细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡、坏死、细胞活性检查常见方式及试剂
线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件. 它在凋亡进程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
基于以上研究，Biotium 研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。
利用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 利用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组利用staurosporine 作为凋亡诱导剂。
利用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处置(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。
(A 图) 较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。
在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。
相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。
经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。
NucView488 caspase-3活性检测双功能试剂盒
NucView TM488 CASPASE-3主要特点：在活细胞中检测Caspase-3并染色细胞核DNA直接加入细胞培液,孵育15-30分钟后即可检测，无需清洗残余染料兼容使用荧光素滤光片的流式细胞仪和荧光显微镜可固定染色NucView TM488 CASPASE-3底物是一种新型的细胞膜渗透性用于检测活细胞内caspase-3的实时活动的荧光蛋白酶底物。
细胞凋亡率从细胞到细胞会有典型的变化，即使在相同的细胞数。
结果导致各种凋亡事件或凋亡标志物，伴随着细胞凋亡过程会出现在不同的细胞中。
因此，关键是要能够探测到在单个细胞基础上的这些凋亡事件。
传统上，caspase活性使用防渗膜荧光酶底物DEVD-R110，或荧光标记抑制物如FLICA试剂等检测。
在前一种情况下，细胞需裂解，从而排除在活细胞caspase活性的检测。
此外，这种蛋白酶检测方法只能在特定时间段的高度异质性细胞群中检测平均caspase活性。
在后一种情况下，虽然FLICA试剂可以进入活细胞检测caspase的活性，但只有最初的荧光信号，可以真实地反映酶的活性或细胞凋亡的状态，因为初始“快照”后的任何检测到的信号都需要考虑酶和细胞凋亡本身抑制剂的潜在干扰。
与传统的caspase检测不同，NucViewTM 488 Caspase-3底物以互不影响的方式检测完整单个细胞内caspase-3活性。
基底由一个荧光的DNA染料和caspase-3特异性的DEVD底物组成。
基底，一种无荧光及功能的DNA染料，可以迅速穿过细胞膜进入细胞质中，经过caspase-3酶的裂解作用，形成一个高亲和力的DNA染料。
释放的DNA染料迁移到细胞核染色细胞核成明亮的绿色。
这样的NucViewTM 488 caspase-3的基板是双向功能，能够在检测细胞内的caspase-3的同时染色细胞核，即可以观察细胞凋亡中细胞核的形态学变化。
caspase-3活性荧光染色是通过标准的固定方法（在3.75％，甲醛PBS用于固定，0.5％的Triton X-100PBS用于细胞通透性），从而促进后续的染色研究。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡概念：细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。
细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。
选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。
二、细胞凋亡的检测方法：1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法)在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。
荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子2. Caspase-3活性的检测:半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。
其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。
Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa）组成，图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。
使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
鉴定细胞凋亡的常用方法
鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，是维持生物体正常生长发育和组织修复的重要机制。
凋亡与疾病的关系密切，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。
因此，鉴定细胞凋亡的常用方法对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡鉴定方法。
一、TUNEL法TUNEL法是一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)技术的细胞凋亡检测方法。
该方法通过在细胞凋亡时，末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)将标记物dUTP标记在DNA的3'末端，然后使用荧光显微镜观察标记物的荧光强度。
该方法的优点是操作简便，结果准确可靠，适用于多种样本类型的细胞凋亡检测。
二、Annexin V-FITC/PI双染法Annexin V-FITC/PI双染法是一种流式细胞术检测细胞凋亡的方法。
该方法通过Annexin V结合细胞膜上的磷脂酰胆碱(PS)和PI结合细胞核DNA，将细胞分为四个区域：Annexin V-FITC(-)/PI(-)区域表示正常细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(-)区域表示早期凋亡细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(+)区域表示晚期凋亡细胞；AnnexinV-FITC(-)/PI(+)区域表示坏死细胞。
该方法的优点是高灵敏度和高特异性，可以同时检测细胞凋亡和坏死。
三、DNA Ladder检测DNA Ladder检测是一种检测细胞凋亡的传统方法。
