dna提取个步骤作用原理
提取dna的方法及原理
提取dna的方法及原理提取DNA的方法及原理DNA提取是生物学和遗传学研究中的一项基础操作，它是获取DNA样本的过程。
DNA提取的方法有很多种，下面将介绍几种常用的DNA提取方法及其原理。
1. 高盐法高盐法是一种简单且常用的DNA提取方法。
其原理是利用高盐溶液中DNA与其他细胞组分（如蛋白质）之间的亲和性差异。
在高盐环境下，DNA更容易溶解而不与蛋白质结合，从而实现DNA的提取。
具体步骤包括细胞破碎、加入高盐溶液、离心分离DNA和去除蛋白质等。
2. 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种经典的DNA提取方法。
其原理是利用酚和氯仿两种溶剂的密度差异，将DNA从细胞中分离出来。
具体步骤包括细胞破碎、加入酚/氯仿混合液、离心分离DNA和去除蛋白质等。
3. 硅胶柱法硅胶柱法是一种高纯度DNA提取方法。
其原理是利用硅胶柱上的硅胶颗粒与DNA之间的亲和性差异。
DNA样本在经过一系列处理后，通过硅胶柱，DNA能够与硅胶颗粒结合，而杂质则被洗脱。
最后，通过洗脱DNA，即可获得高纯度的DNA。
硅胶柱法的优点是提取纯度高、操作简单，适用于分子生物学研究和临床诊断。
4. 磁珠法磁珠法是一种高效、快速的DNA提取方法。
其原理是利用带有亲和基团的磁珠与DNA之间的亲和性，实现DNA的选择性吸附和洗脱。
具体步骤包括磁珠悬浮液制备、样本加入、磁珠与DNA结合、磁珠分离、洗脱DNA等。
除了上述常用的DNA提取方法外，还有其他一些特殊的DNA提取方法，如酶解法、离心法、凝胶切割法等。
这些方法在不同的实验和应用中具有各自的特点和优势。
总结起来，DNA提取的方法多种多样，选择适合的方法取决于实验目的、样本类型和实验条件等。
无论采用哪种方法，都需要严格控制实验操作，以确保提取到高质量的DNA样本。
DNA提取的成功与否直接影响到后续的实验结果，因此在进行DNA提取时，需要注意样本的保存、细胞破碎的方式、溶解液的选择等因素，以获得可靠且高纯度的DNA。
提取dna的原理
提取dna的原理
DNA的提取是一种常用于从生物样本中分离纯净的DNA分子的方法。
它通常由以下几个主要步骤构成：
1. 细胞破解：首先，需要将待提取DNA的细胞样本进行破解，使DNA分子从细胞核中释放出来。
这可以通过物理方法（如
高温、机械振荡）或化学方法（如洗涤剂、酶处理）来实现。
2. 去除蛋白质：DNA在细胞中常与蛋白质紧密结合，因此需
要将蛋白质从DNA上去除。
这一步骤通常利用蛋白酶来消化
蛋白质，使其与DNA分离。
3. 沉淀DNA：通过加入盐类或有机溶剂，可以改变溶液中DNA和其他杂质的溶解度差异，从而实现DNA的沉淀。
一般通过离心将沉淀的DNA分离出来。
4. 洗涤和纯化：为了去除残留的杂质，如RNA、蛋白质和酶，需要进行洗涤和纯化步骤。
洗涤常使用乙醇来洗涤DNA，然
后通过离心将DNA沉淀下来。
纯化通常通过使用特定的柱子
或膜来吸附DNA，然后去除其余的杂质。
5. 检测：最后一步是对提取的DNA进行质检，通常使用凝胶
电泳或分光光度计等方法来确定DNA的浓度和纯度。
通过以上步骤，我们可以从生物样本中提取纯净的DNA，然
后用于各种分子生物学实验和应用中。
DNA和RNA提取方法及原理
DNA和RNA提取方法及原理DNA提取方法及原理：1.酚/氯仿法：酚/氯仿法是最常用的DNA提取方法之一、其原理是通过酚类物质将细胞质膜破坏，使DNA从细胞内溶解出来，然后利用氯仿的重度稠化剂作用，将DNA上层的蛋白质、脂类等杂质与下层的DNA分离。
2.盐溶液法：盐溶液法是一种温和的DNA提取方法，适用于多种植物和动物样品。
其原理是将样品细胞裂解后，加入高浓度盐溶液中，通过离心分离出DNA上层液相。
3.硅胶柱法：硅胶柱法是一种高效纯化DNA的方法，可去除杂质并提高DNA的纯度。
该方法利用硅胶柱对DNA进行吸附，去除杂质，然后通过洗脱得到纯净的DNA。
这种方法常用于分离较小的DNA片段。
4.酶解法：酶解法是一种特异性较高的DNA提取方法，通过特定的酶切酶对细胞膜进行消化，将DNA释放出来。
常用的酶解酶有蛋白酶K和蛋白酶E等。
RNA提取方法及原理：1.酚酸法：酚酸法是最常用的RNA提取方法之一、它基于RNA和DNA的相对稳定性差异，利用酚酸破坏细胞膜、沉淀RNA，然后利用酚酸与蛋白质和DNA 形成复合物，分离RNA。
2.硅胶柱法：硅胶柱法也适用于RNA提取。
与DNA的硅胶柱法不同的是，RNA在硅胶柱上结合后会进行一系列的洗脱步骤，除去污染物。
该方法能有效去除DNA、蛋白质、盐和其他杂质。
3.离心收集法：离心收集法是一种简便、快速的RNA提取方法。
根据RNA在水相中的溶解性，通过离心将细胞裂解液中的RNA分离出来，然后加入酒精沉淀纯化。
4.硅酸盐法：硅酸盐法是一种特异性较高的RNA提取方法，通过利用试剂中的硅酸盐吸附RNA，并在洗涤步骤中去除杂质，从而得到纯净的RNA。
