《固定化酶》PPT课件
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固定化酶技术ppt课件
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
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1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
固定化酶PPT课件
A．重氮法
h
34
B 叠氮法
•例 • 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋
白酶，步骤如下：
• ⑴ 酯化 • ⑵ 肼解 • ⑶ 叠氮化 • (4) 偶联
h
35
B 叠氮法
• 对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体， 再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
h
36
C．烷基化反应法
• 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化， 形成含有卤素基团的活化载体。
乙酰 -DL — Ala 乙酸
L — Ala +
Ala Aminoacylase
乙酰 -D —
氨基酰化酶
h
67
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
h
68
2、固定化酶在医学上的应用（酶电极）
（1）葡萄糖电极
半透膜 酶胶层
感应电极
ß－D－葡萄糖＋O2
酶电极示意图
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O
h
69
葡萄糖氧化酶
葡萄糖＋醌＋H2O
葡萄糖酸＋氢醌
Pt
氢醌
醌＋2H＋＋2e－
铂电极
h
70
（2）脲电极
脲酶
Urea + 2H2O
2NH4++2HCO3-
产生的2NH4+为阳离子电极感应。
此外还有： 氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3
固定化酶-PPT精品文档
世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAESephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于 DL-AA的光学分析。
锲而舍之，朽木不折。锲而不舍， 金石可镂 友友情分享O(∩_∩)O~
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（二）、包埋法
锲而舍之，朽木不折。锲而不舍， 金石可镂 友友情分享O(∩_∩)O~
10
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：
第七章 固定化酶
（Immobilized Enzyme）
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1
酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使 用，而且不易与产物分离，不利于产物 的提纯和精制。 针对这些限制酶广泛应用的因素，将 水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手 段处理，将酶束缚在一定的空间内，限 制酶分子在此区间进行活跃的催化作用， 成为不溶于水的固定化的酶或细胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范 围内进行催化反应的酶。
锲而舍之，朽木不折。锲而不2.吸附法的优点、缺点
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多， 吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的 固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落， 会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度
条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的 相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚 糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
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4
吸附法 包埋法 共价结合法 交联法
第四章固定化酶ppt讲解
随着固定化技术的发展，也可采用含酶菌体 或菌体碎片进行固定化，直接应用菌体或菌 体碎片中的酶或酶系进行催化反应，这称之 为固定化菌体或称固定化死细胞。
1973年，日本首次在工业上成功地应用固定 化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁 烯二酸连续生产L—天门冬氨酸。
固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目 的，它们的制备和应用方法也基本相同
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期 出现了固定化细胞技术。固定化细胞是指固定在载体 上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称 为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌 细胞生产α-淀粉酶的研究成功，开始了用 固定化细胞生产酶的先例。
玉米淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖浆 → 膜 过滤 → 离交、浓缩 → 异构化 → 部分变成 果糖（42%）→混合 →浓缩、精制→ 55% 高果糖浆 参与的酶： α—淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶 葡萄糖异构酶
淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?
固定化菌体
用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分 高纯化后的酶。
这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。在此基 础上，酶的固定化技术日新月异。
60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业 生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶 应用史上的一大变革。
此后，固定化技术迅速发展，促使酶 工程作为一个独立的学科从发酵工程 中脱颖而出。
缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 固定化酶活力回收率低，且不适合用于 高分子质量的底物。
高果糖浆
也称果葡糖浆或异构糖浆，它是 以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡 萄糖异构酶的异构作用，将其中一部 分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果 糖而组成的一种混合糖糖浆。
1973年，日本首次在工业上成功地应用固定 化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁 烯二酸连续生产L—天门冬氨酸。
固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目 的，它们的制备和应用方法也基本相同
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期 出现了固定化细胞技术。固定化细胞是指固定在载体 上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称 为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌 细胞生产α-淀粉酶的研究成功，开始了用 固定化细胞生产酶的先例。
玉米淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖浆 → 膜 过滤 → 离交、浓缩 → 异构化 → 部分变成 果糖（42%）→混合 →浓缩、精制→ 55% 高果糖浆 参与的酶： α—淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶 葡萄糖异构酶
淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?