该方法通过电泳分离DNA，检测DNA的大小和形态是否发生变化，如出现约180bp 的DNA片段，则提示细胞凋亡。
该方法的缺点是需要较多的细胞样本，且不能区分细胞凋亡的早期和晚期。
四、Caspase活性检测Caspase是细胞凋亡的重要调节因子，Caspase活性检测是一种检测细胞凋亡的方法。
该方法通过检测Caspase活性的改变来判断细胞凋亡的程度，如Caspase-3活性增加，则提示细胞凋亡。
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)
Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)产品简介：Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。
Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。
Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。
自备材料：1、水浴锅或恒温箱2、96孔板3、酶标仪或分光光度操作步骤（仅供参考）：1、制备标准曲线：①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。
②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
Caspase_3与细胞凋亡的研究_cropped
分子生物医学C aspase23 与细胞凋亡的研究张晓田(综述) ,宋天保(审校)( 西安交通大学医学院组织学与胚胎学教研室,陕西西安710061)关键词: 半胱天冬酶23 ; 细胞凋亡; Bcl22 中图分类号: Q255文献标识码: A文章编号:100622084 (2002) 1120621203His 的咪唑基团在C ys 侧链的极化激活中有重要作用。
精氨酸残基(Arg341 和Arg179) 位于大、小亚基之间的界面上,它们形成S1 亚位点,与P1 位点的天冬氨酸结合。
casp se23 的三维结构揭示大、小亚基共同参与构成其特异性的结合腔( b in d ing cleft ,S42S1) ,其中S4 亚位点是最主要的特异性决定簇, 只由小亚基构成4 ,5 。
2 c a sp a se23 与细胞凋亡2. 1 caspase23 处于细胞凋亡的下游经典的细胞凋亡途径有两条,分别为细胞外途径( 或称细胞表面死亡受体途径) 和细胞内途径(或称线粒体引发途径) 。
在细胞外途径中,死亡信号的传导依赖于死亡配体与受体的结合(如TNFα和TNFR , Fas L 和Fas 的结合) , 接着,死亡受体的死亡结构域( d eath d o2 main ,DD) 与信号传导分子(如FADD 等) 结合,而FADD 又可与caspase28 酶原的DE D 相连接, 形成死亡诱导信号复合物( d eath indu cing sig naling complex ,DISC) ,随之caspase28 被激活, 它通过裂解BID 使线粒体释放细胞色素C , 或直接作用于caspase23 及其他下游的caspase 。
在细胞内途径中, 细胞内的死亡信号,如DNA 损伤、毒素和ATP 耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C。
细胞色素C、Apaf21 、d ATP 和caspase29 酶原结合形成凋亡复合体(apoptosom e) ,caspase29 被释放并激活,接着下游的caspase23 、7 等被激活降解底物使细胞凋亡2 ,6 。
C1115 Caspase 3 活性检测试剂盒 说明书
A. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时
确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解
液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟
2. Liu C, Yu K, Shi X, Wang J, Lam P, Wu R, Zhou, B. Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Aquatic Toxicology. (2007), doi:10.1016/j.aquatox.2007.02.006.
5. Qian YF, Yao WB, Wang H, Gao XD. The Mechanism of Kaixin San Inhibiting Apoptosis in Hydrogen Peroxide2induced PC12 Cells. Chin J Nat Med. Sep.2007 Vol.5 No.5.
F. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测 定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。
常见问题：
1. 测定出的A405过低： A. 样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近1-3mg/ml。 B. 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活 的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase 的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、 6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。 C. 通过上述优化后A405还是比较低，或浓缩样品或做时间曲线比较困难，可以在测定样品时加大样品的用量，最多可 达40µl。 假设每次测定样品的用量为xµl，则： C1. 此时标准品稀释液需按如下方法配制：按照xµl裂解液加入检测缓冲液至最终体积为100µl的比例配制适量的标 准品稀释液。例如样品用量为40µl，则按照40µl裂解液加入60µl检测缓冲液，即0.4ml裂解液加入0.6ml检测缓冲液的 比例配制标准品稀释液。其余标准曲线的测定方法同上面的使用说明所述。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
细胞凋亡的检测(来自北京大学人类疾病基因研究中心
摘自北京大学人类疾病基因研究中心/news/apoptosis.htm细胞凋亡的检测北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DN A的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
Caspase3 活性检测试剂盒
3. Wang Q, Luo W, Zhang W, Dai Z, Chen Y, Chen J. Iron supplementation protects against lead-induced apoptosis through MAPK pathway in weanling rat cortex. Neurotoxicology. 2007 Jul;28(4):850-9.
