细菌的鞭毛染色和形态观察

细菌的鞭毛染色和形态观察

胡雪芳 201300261033

【实验目的】

1.学习掌握鞭毛染色方法，观察鞭毛形态特征。

2.巩固显微镜的使用和无菌操作技术。

3.观察细菌的运动特征。

【实验原理】

1.鞭毛

鞭毛（flagellum）在某些细菌菌体上具有细长而弯曲的丝状物，称为鞭毛。鞭毛的长度常超过菌体若干倍。在某些菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，少则1-2根，多则可达数百根。这些丝状物称为鞭毛，是细菌的运动器官。

细菌鞭毛极纤细，直径一般为0.01-0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。但如采用特殊的染色法，则普通光学显微镜下也能看到。

2.鞭毛的分类

通常根据鞭毛的位置可

以将鞭毛分为两大类：端生

鞭毛和周生鞭毛，端生鞭毛

又可以细分为端生单鞭毛，

单端丛生鞭毛和两端丛生图1.鞭毛的种类鞭毛。形态如图1所示。

A端生单鞭毛，B单端丛生鞭毛，C两端丛生鞭毛，D周生鞭毛。

3.鞭毛染色法

鞭毛染色法的基本原理是：即在染色前先用媒染剂（丹宁酸或明矾钾）处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。

采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或压滴法直接在光学显微镜下检查活细菌是否有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。

悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。

压滴法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。

【实验材料】

1.菌株及其培养条件

本次实验采用的是不同鞭毛着生方式的细菌，具体见表1。

表1. 不同鞭毛着生方式的细菌。

每个人做三个菌株，为2+X模式，即2为必须做的两个菌株：选择铜绿假单胞菌作为单极毛代表，大肠杆菌作为周生极毛代表。X为枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌和环状芽孢杆菌，4者任选一个，均为周生鞭毛的代表。

2.染色液和试剂

硝酸银染液、0.01%美蓝水溶液；蒸馏水/生理盐水，香柏油、二甲苯等。

3.其他

普通光学显微镜、吸水纸、擦镜纸、滤纸、载玻片、酒精灯、接种环、木夹、记号笔、镊子等。

【实验步骤】

硝酸银染色法

1.清洗玻片

选择光滑无裂痕的玻片，置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。

2.菌液的制备

方法一：

菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌战新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱培养12-16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1-2mL无菌水的试管中，使菌液

呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min，让幼龄菌的鞭毛松展开。

方法二：

菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上反复活化5-7代，在0.6%琼脂的牛肉膏蛋白胨半固体培养基上37℃、14-16小时培养物。滴加1-2mL无菌水至培养平板上，轻轻摇动，制备成轻度混浊菌悬液，转移到1.5mL 离心管中（将该管放在37℃恒温箱中静置10min，让幼龄菌的鞭毛松展开。

3.制片

用镊子取一95%酒精浸泡的载玻片，在酒精灯火焰上灼烧使其干燥，待其冷却后，用记号笔做好标记。然后取一滴菌液，滴在载玻片一端，微微倾斜载玻片，使菌液流向另一端，接着用滤纸片吸去多余悬液，将涂片放空气中自然干燥。

4.制片

首先滴加硝酸银鞭毛染液A覆盖涂片3-5min，到时间后，用蒸馏水细流水冲洗，将染液A冲洗干净，再用染液B冲洗残水，然后用染液B覆盖菌面数秒至1min，至菌面呈现褐色，立即用蒸馏水冲洗，然后自然干燥。

5.镜检

先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，最后用油镜观察。记录观察到的细菌鞭毛特征和形态，并绘图。

压滴法

1.制备菌液

从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1-2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

2.加美蓝水溶液

取2-3环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入1环0.01%美蓝水溶液，混匀。

3.盖盖玻片

用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一端接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡。

4.镜检

将光线适当调暗，先用抵北京找到观察部位，再用高倍镜观察。

要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。

【实验结果】

1.硝酸银染色法

经鞭毛染色的有鞭毛细菌菌体呈深褐色，鞭毛浅褐色且通常呈波浪形。具体形态见附图。

2.压滴法

有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随水流相区别。

【分析与讨论】

注意事项：

1.该实验中，微生物的培养技术比较特殊，需要反复转接活化，半

固体培养增加活动力。

2.该实验中，制片技术与以往实验也有所不同。该实验使用的载玻

片需要进行特殊处理：选择光滑无裂痕的玻片，置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。目的是洁净。另外，在涂片方法上也需要注意：一是滴加菌液后，微微倾斜载玻片，使菌液自动流下，不进行涂抹；

二是涂片之后使其自然干燥，不加热；三是没有加热固定的步骤，目的是保护鞭毛不受损伤。

3.鞭毛染色技术比较特殊，它是媒染叠加染料，加粗鞭毛，方便光

镜下可见。

4.在制备菌液时，可将菌液放37℃恒温箱中静置10min，让幼龄菌

鞭毛松展开，但是放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落。

5.鞭毛染色法制片时，滴加菌液后，微微倾斜载玻片，使菌液流向

另一端，这个过程中倾角应该小一点，缓慢流，以利于鞭毛散开和观察，另外应使菌液的面积大一些，这样易于有视野。

6.用硝酸银鞭毛染液B覆盖菌面时，可用微火加热，课堂经验，适

当延长B液染色时间，有利于观察到鞭毛。