提dna步骤及原理
提dna步骤及原理DNA提取是一种分离纯化DNA的过程，它可以用于分子生物学的各种实验和研究。
以下是DNA提取的步骤及原理：步骤1：细胞破碎首先，需要将目标细胞破碎以释放DNA。
这可以通过机械方式（如刮取细胞）或者化学方式（如孵育细胞在酶溶液中）来完成。
破碎细胞的目的是破坏细胞膜和核膜，释放DNA。
步骤2：细胞溶解接下来，要将破碎细胞中的蛋白质和其他细胞组分溶解。
这可以通过加入表面活性剂（如SDS）来破坏蛋白质的结构，使其变为可溶解状态。
细胞溶解的目的是除去蛋白质和其他细胞成分，保留DNA。
步骤3：蛋白质沉淀通过加入盐类，可以使DNA溶液中的蛋白质形成沉淀。
盐类中的离子与蛋白质形成复合物，使其聚集在一起并沉淀到溶液底部。
这一步的目的是除去大部分蛋白质，净化DNA溶液。
步骤4：DNA沉淀将溶液中的DNA沉淀到管壁上，可以通过加入酒精或其他有机溶剂来实现。
这些溶剂改变了DNA溶液的物理性质，使DNA变得不溶于水而沉淀。
这一步的目的是分离纯化DNA。
步骤5：洗涤和纯化DNA最后，通过洗涤沉淀的DNA，可以除去残留的盐类和其他杂质。
洗涤可以使用乙醇或其他缓冲液。
洗涤后，可以用缓冲液溶解DNA并进一步纯化。
DNA提取的原理是基于DNA和其他细胞成分的物理和化学特性的差异。
其中，细胞破碎和溶解步骤破坏了细胞膜和核膜，并释放了DNA。
蛋白质沉淀和DNA沉淀步骤利用了盐类和有机溶剂对不同分子的溶解性差异，将蛋白质和DNA分离。
洗涤步骤则进一步清洁和纯化DNA。
整个过程旨在从复杂的细胞混合物中分离纯化出DNA，以便在后续实验中进行分析和应用。
DNA的提取的原理和方法
DNA的提取的原理和方法DNA的提取的原理和方法一、实验原理DNA是生物体遗传信息的主要载体，它是一种长链的生物高分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶）按照特定的顺序排列组成。
DNA主要存在于细胞的细胞核中，也有一些存在于线粒体和叶绿体中。
DNA提取的原理主要是利用不同物质在特定溶剂中的溶解度不同，通过控制溶剂的种类和条件，将DNA从细胞中分离出来。
在DNA提取过程中，通常需要使用一些化学物质，如苯酚、氯仿等，来破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。
同时，还需要使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质，以便更好地分离DNA。
二、实验方法1.材料准备提取DNA的材料可以是动物组织、植物组织、微生物等。
不同的材料需要采用不同的处理方法，以最大限度地获得高质量的DNA。
例如，对于植物组织，可以使用液氮研磨法或CTAB法等方法进行提取。
2.细胞裂解细胞裂解是DNA提取的关键步骤之一，目的是破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。
常用的裂解方法有机械法、化学法和酶法。
机械法包括研磨、超声波等；化学法使用化学物质如苯酚、氯仿等；酶法使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质。
3.蛋白质去除在细胞裂解后，蛋白质也会随着DNA一起释放出来。
为了获得纯净的DNA，需要去除蛋白质。
常用的去除蛋白质的方法有苯酚/氯仿抽提法和盐析法。
苯酚/氯仿抽提法利用苯酚和氯仿的特性，将蛋白质和DNA分离开来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使蛋白质沉淀，而DNA则溶解在上清液中。
4.DNA沉淀去除蛋白质后，需要通过一定的方法将DNA沉淀下来。
常用的沉淀方法有乙醇沉淀法和盐析法。
乙醇沉淀法利用乙醇能够使DNA沉淀的特性，将DNA从溶液中分离出来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使DNA沉淀，然后通过离心等方法将DNA 收集起来。
5.DNA洗涤和溶解DNA沉淀后，需要用70%乙醇洗涤数次以去除杂质，然后用适量的TE缓冲液或去离子水溶解DNA。
TE缓冲液是一种常用的维持DNA稳定的缓冲溶液，含有Tris-HCl和EDTA二钠等成分。
DNA提取个步骤作用原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液I :50mM 葡萄糖，25mMTris-HCI(pH8. "0)，10mMEDTA(pH8."0)。
1MTris-HCI<!--[if !supportAnnotations]-->[t1]<!--[endif]--> (pH8."0)12."5mI，0."5M EDTA(pH8.0）10ml，葡萄糖4."730g,加ddH20至500ml。