10µl
Ac-DEVD-pNA (2mM)
10µl
10µl
总体积
100µl
100µl
注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入
10µl Ac-DEVD-pNA (2mM)。
C. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即
可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
D. 样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准
曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
E. 参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amபைடு நூலகம்unt of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the
细胞凋亡检测方法总结
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。
Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。
PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。
所以Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞Annexin-V阴性-PI阳性一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。
凋亡因子检测实验
凋亡因子Caspase-3/8/9检测实验Caspase3Caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。
Caspase3也称CPP32，是细胞凋亡过程中的一个关键酶，可以剪切procaspase 2、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase)，ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease)，gelsolin和fodrin等。
这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。
caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA片段化等。
同时caspase 3对细胞起泡(Cell blebbing)也起到关键作用。
检测原理基于casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。
pNA在405nm 附近有强吸收。
参照黄色产物pNA制作的标准曲线，可以作为定量caspase 3酶活性的标准品。
【晶莱生物】Caspase-8Caspase 8通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活，Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中上游的caspase，在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中caspase 8被激活，形成一个由p18和p10组成的二聚体，进一步激活下游的caspase 4，caspase 6，caspase 9和caspase 10。
本方法基于Caspase 8可以催化底物Ac-IETD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 8的活性。
pNA在405nm附近有强吸收。
检测样本的405nm OD值参照pNA制作的标准曲线，可以计算样品的Caspase 8酶活性。
SP染色法检测宫颈癌细胞Caspase-3活性
采用ｓ 法 检测 ｃ Ｐ 闽 一 ， ｃ ｓ臼ｅ ３ 鼠单 克隆 抗体（ ３抗 ａｐ９一小 ＿ 碧云天生 物技术 研究所 提供 ）工作浓 度 ｌ１０ ， Ａ 显 色 ， 素复染 。 Ｂ ， ：００Ｄ Ｂ 苏木 以Ｐ Ｓ
缓冲液 代替 一 抗做 空 白 ， 染色 步骤 严格 按 说 明书进 行 。 １３ 判 断标 准 ． 显微镜观 察并收集 图像 ，ａｐ ＿ 阳性以 细胞核或细 胞质呈浅 黄 ｃ ｓ∞ｅ ３ ＿
参考 文献
【】李晟磊 ， 宗文 ， １ 刘 赵秋 民 ． 食管 鳞癌组 织 中ＲＥＣ ＫｍＲＮＡ和 蛋白的 表达 及 意义［】 中国 肿瘤 临床 ， ０ ７， ４２ ） １ ８ Ｊ． ２ ０ ３ （２ ： ２ ０～１ ８ ２ ６．
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制和修复 ， 破坏Ｄ 和核结 构 ， 凋亡 小体 的形成等 ， 细胞凋 亡过 ＮＡ 诱导 在
程 中起着 重要 作用 。 因此 ，ａｐｓ３ 达对 宫颈癌 病情 进展 的监测 、 Ｃ ｓａ 表 ｅ 转 移潜 能及预 后估 计等具 有潜 在研 究价 值 。
色或棕 黄色 颗粒 样物 质 。 个标 本在 ４Ｏ 的观 察随 机５ 每 Ｏ倍 个视 野 计数 ，