固定化菌体
用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分 高纯化后的酶。
这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。在此基 础上，酶的固定化技术日新月异。
60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业 生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶 应用史上的一大变革。
此后，固定化技术迅速发展，促使酶 工程作为一个独立的学科从发酵工程 中脱颖而出。
缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 固定化酶活力回收率低，且不适合用于 高分子质量的底物。
高果糖浆
也称果葡糖浆或异构糖浆，它是 以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡 萄糖异构酶的异构作用，将其中一部 分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果 糖而组成的一种混合糖糖浆。
《固定化酶》PPT课件 (2)
包埋法
网格法 微囊法
化学结合法
交联法 共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
• 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
• 选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面 ③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
• (1)有机载体： • 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
第三章
酶的固定化
• 第一节 酶的固定化 • 第二节 辅酶的固定方法 • 第三节 固定化细胞 • 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 • 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
• 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
• 特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。
缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
• 海藻酸钠
它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al 3+凝胶化 ，操作简单经济。
• K-角叉莱胶（卡拉胶）
• 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。
可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 。
(2)微囊化包埋法
➢微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。
➢胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。
➢主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法
固定化酶简述 PPT课件 通用
固定化酶的应用固定能源开发化学分析生物工程临床诊断医学环境保护酶的固定化及应用研究已得到长足进展开发新型固定化技术进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋生物学及生物工程医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合适于化学化工及环境科学领域应用的固定化酶具有生态环境材料的鲜明特应给予足够重视
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
固定化酶PPT参考幻灯片
17
LOGO
展望
膜反应器融酶触转化、产品分离、 酶剂再利用为一体
将酶固定化与酶的选择性修饰结合
将酶固定化与细胞固定化结合
酶固定化 的发展方向
18
LOGO
19
将酶固定在生物膜 或超滤膜上，制造 出来的生物膜反应 器5Biblioteka LOGO固定化酶的优点
能反复使用
对热、pH等的稳定性提高， 对抑制剂的敏感性降低
经过简单过滤离心， 产品与酶可分离开
反应空间大大缩小 ， 从而能准确控制反应,
可以消除侧反应
优点
应用制成酶电极的固定 化酶建成监测化学反应 的系统
适用于连续化、自动化生产
日本一家制药公司第一次将 固定化的酰化氨基酸水解酶 用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸， 开辟了固定化酶工业化的新纪元。
4
LOGO
固定化酶简介
定义
常用 技术
先进 方法
通过化学或物理的 处理方法，使原来 水不溶的酶与固态 的水不溶性支持物 结合或被载体包埋 。
物理吸附法、交联 、共价结合及包埋 等方法
3
LOGO
背景
发展历程
自1972
1916
Neleson和Griffin 最先发现了 酶的固定化现象。科学家就 开始了固定化酶的研究工作。
1969
1970
已固定了几种芽孢杆菌和链 霉菌中提取的葡萄糖异构化 酶，并大量应用于工业生产。
我国开始了固定化酶的研究工作， 许多单位相继进行了固定化酶和 固定化细胞的应用。
新型载体
高分子复合物 ， 因其 优良的传质性能 、 电 解质的灵敏介电特性 以 及 良好 的生物相容性 等特点， 也成为固定化 酶良好的新型载体， 在 酶固定化 领域 显示 了 广 阔的应用前景 。
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展望
膜反应器融酶触转化、产品分离、 酶剂再利用为一体
将酶固定化与酶的选择性修饰结合
将酶固定化与细胞固定化结合
酶固定化 的发展方向
18
LOGO
19
将酶固定在生物膜 或超滤膜上，制造 出来的生物膜反应 器5Biblioteka LOGO固定化酶的优点
能反复使用
对热、pH等的稳定性提高， 对抑制剂的敏感性降低
经过简单过滤离心， 产品与酶可分离开
反应空间大大缩小 ， 从而能准确控制反应,
可以消除侧反应
优点
应用制成酶电极的固定 化酶建成监测化学反应 的系统
适用于连续化、自动化生产
日本一家制药公司第一次将 固定化的酰化氨基酸水解酶 用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸， 开辟了固定化酶工业化的新纪元。
4
LOGO
固定化酶简介
定义
常用 技术
先进 方法
通过化学或物理的 处理方法，使原来 水不溶的酶与固态 的水不溶性支持物 结合或被载体包埋 。
物理吸附法、交联 、共价结合及包埋 等方法
3
LOGO
背景
发展历程
自1972
1916
Neleson和Griffin 最先发现了 酶的固定化现象。科学家就 开始了固定化酶的研究工作。
1969
1970
已固定了几种芽孢杆菌和链 霉菌中提取的葡萄糖异构化 酶，并大量应用于工业生产。
我国开始了固定化酶的研究工作， 许多单位相继进行了固定化酶和 固定化细胞的应用。
新型载体
高分子复合物 ， 因其 优良的传质性能 、 电 解质的灵敏介电特性 以 及 良好 的生物相容性 等特点， 也成为固定化 酶良好的新型载体， 在 酶固定化 领域 显示 了 广 阔的应用前景 。
第七章固定化酶-课件
固定化技术
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
固定化酶的定义
在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地 进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。
