《固定化酶》PPT课件
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固定化酶
深圳大学 吴海强
一、概述
固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
什么是固定化酶？
微型胶囊法制备固定化酶有两种方法
• ① 界面沉淀法
• 这是一种简单的物理法，它是利用某些高 聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低 而形成的皮膜将酶包埋。
②界面聚合法
• 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶 包裹起来。
2、吸附法
I 物理吸附法
• 静止法 • 电沉积法 • 反应器上直接吸附法 • 混合浴或振荡浴吸附法
能结合或结合后不能生成产物。
载体对固定化酶体系pH的影响
• 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而 把主体溶液称为宏观环境。
❖载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
• 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
了酶的亲和力，Km‘<Km。
（二） 固定化酶性质改变的原因
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
2． 载体的影响
• （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
（三）评价固定化酶的指标：
游离酶
• 1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔
底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
• 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
•
=6*106IU
• 2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有
的酶活力单位。 • 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶
管、酶板）。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半 所需要的时间（t1/2）
• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
（四）固定化酶的活力测定方法
• 1. 振荡测定法： • 2. 酶柱测定法： • 3. 连续测定法
4． ຫໍສະໝຸດ Baidu适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化
Km值随载体性质的变化而变化 • 载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降
低了酶的亲和力，Km’>Km 。 • 载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加
水溶性酶
水不溶性载体 酶自身载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
固定化
间歇
吸附
包埋
间歇
交联
化学偶联
连续
固定化酶的优缺点
•
可重复使用
•
可以装塔连续反应
• 优点： 纯化简单，易与产物分离
•
提高产物质量
•
应用范围广
•
固定化过程中酶易失活
• 缺点： 首次投入成本高
•
大分子底物较困难
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
而降低； • （4） 对分解酶的稳定性提高； • （5） 对变性剂的耐受力升高。
固定化酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b.抑制自降解，提高了酶稳定性。 • c.酶活力的释放是缓慢的。
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离 • （3）影响酶的结合基团的解离 • （4）改变底物的解离状态，酶与底物不
二、固定化酶的性质及其影响因素
（一）固定化酶的性质 （二）固定化酶性质改变的原因 （三）评价固定化酶的指标 （四）固定化酶的活力测定方法
（一）固定化酶的性质
• 1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。
• 原因：酶结构的变化 空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高； • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定， 从而测定固定化酶的酶活力。
三、酶固定化技术
1. 微型胶囊法 2. 吸附法 3. 胶格包埋法 4. 共价交联法 5. 共价偶联法
1、微型胶囊法
❖ 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
• A．重氮法 • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
• 反应示意式如下
A．重氮法
A．重氮法
• 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂 糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
载体活化的方法
深圳大学 吴海强
一、概述
固定化酶的发展史
细胞
非生长
生长
悬浮 固定化
酶液
固定化
材料
膜固定
连续
再循环系统
凝胶 吸附 化学连接物
半连续 分批
凝胶 吸附
生物催化剂
可溶
连续
吸附
包埋
间歇
间歇
酶 固定化
交联
化学连续 间歇
连续 活塞模式
搅拌连续反应器
连续 活塞模式 搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意
什么是固定化酶？
微型胶囊法制备固定化酶有两种方法
• ① 界面沉淀法
• 这是一种简单的物理法，它是利用某些高 聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低 而形成的皮膜将酶包埋。
②界面聚合法
• 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶 包裹起来。
2、吸附法
I 物理吸附法
• 静止法 • 电沉积法 • 反应器上直接吸附法 • 混合浴或振荡浴吸附法
能结合或结合后不能生成产物。
载体对固定化酶体系pH的影响
• 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而 把主体溶液称为宏观环境。
❖载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
• 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
了酶的亲和力，Km‘<Km。
（二） 固定化酶性质改变的原因
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
2． 载体的影响
• （1） 分配效应 • （2） 空间障碍效应 • （3） 扩散限制效应
3. 固定化方法的影响
（三）评价固定化酶的指标：
游离酶
• 1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔
底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。
• 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min
•
=6*106IU
• 2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
固定化酶的指标：
• 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有
的酶活力单位。 • 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶
管、酶板）。
• 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半 所需要的时间（t1/2）
• 3.
• 4.
• 或称偶联效率，活力保留百分数。
• 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力
与游离酶活力的比值称为相对酶活力
（四）固定化酶的活力测定方法
• 1. 振荡测定法： • 2. 酶柱测定法： • 3. 连续测定法
4． ຫໍສະໝຸດ Baidu适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
• 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化
Km值随载体性质的变化而变化 • 载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降
低了酶的亲和力，Km’>Km 。 • 载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加
水溶性酶
水不溶性载体 酶自身载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
固定化
间歇
吸附
包埋
间歇
交联
化学偶联
连续
固定化酶的优缺点
•
可重复使用
•
可以装塔连续反应
• 优点： 纯化简单，易与产物分离
•
提高产物质量
•
应用范围广
•
固定化过程中酶易失活
• 缺点： 首次投入成本高
•
大分子底物较困难
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
而降低； • （4） 对分解酶的稳定性提高； • （5） 对变性剂的耐受力升高。
固定化酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 • b.抑制自降解，提高了酶稳定性。 • c.酶活力的释放是缓慢的。
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离 • （3）影响酶的结合基团的解离 • （4）改变底物的解离状态，酶与底物不
二、固定化酶的性质及其影响因素
（一）固定化酶的性质 （二）固定化酶性质改变的原因 （三）评价固定化酶的指标 （四）固定化酶的活力测定方法
（一）固定化酶的性质
• 1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。
• 原因：酶结构的变化 空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响
• （1） 操作稳定性提高； • （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； • （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定， 从而测定固定化酶的酶活力。
三、酶固定化技术
1. 微型胶囊法 2. 吸附法 3. 胶格包埋法 4. 共价交联法 5. 共价偶联法
1、微型胶囊法
❖ 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
• A．重氮法 • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
• 反应示意式如下
A．重氮法
A．重氮法
• 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂 糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
载体活化的方法