Ｃａ ｐ ｓ－９ 白表 达 的影 Ｉ Ｊ ． 国 中医 药信 息杂 志 ， ０ ９， ６ ｓａｅ 蛋 Ｉ 】中 ￣［ ２ ０ １ （ １ ： ５～２ １ ）２ ６．
ｃｓ ｅ ３ ａｐｓ家 族中 最重要 的成 员［ Ｃ ｓａｅ酶原包 括 ３ ａｉ 一 是ｃｓａｅ ￣ｓ ３ ａｐｓｓ 】 。 个部 分 ： 域 、 亚单位 和 小位 。 原 大 酶原 本 身的活 性很 低 ， 可以通 过不 但
PI3K抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡时caspase-3活性的变化
PI3K抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡时caspase-3活性的变化摘要】目的探讨PI3K抑制剂LY294002在诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡事件中可能的作用方式。
方法体外培养卵巢癌SKOV-3细胞；使用PI3K抑制剂LY294002以不同浓度及作用时间处理SKOV-3细胞后，MTT法检测细胞存活率，Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率；以LY294002 40μM作用SKOV-3细胞48小时后，荧光底物法检测caspase-3活性。
结果 SKOV-3细胞存活率随LY294002浓度的增加（20μM，40μM）和孵育时间的延长（24h，48h，72h，96h）而降低（p<0.05）；SKOV-3细胞凋亡率随LY294002浓度的增加（20μM，40μM）和孵育时间的延长（24h，48h，72h，96h）而提高（p<0.05）；caspase-3活性明显增强。
结论 LY294002可通过提高caspase-3活性来增加卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡。
【关键词】PI3K LY294002 凋亡 caspase-3【中图分类号】R730.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）14-0071-02本研究使用PI3K特异性抑制剂LY294002作用于卵巢癌SKOV-3细胞，通过检测细胞增殖和凋亡的变化找出LY294002促进卵巢癌细胞凋亡的最优作用条件，在此基础上检测该条件下caspase-3活性的改变，以探讨LY294002影响细胞存活的作用途径。
1 材料与方法1.1主要材料卵巢癌细胞株SKOV-3购自中科院昆明动物研究所细胞库。
1.2 主要试剂LY294002，购自碧云天生物技术研究所。
MTT细胞增殖检测试剂盒、Anenexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自南京凯基生物。
Caspase-3/CPP32荧光检测试剂盒购自Biovision公司。
Caspase-3分光光度法试剂盒
凯基Caspase-3分光光度法检测试剂盒（Caspase-3 Colorimetric Assay Kit）Cat number：KGA For Research Use OnlyStore at-20℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。
Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
Caspase-3分光光度法检测试剂盒就是将caspase-3序列特异性的多肽偶联至发色基团。
当该底物被Caspase-3剪切后， 发色基团即游离出来，可通过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或400nm）测定其吸光值，考察caspase-3的活化程度。
本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织caspase-3检测。
二、 试剂盒组份组 份 Cat: KGA202（20 assays） Cat: KGA203（50 assays）Cat: KGA204（100 assays）储存条件Lysis Buffer 5.0 mL 10.0 mL 15.0 mL 4℃2×Reaction Buffer 1.0 mL 2. 5 mL 5.0 mL 4℃Caspase-3 Substrate100μL 250μL 500μL -200C，避光DTT 50 μL 100 μL 150 μL -200C三、试剂盒以外自备仪器和试剂低温高速离心机、酶标仪或分光光度计（100μL的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）1.5m L Microtube、PBS、蛋白定量试剂（可选购凯基Bradford法蛋白含量检测试剂盒或BCA蛋白浓度测定试剂盒）及仪器四、使用注意事项1. Caspase-3 Substrate避光保存及使用。
细胞凋亡检测的几种方法介绍
细胞凋亡检测的几种方法介绍细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
(一) 细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
胃癌caspase-3表达及其与细胞凋亡的关系研究