在10lbf/in2 高压灭菌15min，贮存于4C。
提取dna的方法
提取dna的方法提取DNA的方法是从一种物质中检索出DNA分子的过程，包括酶切、基因工程等。
DNA提取方法有核酸沉淀法、缓冲溶液法、植物提取法、实验室提取法等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
1、核酸沉淀法：核酸沉淀法是一种常用的DNA提取方法，它的原理是通过pH调节使DNA沉淀，然后将DNA从溶液中收集。
步骤如下：首先，将样品用盐水或蛋白酶/胰蛋白酶消化；其次，加入超纯水、EDTA缓冲液和NaCl，调节pH至5.5；然后，加入乙醇，溶解DNA并沉淀；最后，在0℃-4℃维持1小时，收集沉淀的DNA。
2、缓冲溶液法：缓冲溶液法是通过改变溶液的pH值来提取DNA的一种方法，它利用DNA的结合能力和电性作用力，将DNA结合到某种特定的溶剂上，然后从溶剂中提取出来。
步骤如下：首先，将样品加入缓冲溶液，消化；其次，加入非离子表面活性剂，使DNA脱水；然后，加入离子表面活性剂，将DNA与其他组分分离；最后，用低温冷藏保存，以便收集DNA。
3、植物提取法：植物提取法是通过一系列物理和化学步骤，从植物细胞中提取DNA的一种方法。
步骤如下：首先，将植物细胞磨碎，用盐水悬浮；其次，加入碱性溶液，使细胞膜脱落；然后，加入非离子表面活性剂，溶解脱落的细胞膜，将DNA沉淀；最后，加入乙醇，将DNA沉淀，冷却保存，然后收集DNA。
4、实验室提取法：实验室提取法是一种基于细菌的实验室方法，它利用发酵的细菌细胞中的DNA进行提取。
步骤如下：首先，将细菌细胞加入特定的溶剂液中，使细胞膜脱落；其次，加入特定的酶和蛋白酶，将细胞内的DNA 溶解；然后，加入非离子表面活性剂，将溶解的DNA沉淀；最后，用乙醇沉淀DNA，将沉淀的DNA精细收集。
以上就是提取DNA的方法，主要有核酸沉淀法、缓冲溶液法、植物提取法和实验室提取法四种方法，它们都具有不同的优点和缺点，因此，在实际应用中，应该根据样品的不同，选择适当的提取方法。
提取dna的方法及原理
提取dna的方法及原理提取DNA的方法及原理DNA是生物体中的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。
提取DNA是研究基因组学、遗传学等领域的重要基础工作。
本文将介绍几种常用的DNA提取方法及其原理。
1. CTAB法CTAB法是一种经典的DNA提取方法。
其原理是利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）与DNA结合形成离子对，然后通过盐溶液的浓度差异，使DNA从溶液中沉淀出来。
该方法适用于提取植物细胞中的DNA。
2. 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种常用的DNA提取方法。
其原理是利用DNA在酚相中溶解，而其他细胞组分则在氯仿相中溶解，通过酚/氯仿两相的分离，从而将DNA分离出来。
该方法适用于提取动物细胞和细菌等样品中的DNA。
3. 硅胶柱法硅胶柱法是一种高效、纯化度较高的DNA提取方法。
其原理是利用硅胶柱上的硅胶颗粒与DNA之间的亲和性，将DNA吸附在硅胶颗粒上，然后通过洗涤、离心等步骤，将DNA从硅胶颗粒上洗脱下来。
该方法适用于提取各种样品中的DNA。
4. 磁珠法磁珠法是一种基于磁性颗粒的DNA提取方法。
其原理是将带有亲和基团的磁性颗粒与DNA结合，然后通过磁力的作用，将颗粒和DNA一起沉淀下来，最后通过洗涤等步骤，将DNA从颗粒上洗脱下来。
该方法具有快速、高效的特点，适用于高通量的DNA提取。
以上是几种常用的DNA提取方法及其原理。
不同的方法适用于不同类型的样品和实验需求。
在实际操作中，可以根据具体情况选择合适的方法进行DNA提取。
同时，为了保证提取到的DNA质量和纯度，还需要注意提取过程中的一些关键步骤，如细胞破碎、蛋白质酶处理、DNA沉淀等。
DNA的提取是基因研究和遗传学研究的重要步骤，通过合适的提取方法可以获取到高质量的DNA样品，为后续的实验和分析提供可靠的基础。
随着技术的不断进步，提取方法也在不断改进和优化，为科学研究提供更多的可能性。
DNA提取原理和方法
DNA提取原理和方法1.细胞破裂：细胞膜是由脂质双层构成的，通过物理方法（如振荡、搅拌、超声波等）或化学方法（如洗涤缓冲液、去溶液等）可以破坏细胞膜，使得细胞中的DNA能够被提取出来。
2.核膜的溶解：核膜是由核孔复合体构成的，核孔复合体可以选择性地允许一些小分子进入或离开细胞核。
通过添加一些化学物质，如柠檬酸、盐酸或洗涤缓冲液，可以使核膜溶解，从而使DNA能够被提取出来。
3.蛋白质去除：细胞核中存在许多蛋白质，如组蛋白、核酸酶等，这些蛋白质会干扰DNA的提取和后续实验。
通过加入试剂，如蛋白酶K、SDS溶液等，可以将蛋白质去除，从而得到纯净的DNA。
