全长cDNA酶切和连接体系

用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。

F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用

酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用buffer D

F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。即为连接全长所用的F2片段。连接时，直接用设计时的两端酶切位点。

LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。

F21、F22连接酶切体系：

Nhe I 1µl；10×M buffer 2µl；DNA 17µl；

F3、F4连接酶切体系：

Acc III 1µl；10×F buffer 2µl；BSA 0.2µl；DNA 16.8µl。

37℃3h酶切。纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。

连接体系：

T4 DNA连接酶buffer 2µl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2µl；回收DNA片段15µl；T4 DNA连接酶1µl。16℃6h，再4℃过夜。转化感受态JM109。

酶切后纯化回收时，依据连接时DNA的用量，最后一步适量入无核酸酶水。

全长连接体系：20µl

T4 DNA连接酶1µl

10×buffer 2µl

5’-half 8µl

3’-half 8µl

pGEM-5zf(+) 1µl

16℃连接6小时后，4℃放置过夜，次日下午转化。分别取10µl转化一管感受态JM109。涂板，挑斑，鉴定。