Enzyme(amount of immobilized biocatalyst used , Glucose isomerase(xylose isomerase)(1500t/a)
载体再生
费用 底物专一性 适用性
可能
低 不变 酶源多
不可能
高 可变 较广
可能
低 不变 广泛
不可能
中等 可变 较广
不可能
低 不变 小分子底 物、药用 酶
酶固定化时遵循的原则：
维持酶的催化活性和专一性； 固定化应有利于自动化、连续化反应； 固定化酶应具有最小的空间位阻； 酶与载体必须牢固结合； 固定化酶应具有最大的稳定性； 固定化酶易与产物分离； 固定化酶成本要低； 充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。
固定化酶的优点： 酶与产物、底物易分开； 可多批次使用和装柱连续反应； 提高酶的稳定性； 产物中无酶残留，简化产品纯化工艺； 提高酶的使用效率，成本降低； 增加产物收率，提高产物质量。
缺点：
酶活力损失； 增加了酶的成本； 只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底
Product (amount) Glucose-fructose syrup ca. 10 million/a
Companies (Enzyme sippliers; application) Novozymes, Degussa,DSM,Danisco/Genen cor, Nagase; ADM, A.E. Staley, Cargill, CPC International and others Cerestar, Mitsui seito Co., Sudzucker Celntral del Latte, Snow Brand milk Prod., Sumimoto Chemical Industries, Valeo/Alko DSM, Asahi Chemical Ind Co., Beecham, Biochemie, bristol myers, To烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉
食品酶学本第四章固定化酶幻灯片
5/20/2021
10
〔二〕包埋法
概念：包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中而使酶固定化的方法。
分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为： ①凝胶包埋法 ②半透膜包埋法 特点：优点是条件温和，缺点是只适于底物和产物
都是小分子的酶的固定化。
5/20/2021
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①凝胶包埋法
概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶
食品酶学本第四章固定化 酶幻灯片
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一、固定范围内进展催化 反响的酶。示意图
酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合， 使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。固定化酶具 有稳定性增加、可反复使用并易于和产物分开等优点，抑 制了游离酶的缺乏之处。
内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是 将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截 留法。
凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶
两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡
拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联
树脂等。
5/20/2021
12
②半透膜包埋法
半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分 子聚合形成的小球内的方法。由于半透膜 包埋法所形成的固定化酶小球的直径一般
②1953年，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂 为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋 白酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。
③1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定 化氨基酰化酶从DL—氨基酸连续生产L—氨基酸，生产本钱 仅为游离酶生产本钱的60%左右，他开创了固定化酶应用于 连续化工业生产的先例，是酶应用史上的伟大变革。
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固定化酶
深圳大学 吴海强
一、概述
固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
什么是固定化酶？
能结合或结合后不能生成产物。
载体对固定化酶体系pH的影响
• 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而 把主体溶液称为宏观环境。
❖载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
• 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
水溶性酶
水不溶性载体 酶自身载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
固定化
间歇
吸附
包埋
间歇
交联
化学偶联
连续
固定化酶的优缺点
•
可重复使用
•
可以装塔连续反应
• 优点： 纯化简单，易与产物分离
•
提高产物质量
•
应用范围广
•
固定化过程中酶易失活
• 缺点： 首次投入成本高
•
大分子底物较困难
二、固定化酶的性质及其影响因素
（一）固定化酶的性质 （二）固定化酶性质改变的原因 （三）评价固定化酶的指标 （四）固定化酶的活力测定方法
（一）固定化酶的性质
• 1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。
• 原因：酶结构的变化 空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高； • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反
管、酶板）。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半 所需要的时间（t1/2）
• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
（四）固定化酶的活力测定方法
• 1. 振荡测定法： • 2. 酶柱测定法： • 3. 连续测定法
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
而降低； • （4） 对分解酶的稳定性提高； • （5） 对变性剂的耐受力升高。
固定化酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b.抑制自降解，提高了酶稳定性。 • c.酶活力的释放是缓慢的。
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离 • （3）影响酶的结合基团的解离 • （4）改变底物的解离状态，酶与底物不
了酶的亲和力，Km‘<Km。
（二） 固定化酶性质改变的原因
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
2． 载体的影响