1.苏亮溶液法：将待提取的细胞悬浮于苏亮溶液中，通过加热、浸泡、振摇等方法破裂细胞膜，然后加入蛋白酶K和洗涤缓冲液进行蛋白质去除，最后经过酚/氯仿提取和乙醇沉淀，得到纯净的DNA。
2.酚/氯仿法：将细胞破裂后的混合物加入等体积的酚/氯仿溶液中，通过离心将混合物分为上层DNA和下层蛋白质/核酸碎片的两个相。
然后将上层DNA转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀DNA，再经过洗涤和离心，得到纯净的DNA。
3.膜柱法：将细胞破裂后的混合物加入DNA结合柱中，经过多次洗涤去除杂质，然后通过加入洗脱缓冲液使DNA从膜柱中洗脱，最后经过乙醇沉淀和洗涤，得到纯净的DNA。
这种方法可以自动化操作，更方便快捷。
1.使用无菌技术和无菌试剂，避免污染DNA样品。
2.细胞溶解和处理的时间应尽可能缩短，以减少DNA的降解。
3.加入酶类试剂时，应在适当的温度和时间范围内进行，以保证酶的最佳活性。
4.完成DNA提取后，应使用紫外线分光光度计检测DNA的浓度和纯度，以确保提取的DNA质量符合实验要求。
综上所述，DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础步骤，通过破裂细胞膜、溶解核膜和去除蛋白质，可以从细胞中提取出纯净的DNA。
常用的DNA提取方法包括苏亮溶液法、酚/氯仿法和膜柱法。
DNA提取原理和方法
DNA提取原理和方法样本处理是DNA提取的第一步，主要目的是将样本处理成适合提取DNA的形式。
不同的样本需要不同的处理方法。
例如，从动物组织中提取DNA时，可能需要粉碎组织样本，使得细胞更容易破碎，从而释放DNA。
而从细菌培养液中提取DNA时，则需要先离心去除其他细胞组分，然后使用溶解酶破坏细胞壁。
细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一、细胞破碎的目的是释放DNA分子，使其能够在后续步骤中被分离和纯化。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解破碎。
机械破碎是使用物理力量（例如，搅拌、磨碎、超声波等）来破坏细胞壁，从而释放细胞内的DNA。
化学破碎是使用化学物质（例如，洗涤剂、酸、碱等）来破坏细胞壁和细胞膜，从而释放DNA。
酶解破碎是使用特定酶（例如，蛋白酶、胰酶等）来降解蛋白质和核酸，从而破碎细胞。
核酸纯化是DNA提取的核心步骤，其目的是将DNA与其他细胞组分（如蛋白质、RNA、杂质等）分离。
核酸纯化的方法有很多种，常见的包括酚-氯仿提取法、离心柱纯化法和磁珠纯化法。
酚-氯仿提取法是最常用的DNA纯化方法之一、该方法先使用酚提取样品中的核酸，然后使用氯仿去除蛋白质。
离心柱纯化法是使用离心管柱进行分离和纯化，其中DNA结合到离心柱上的固相载体上，而其他细胞组分则被洗脱。
磁珠纯化法是使用表面被修饰的磁珠与DNA结合，并使用磁场来分离和纯化DNA。
DNA提取完成后，需要对提取得到的DNA进行测量。
DNA的浓度和纯度测量是判断DNA质量的重要指标。
常用的测量方法包括比色法、荧光分光光度法和凝胶电泳法。
比色法是使用特定的染料与DNA结合，并通过比色读数来测量DNA的浓度。
荧光分光光度法是使用荧光分光光度计来测量DNA与DNA结合染料的荧光强度，进而计算DNA浓度。
凝胶电泳法是将DNA经过电泳分离，然后使用负载荧光染料或核酸染料在凝胶中可视化DNA，从而判断其浓度和纯度。
总之，DNA提取是从生物样本中分离和纯化DNA的重要步骤。
dna分离纯化方法及原理
dna分离纯化方法及原理
1. 酚-氯仿抽提法：这是一种传统的 DNA 提取方法。
原理是利用酚和氯仿的混合物来溶解细胞膜和蛋白质，使 DNA 与其他细胞成分分离开来。
然后通过离心和有机溶剂的萃取，将 DNA 从混合物中提取出来。
2. 硅胶柱层析法：该方法基于 DNA 与硅胶柱子之间的吸附和解吸作用。
将待提取的样本加载到硅胶柱上，通过柱子的吸附作用，使 DNA 与其他杂质分离开来。
然后用适当的洗脱缓冲液将 DNA 从柱子上洗脱下来。
3. 磁珠法：这是一种利用磁性颗粒结合 DNA 的方法。
将磁珠与样本混合，使 DNA 与磁珠结合。
通过外部磁场的作用，可以将磁珠与结合的 DNA 分离开来，从而实现 DNA 的纯化。
4. 质粒抽提法：这种方法适用于提取质粒 DNA。
通过碱处理破坏细菌细胞壁和细胞膜，使质粒 DNA 从细菌细胞中释放出来。
然后通过离心和沉淀等步骤，将质粒 DNA 与其他杂质分离开来。
5. 超声波法：利用超声波的能量，将细胞破碎，使 DNA 释放到溶液中。
然后通过离心和沉淀等步骤，将 DNA 与其他杂质分离开来。
这些方法的原理基于不同的物理、化学或生物学原理，旨在从复杂的生物样本中选择性地分离和纯化 DNA。
选择合适的方法取决于样本类型、纯度要求和实验目的等因素。
