh izob ia
菌株名称 代时 ( h)
Stra in G enera tion
nam e
tim e
菌落形成 ( d) 菌株名称 代时 ( h)
Form a tion t im e S tra in G enerat ion
-
-
-
LK 5
-
-
-
-
产酸
-
-
-
LB2
-
-
-
-
产碱
-
-
-
LB3
-
LB4
-
-
-
+
产碱
-
-
-
-
-
+
产碱
-
-
-
LB5
-
-
-
-
产碱
-
-
-
HL3
-
-
+
-
产碱
-
-
-
HL4
-
-
+
-
产碱
-
-
-
HL5
-
-
+
-
产碱
-
-
-
HH 1
-
-
-
-
产碱
-
-
-
HH 2
-
-
-
-
产酸
-
-
-
HH 4
-
-
+
-
产酸
-
-
-
HH 5
-
-
+
-
产酸
-
表现为 3- 酮基乳糖, 淀粉水解, 明胶水解, 甲基红试 验、V - P 反应阴性。表明菌株不具备利用相关物质的 酶。部分菌株表现为柠檬酸盐利用、牛肉膏蛋白胨阳 性反应, 表明该菌株具有利用相关物质的能力。石蕊 牛奶反应中, 8株快生菌中除 LB2、LB5产碱外, 其余菌 株均产酸; 9株慢生菌中除 LK5产酸外, 其余均产碱。
++
+ ++
++
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+++
+ + + + ++
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++
蔗糖 Suc rose
++ ++ ++
+ +++ +++
+ + ++ ++ + +++ ++ + +++ ++ +++
摘 要: 对北方地区大豆根瘤菌的生物学特性进行了较为系统的研究, 结果表明, 黑、辽 地区分离、纯化的 17株根瘤 菌
均具有典型的根瘤菌的个体形态和菌落特征, 生理生化指标接近, 可与辽豆 15共生结瘤, 分为快 生菌和慢 生菌。所有根 瘤
菌均可不同程度地 利用供试的 5种碳源。耐 酸碱度、耐盐性及 温度敏感 实验表明, 菌株 H S3 可在 pH 6. 0~ 9. 0生长 , 菌 株
1期
刘灵芝等: 北方地区大豆根瘤菌的生物学特性
1 43
4)。
表 3 根瘤菌的碳源利用情况
T able 3 Carbon sou rce u til ization of ind igenous rh izob ia
菌株
Str a in
LK 3 LK 4 LK 5 LB2 LB3 LB4 LB5 HL3 HL4 HL5 HH1 HH2 HH4 HH5 HS3 HS2 HS1
2. 2 生长特性 分离纯化的 根瘤菌在 YMA 平板 上生长, 细胞杆
状、菌落圆形、隆起、乳白色或半透明, 边缘整齐, 具光 泽。在分离培养过程中, 发现各菌株之间的生长速度 存在很大的差异。部分菌株在 2天内能形成良好的典 型菌落, 而一些菌株则需要 6~ 7d或更长时间才能形 成。按其 生 长速 度可 将 根瘤 菌 分为 快 生 菌与 慢 生 菌 [ 6] , 快生根瘤菌平均代时为 2~ 4h, 从根瘤分离时, 3 ~ 4d可在平板看到单个菌落; 慢生根瘤菌平均代时 7 ~ 9h, 从根瘤分离时, 7~ 10d才能在平板上看到单个 菌落。结合生长代时测定, 所分离 17 株根瘤菌 中, 9 株为慢生菌, 8株为快生菌。各菌株生长特性见表 1。
柠檬酸盐 利用 C it ra te tes t
牛肉膏 蛋白胨
BP
石蕊 牛奶反应
L itm us m ilk test
甲基红 明胶水 解 乙酰 甲基 试 验 Gela tin 甲醇 试验 MR t est hydro lys is V. P. t est
LK 3
-
-
-
-
产酸
-
-
-
LK 4
-
-
-
-
产碱