• （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
（三）评价固定化酶的指标：
游离酶
• 1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔
4． 最适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化
Km值随载体性质的变化而变化 • 载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降
低了酶的亲和力，Km’>Km 。 • 载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
载体活化的方法
微型胶囊法制备固定化酶有两种方法
• ① 界面沉淀法
• 这是一种简单的物理法，它是利用某些高 聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低 而形成的皮膜将酶包埋。
②界面聚合法
• 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶 包裹起来。
2、吸附法
I 物理吸附法
• 静止法 • 电沉积法 • 反应器上直接吸附法 • 混合浴或振荡浴吸附法
利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定， 从而测定固定化酶的酶活力。
三、酶固定化技术
1. 微型胶囊法 2. 吸附法 3. 胶格包埋法 4. 共价交联法 5. 共价偶联法
1、微型胶囊法
❖ 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定重氮法 • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
• 反应示意式如下
A．重氮法
A．重氮法
• 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂 糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
• 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
•
=6*106IU
• 2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有
的酶活力单位。 • 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶
深圳大学 吴海强
一、概述
固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
什么是固定化酶？
能结合或结合后不能生成产物。
载体对固定化酶体系pH的影响
• 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而 把主体溶液称为宏观环境。
❖载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
• 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
水溶性酶
水不溶性载体 酶自身载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
固定化
间歇
吸附
包埋
间歇
交联
化学偶联
连续
固定化酶的优缺点
•
可重复使用
•
可以装塔连续反应
• 优点： 纯化简单，易与产物分离
•
提高产物质量
•
应用范围广
•
固定化过程中酶易失活
• 缺点： 首次投入成本高
•
大分子底物较困难
二、固定化酶的性质及其影响因素
（一）固定化酶的性质 （二）固定化酶性质改变的原因 （三）评价固定化酶的指标 （四）固定化酶的活力测定方法
（一）固定化酶的性质
• 1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。
• 原因：酶结构的变化 空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高； • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反
管、酶板）。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半 所需要的时间（t1/2）
• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
（四）固定化酶的活力测定方法
• 1. 振荡测定法： • 2. 酶柱测定法： • 3. 连续测定法
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
而降低； • （4） 对分解酶的稳定性提高； • （5） 对变性剂的耐受力升高。
固定化酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b.抑制自降解，提高了酶稳定性。 • c.酶活力的释放是缓慢的。
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离 • （3）影响酶的结合基团的解离 • （4）改变底物的解离状态，酶与底物不
了酶的亲和力，Km‘<Km。
（二） 固定化酶性质改变的原因
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
2． 载体的影响
• （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
（三）评价固定化酶的指标：
游离酶
• 1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔
4． 最适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化
Km值随载体性质的变化而变化 • 载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降
低了酶的亲和力，Km’>Km 。 • 载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
载体活化的方法
微型胶囊法制备固定化酶有两种方法
• ① 界面沉淀法
• 这是一种简单的物理法，它是利用某些高 聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低 而形成的皮膜将酶包埋。
②界面聚合法
• 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶 包裹起来。
2、吸附法
I 物理吸附法
• 静止法 • 电沉积法 • 反应器上直接吸附法 • 混合浴或振荡浴吸附法
利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定， 从而测定固定化酶的酶活力。
三、酶固定化技术
1. 微型胶囊法 2. 吸附法 3. 胶格包埋法 4. 共价交联法 5. 共价偶联法
1、微型胶囊法
❖ 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定重氮法 • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
• 反应示意式如下
A．重氮法
A．重氮法
• 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂 糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
• 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
•
=6*106IU
• 2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有
的酶活力单位。 • 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