基因诊断-肿瘤的分子诊断

1、直接采用PCR技术进行基因诊断
通过PCR技术扩增特异性的基因，可以确定病原 生物基因是否存在或分析疾病相关的体内基因缺失 或基因突变
2、采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析
（PCR－RFLP）
基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会 在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制 性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内 切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变， 根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长 度多态性技术。
PCR－RFLP就是利用PCR技术先将包含待测位点的 DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶 水解，根据限制性片段数量和长度作出诊断。
3、采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术
等位基因特异性寡核苷酸探针技术（ASO）原理： 针对已知突变位点的基因，可以分别针对已知突变
位点的序列，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生 型探针，与无突变序列互补，另一个为突变型探针，与 突变序列互补。同时设计探针时，突变碱基应位于探针 的中央，这样在严格控制杂交和洗脱条件下，只有完全 互补的探针保留下来，形成稳定杂交分子，而中央碱基 与靶序列不匹配的探针则被洗脱。
2．基因诊断的特点：
（1）直接检测基因，属病因诊断，针对 性强；
（2）特异性强、灵敏度高：由于基因诊 断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等 技术；
（3）适用范围广：其应用的范围已从原 先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、 肿瘤、心血管疾病等领域。
基因诊断的评价
• 特异性 • 灵敏度 • 重复性 • 快速 • 经济
(二)基因诊断的基本原理与临床意义
1．基本原理：
通过检测致病基因（包括内源基因与外源基因）的 存在、量的多少，结构变化与否及表达水平是否正常， 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作 为疾病确诊的依据。
2．临床意义:
•
对有表型出现的疾病作出明确诊断
Leabharlann Baidu
•
早期快速诊断
•
确定个体对疾病的易感性
• 疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等
采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术
PCR/ASO则是采用PCR扩增受检者基因的目标 片段，并与相应的ASO探针杂交，如果受检者DNA扩 增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表 示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂 交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说 明突变基因为杂合子。
二、基因诊断的常用技术与方法
(一) 基因诊断的常用技术 (二) 基因诊断的基本方法
(一)基因诊断常用技术
1. 核酸分子杂交 2. PCR（聚合酶链式反应） 3. 限制性酶切分析 4. SSCP（单链构象多态性分析） 5. DNA 测序 6. DNA 芯片技术
基因诊断技术分类
1、Molecular hybridization：
对致病性微生物应选用其最保守、最特 异的序列；对突变基因的检测，应用含有突 变位点的序列或待测基因编码的ｍＲＮＡ序 列。
探针的标记物
• 放射性标记物
32P，35S，125I，3H
• 非放射性标记物
❖生物素，地高辛，荧光素， 酶， 金属
Southern blot
NTTNT T
N
1、Southern blot：用于DNA检测，不但能检测出特异
杂交 去除未参与杂交的探针
加入标记核酸探针
检测杂交信号
探针的种类
• DNA 探针:基因组DNA探针;基因探针 • cDNA探针:目前应用最广泛的 • 寡核苷酸探针(Oligonucleotide probes) • RNA 探针:
不同的探针在应用中有各自的特点,但最 重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依 据待测核酸序列选择的。
Southern, Northern, dot blot,
2、PCR 3、DNA测序 4、DNA芯片技术
1. 核酸分子杂交
Molecular hybridization
• Southern blot——DNA • Northern blot——RNA • Dot blot， • In Situ Hybridization,
的DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的 限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。
2、Northern blot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞
中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析。
3、dot blot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组
中特定基因及其表达的定性和定量分析。缺点：特异性 较低，不能鉴定所分析的基因分子量。
一、基因诊断概述
(一) 基因诊断的概念与特点 (二) 基因诊断的基本原理与临床意义
(一)基因诊断的概念与特点
1．概念：
指利用分子生物学技术，从DNA或 RNA水平检测基因的存在、分析基因的 结构变异和表达状态，对疾病作出诊断 的方法和过程。
• 基因诊断以DNA和RNA为诊断材料，
•
DNA诊断
•
RNA诊断
核酸杂交的基本原理：
利用核酸变性和复性理论：（1）双链 DNA分子在某些理化因素作用下解旋， 条件恢复后又可恢复其双螺旋结构； （2）具有互补碱基序列的异源核酸单 链之间同样可按碱基互补配对原则通 过氢键结合为双链。
核酸分子杂交的流程示意图
• 待测核酸制备 滤膜上核酸固化
• 制备探针核酸片段
探针标记
4、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性
和定量分析，并可定位。
（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术
PCR是在试管内 利用DNA聚合酶 催化的反应反复 进行同一段DNA 片段合成的过程
PCR技术的优点
➢特异性强 ➢灵敏度高 ➢操作简单、省时 ➢对待检原始材料质量要求低 ➢高效率的基因扩增技术
βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS
正常探针 突变探针
4、PCR产物的反相点杂交分析技术
第八 章 基因诊断
Gene Diagnosis
人类疾病的原因
• 内因：
基因结构改变（基因突变）——点突变、 插入、缺失、重排、易位、基因扩增
基因结构多态性 基因表达异常
• 外因：
病原体的侵入
对于疾病的诊断依据：
• 临床表现 • 实验室诊断技术：
细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验 基因诊断