在 DNA 分离纯化过程中，还需要注意操作规范、防止污染，并进行质量控制和检测，以确保获得高质量的 DNA 用于后续的分析和实验。
简述dna提取过程及原理
简述dna提取过程及原理
DNA提取是从细胞中分离纯化DNA的过程，常用于生物学研究、基因检测、法医学等领域。
DNA提取的原理基于细胞膜的破裂和DNA
的溶解、沉淀、洗涤等步骤。
DNA提取的一般步骤如下：
1. 细胞破裂，通过物理或化学方法破坏细胞膜，使DNA暴露在
溶液中。
物理方法包括机械剪切、超声波破碎等，化学方法包括洗
涤剂、酶等的使用。
2. 蛋白质消化，加入蛋白酶或蛋白酶K等，消化蛋白质，使其
不干扰DNA的提取。
3. DNA溶解，加入盐溶液和螯合剂，使DNA从蛋白质中解离出来。
4. DNA沉淀，通过加入酒精或其他沉淀剂，使DNA在溶液中沉
淀下来。
5. DNA洗涤，用酒精洗涤去除杂质，使DNA纯化。
6. DNA溶解，用缓冲液溶解沉淀下来的DNA，得到纯化的DNA 溶液。
DNA提取的原理主要依靠细胞膜的破裂和DNA与其他物质（如蛋白质、RNA等）的物理化学性质差异。
细胞破裂方法可以通过机械剪切细胞壁或超声波破碎细胞膜，使DNA释放到溶液中。
蛋白质消化通过加入蛋白酶或蛋白酶K等酶类，消化蛋白质，以防止其干扰DNA的提取。
DNA溶解过程中，盐溶液和螯合剂的加入可以使DNA 从蛋白质中解离出来。
DNA沉淀是通过加入酒精或其他沉淀剂，使DNA在溶液中沉淀下来。
洗涤步骤则利用酒精洗涤去除杂质，以获得纯化的DNA。
最后，通过溶解沉淀下来的DNA，得到纯化的DNA溶液。
总结而言，DNA提取的过程和原理主要包括细胞破裂、蛋白质消化、DNA溶解、DNA沉淀、DNA洗涤和DNA溶解等步骤，通过这些步骤可以从细胞中分离纯化DNA。
提取dna的原理
提取dna的原理
DNA提取是分子生物学实验中的一项基础工作，它是从生物样品中分离出DNA分子的过程。
DNA提取的原理主要包括细胞破碎、蛋白质沉淀和DNA沉淀等步骤。
下面将详细介绍DNA提取的原理及各个步骤的具体操作。
首先，DNA提取的第一步是细胞破碎。
在这一步骤中，需要将生物样品（如细胞、组织等）加入到细胞破碎缓冲液中，并通过机械方法（如搅拌、超声波破碎等）或化学方法（如裂解酶等）破坏细胞膜和细胞壁，释放出细胞内的DNA分子。
接下来是蛋白质沉淀步骤。
在细胞破碎后，需要将细胞内的蛋白质通过加入蛋白酶等方法进行降解，使其沉淀到溶液底部。
这一步骤的目的是去除细胞破碎后产生的蛋白质等杂质，以便后续提取纯净的DNA。
最后是DNA沉淀步骤。
在蛋白质沉淀后，可以通过加入盐类和醇类等物质使DNA分子沉淀到溶液中。
通过离心等方法将沉淀的DNA分离出来，最终得到纯净的DNA样品。
DNA提取的原理可以简单总结为细胞破碎、蛋白质沉淀和DNA 沉淀三个步骤。
在实际操作中，可以根据不同的样品类型和实验要求进行相应的改进和优化，以提高DNA提取的效率和纯度。
总之，DNA提取是分子生物学实验中非常重要的一步，它为后续的PCR、酶切、测序等实验奠定了基础。
掌握DNA提取的原理及操作技巧对于科研工作者来说至关重要，希望本文的介绍能够对大家有所帮助。
DNA和RNA提取方法及原理
DNA和RNA提取方法及原理DNA提取方法：1.酚/氯仿方法：这是最早应用的DNA提取方法之一，适用于绝大多数生物样本。
原理是利用酚酸抽提DNA，酚酸能溶解细胞膜和蛋白质，而DNA在酚相沉淀。
然后用氯仿提取，分离DNA与酚相中的蛋白质和RNA。
最后通过乙醇沉淀纯化DNA。
这种方法可以得到高质量的DNA，但操作过程相对繁琐。
2.硅胶基质法：硅胶基质可吸附DNA，该方法使用硅胶膜或硅胶粉末来固定DNA，通过洗涤去除杂质，最后用洗脱液从硅胶上洗脱DNA。
这种方法具有简便和高纯度的优点，适用于大规模提取DNA。
3.盐酸法：盐酸法以酸性条件下使DNA变为不溶性沉淀物的原理，通过加入盐酸将DNA沉淀下来，然后经过洗涤和乙醇沉淀纯化。
这种方法适用于提取纯度要求不高的DNA。
RNA提取方法：1.酚酸提取法：这是最常用的RNA提取方法之一、原理类似于DNA的酚/氯仿法，通过酚酸将核酸与蛋白质和其他杂质分离。
然后通过氯仿脱脂，去除酚相中的蛋白质，并且获得RNA水相。
最后通过乙醇沉淀纯化RNA。
这种方法适用于大多数样品，得到的RNA纯度较高。
2.硅胶基质法：与DNA提取类似，它也适用于RNA的提取。
通过硅胶膜或硅胶粉末结合RNA并洗脱，用洗脱液分离RNA与杂质。
这种方法适用于大规模提取RNA。
3.氯仿法：这是一种较为简便的RNA提取方法，它通过氯仿脱脂去除脂质和其他杂质，并且能够同时去除DNA。
最后用乙醇沉淀纯化RNA。
这种方法适用于需要较快速提取RNA的情况。
DNA和RNA提取的基本原理都是通过分离和纯化DNA或RNA与其他杂质的物质。
酚酸提取法和硅胶基质法同属于酚酸法，都是通过酚酸和氯仿来分离DNA或RNA与蛋白质和其他杂质。
其中酚酸能溶解细胞膜和蛋白质，并且DNA或RNA在酚相中沉淀，而蛋白质和RNA在氯仿相中溶解。
然后通过洗脱和纯化步骤，从酚酸相中提取DNA或RNA。
盐酸法与酚酸法不同，它是通过酸性条件下使DNA变为不溶性沉淀物来分离DNA与其他杂质。
DNA提取方法原理简介
DNA提取方法原理简介DNA是脱氧核糖核酸，是绝大多数生物的最主要的遗传物质。
随着生命科学技术的发展，从生物样本中提取DNA的方法也日益多样、成熟。
下面就几种常见的DNA提取方法的原理作个简介。
1 酚氯仿法酚氯仿法为DNA提取的经典方法，价格较低。
加入Tris饱和酚能使蛋白质变性，令DNA与组织蛋白质分开，同时抑制DNase的作用，保护DNA免于降解。
随后加入的氯仿/异戊醇经过混匀和离心后，能使溶液分为上层水相和下层有机相。
由于DNA存在于水相，蛋白质等杂质存在于有机相，这样就能使DNA与其他杂质分开。
吸取上层水相后，加入无水乙醇能使DNA从溶液中沉淀下来，经过离心去除上清液就能得到DNA沉淀了。
可以再使用75%乙醇洗涤一次，去除残留的一些有机物，使DNA更纯。
最后等乙醇挥发干燥后，加入TE缓冲液就能得到理想的DNA样本。
2 Chelex-100法Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学树脂，可以螯合多价离子。
Chelex-100法提取DNA是一种快速方便的方法，但DNA模板的纯度比较低，不适合长期保存。
Chelex-100溶液与血液样品等混匀后，通过煮沸、离心等步骤，可以使样品中大部分蛋白质变性，金属离子被Chelex-100螯合，从而使样品上清液的DNA模板能用于后续反应。
3 膜吸附法常用硅胶膜作为吸附DNA的载体。
部分的商品化DNA提取试剂盒会采用这种方法。
提取的DNA纯度高，效果好，但试剂盒成本较高。
其原理是在高盐缓冲液条件下，硅胶膜会吸附DNA，经过数次缓冲液洗涤离心后，吸附在膜上的DNA已经很纯，这时再用适当体积的低盐TE缓冲液进行洗脱。
4 磁珠法经过特殊表面处理的磁珠，在缓冲液条件下对DNA有很强的吸附力。
部分的商品化DNA提取试剂盒会采用这种方法。
提取的DNA纯度高，效果好，但试剂盒成本较高。
其原理是在缓冲液条件下，磁珠能吸附DNA，通过使用磁力棒能使磁珠聚集，去除含杂质的上清液。
试剂盒法提取dna原理
试剂盒法提取dna原理
试剂盒法DNA提取是一种常用的方法，通过使用特定的试剂盒，能够从样品中有效提取出DNA。
其原理主要包括以下步骤：
1. 细胞破碎：首先需要将样品中的细胞壁和细胞膜破坏，使细胞释放出DNA。
这可以通过机械方法（如振荡、切割）、温
度变化以及特定的酶来实现。
2. 蛋白质沉淀：在细胞破碎的过程中，细胞内的蛋白质也会被释放出来。
为了去除这些蛋白质，可以添加蛋白酶等试剂，使蛋白质与DNA分离，并沉淀在溶液的底部。
这样就可以把上
清液从底物中分离出来。
3. DNA纯化：经过蛋白质沉淀后，可以使用特定的柱子或者
膜来吸附DNA。
这些柱子或膜上有特定的化学物质，能够选
择性地结合DNA分子，而其他杂质则会被洗脱掉。
在洗脱过
程中，可以使用一系列不同浓度的缓冲液，从而实现对DNA
的纯化。
4. 洗脱和溶解：经过柱子或膜的洗脱步骤后，DNA可被洗脱
并收集。
根据需要，可以选择使用纯水或特定的溶液来溶解DNA，以便于后续的实验操作，如PCR扩增、酶切和测序等。
总之，试剂盒法DNA提取是一种方便、快速且可靠的DNA
提取方法，通过一系列的步骤能够有效地从样品中获取到高质量的DNA。
专业资料 DNA提取原理及步骤简述
DNA提取原理及步骤简述
DNA提取的步骤主要有裂解、结合、洗涤和洗脱。
以下是各步骤的作用原理：
1.裂解：这一步是必须的，因为DNA通常从细胞或其他生物
物质中被释放出来。
细胞裂解可以通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
其中，酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶使细胞破裂，核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
2.结合：磁珠表面带负电荷，磁珠buffer是高盐环境有带
正电荷的盐离子，样本被buffer影响，磷酸基团带负电荷。
3.洗涤：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪
等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法
可将核酸分离、纯化。
用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此
是理性的沉淀剂。
当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
4.洗脱：加水或者EB破坏高盐环境，形成低盐环境，使
DNA从磁珠上脱落。
请注意，以上步骤的作用原理可能因具体实验条件和设备而有所不同。
在进行实验时，请根据具体情况调整步骤和参数。
DNA提取过程及原理
DNA提取过程及原理1.样品收集：收集待提取DNA的样品，可以是人体组织、血液、细菌培养物等。
2.细胞破碎：将样品中的细胞破碎开来，有多种方式可以实现，如机械破碎、化学破碎或热力破碎。
机械破碎通常使用搅拌器、超声波打碎器等设备，化学破碎则使用酶（如蛋白酶和蛋白酶K）或洗涤剂（如肌苷）、盐等化学试剂。
热力破碎则是通过高温处理来破坏细胞膜。
3.去除蛋白质：使用蛋白酶等酶类或具有蛋白溶解/去除功能的试剂，将破碎的细胞中的蛋白质降解或去除。
酶类操作在室温下进行，可选择随后使用室温下酶解、冷冻酶解或热酶解。
此步骤一般在细胞破碎后立即进行，以免DNA被酶降解。
4.DNA沉淀：加入盐溶液和异丙醇/冷乙醇等试剂，将DNA分离出来。
该过程中DNA会在溶液中以线状凝聚体的形式出现，通过离心将DNA沉淀到离心管底部。
5.洗涤：将DNA经过洗涤步骤，去除其他杂质。
洗涤可使用700-900mL/L的酒精或酒精/乙醚，其目的是去除未溶解的溶质和高浓度盐。
6.干燥：用乙醇或丙酮将样品溶解，并在低真空或加热条件下蒸发溶剂，使DNA干燥。
1. 为避免DNA在提取过程中受到污染，操作室需要经过RNAse的去污染处理，使用无腺病毒和试剂。
同时，使用无菌手套和无菌环境进行操作。
2. 提取试剂的选择：不同实验需求可以选择不同的DNA提取试剂盒，如常见的酚-氯仿法（phenol-chloroform extraction）或柱式DNA提取试剂盒（column-based DNA extraction kits）等。
3.注意细胞破碎方法的选择：细胞破碎时需根据待提取样品的特点选择合适的方法，如易破裂的细菌可以选择化学破碎，而较为坚硬的植物细胞则需要机械破碎。
DNA提取是分子生物学研究的基础工作之一、虽然有多种DNA提取方法和试剂可供选择，但其基本步骤和原理基本相同。
通过合理的操作和选择适合的提取试剂，可以获得高质量和纯度的DNA，为后续的分子生物学研究提供可靠的基础。
利用试剂盒提取dna的原理
利用试剂盒提取dna的原理好的,我利用试剂盒提取DNA的详细步骤和原理说明如下:一、试剂盒提取DNA的主要原料和工具1. 含有DNA的样品,可以是动植物组织、血液、体液等。
2. 裂解液或SDS,用于裂解细胞,释放出DNA。
3. 蛋白酶K,可以裂解样品中的蛋白质。
4. 盐溶液,提供离子环境,使DNA溶解。
5. 酒精,用于DNA的沉淀。
6. 洗涤液,洗去杂质。
7. Tris-HCl缓冲液或TE缓冲液,用于溶解和保持DNA。
8. 吸附管和收集管,固定膜可吸附DNA。
9. 离心机,用于分离液体。
二、DNA提取试剂盒的工作原理1. 首先需要破碎样品,增加暴露的DNA量。
然后加入裂解液和蛋白酶K,在一定温度下孵育,裂解细胞,使DNA从细胞核和细胞质中释放出来。
2. 加入适量盐溶液,可以使DNA溶解在溶液中。
盐溶液还可以使蛋白质变性沉淀,便于除去蛋白质。
3. 将溶液遍过固定膜的吸附管,DNA会被膜吸附,而其他杂质如蛋白质、RNA则流过。
4. 使用含酒精的洗涤液对膜进行洗涤,可以去除剩余的蛋白质、脂肪等污染物。
5. 最后向膜中加入缓冲液,DNA会从膜中溶出,并流进收集管中。
6. 收集管中的溶液即为所提取的DNA。
三、DNA提取试剂盒的具体操作步骤1. 称取适量样品加入裂解液,加热孵育使细胞裂解。
2. 加入适量蛋白酶K继续孵育,充分裂解蛋白质。
3. 加入適量盐溶液,震荡混合。
4. 将混合液转移到吸附管中,短时间离心。
5. 弃去吸附管中的液体,将洗涤液加到管中,重复离心。
6. 将吸附管放入收集管,向膜中加入缓冲液,静置后离心收集DNA溶液。
7. 取出收集管中的溶液,即为提取的DNA。
可进行后续实验。
8. 也可以使用分光光度计,通过比值检测DNA的纯度和含量。
四、小结DNA提取试剂盒利用了DNA的稳定性以及其可以被膜吸附的特性,通过裂解、除蛋白、洗涤、溶出等步骤,快速高效地从样品中提取并富集DNA。
正确使用试剂盒,可以在短时间内获得纯净的DNA样本,为基因实验提供优质的原料。
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质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]-->[t1]<!--[endif]--> (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA 变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。
4℃保存备用。
溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl 而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让<!--[if !supportAnnotations]-->[t3]<!--[endif]--> 人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。
但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一般在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。
在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9. 沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。
构建目的基因的真核表达载体目的:构建目的基因的真核表达载体历时整整一学期,期间经历了很多挫折,遇到很多问题,也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历,把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.分步来说:一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成:这里有很多血与泪的教训。
我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。
最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基），后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。
现在想想，有几点教训：(1)尽量避免长引物的合成。
越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样(2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾（3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起2.Pfu酶扩增：（1）扩增效率低的问题：往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。
解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu，总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3’互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t－easy中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。
实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。
（2）pfu保真性的问题：即使是pfu，也会出错。
现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。
虽然都是pfu，但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。
我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。
所以万不可在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。
3．cDNA模板的问题：在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板,因此在开始要准备足够的cDNA。
100ul，200ul都不为过。
新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在－80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。
当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA 的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。
二．酶切的问题：用于构建的酶切一定要非常充分！新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。
因为用于“酶切鉴定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分，才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。