胃癌caspase-3表达及其与细胞凋亡的关系研究发表时间：2010-02-24T09:42:08.250Z 来源：《中外健康文摘》2009年第33期供稿作者：钱向红1 徐峰1 匡玉庭2[导读] 研究caspase-3表达在胃癌发生发展中的作用钱向红1 徐峰1 匡玉庭2(1泰兴市第二人民医院普外科江苏泰兴 225411）（2苏州大学附属第一医院普外科江苏苏州 215006）【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2009)33-0007-03【摘要】目的研究caspase-3表达在胃癌发生发展中的作用。
方法采用免疫组化S-P法观察113例胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞以及转移灶癌细胞中caspase-3表达，TUNEL法检测上述组织的细胞凋亡，并分析原发灶癌细胞中caspase-3表达与胃癌临床病理特征的关系，并探讨caspase-3表达与细胞凋亡的关系。
结果 caspase-3在50.4％(57/113)的胃癌旁上皮细胞中表达，高于原发灶癌细胞中的阳性率32.7％(37/113)(P<0.05);caspase-3在胃癌原发灶浸润淋巴细胞中的阳性率为70.8％(80/113)，高于胃癌旁上皮细胞和原发灶癌细胞中阳性率(P<0.05);58.1％(25/43)的转移灶癌细胞中caspase-3表达阳性，其阳性率高于对应原发灶癌细胞(34.2％，13/38)(P<0.05);原发灶癌细胞中caspase-3表达与胃癌患者的年龄、性别以及胃癌肿瘤大小、浸润深度、转移、TNM分期、生长方式和分化程度无相关性(P>0.05)。
原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞及转移灶癌细胞中细胞凋亡指数明显低于癌旁上皮细胞（P<0.01）。
结论胃癌原发灶癌细胞中caspase-3表达下调和浸润淋巴细胞中caspase-3表达上调与胃癌发生有关，由caspase-3介导的细胞凋亡与胃癌的发生与发展有关。
Caspase3_测定
Caspase3 测定caspase-3的检测方法：(1)免疫细胞化学检测caspase-3蛋白的表达，用悬浮的细胞；(2)western blot 理想结果：caspase-3有32ＫＤ的条带外，还出现了20ＫＤ和10ＫＤ大小的条带，表明caspase- 3被活化；(3)RT-PCR检测mRNA的表达，用凝胶成像分析系统处理，可以半定量。
Caspases可以在哺乳动物细胞内启动凋亡，caspase3比色蛋白酶试剂盒通过简单、方便的测定caspases活性的方法这种方法通过识别序列DEVD，这种方法基于用分光光度计测定从标记底物DEVD-pNA分开的发色团（pNA) 此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪或微量滴定板在400或405nm 检测,通过样本和背景的吸光度比较来测定caspase3活性的增加，进而推知Caspases的活性。
原理：在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA (p-nitroanilide, 对硝基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.一．实验前准备：消毒的EP管、枪头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计二．活性测定操作步骤（一）每组试剂组成Samples（lysis buffer）2×Reaction buffer DEVD-PNA 总Sample well （标本组）30ul 65ul 5ul 100ul Sample control（背景组）30ul（lysis buffer）70ul 0 100ulSample well（样本组）Sample control（背景组）3小时组N3 30ul样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC3 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R3 30ul样＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer6小时组N6 30ul对照样本30ul样本65ul Reaction buffer 70ul Reaction buffer5ul DEVD-PNAC6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul IETD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer R6 30ul样本＋65ul Reaction buffer5ul LEHD-PNA 30ul样本＋70ul Reaction buffer 共需2×Reaction buffer810 ul，配制2×830ul以防不够，用前加入8.3ul DTT活性表示为＝样本OD1－背景OD1（实验组）/样本OD2－背景OD2（对照组）（二）．操作步骤——酶标仪 1.取标记好的EP管（已消毒）2.取已冻好的冰块加点水，置插EP管的座于冰水中3. 放转子，打开高速离心机电源，时间、速度都在零位置先开机将至4摄氏度注意要配平套管A、B、C、D注意：1.速度、时间均为0时，才能开电源2.设置温度降温10min（夏天时间可以稍微长一些）3.开电源前先把转子放入4.定时－启动－慢慢调速10000转（显示为1000转）未配平－停机－重新配平－再开机5.停机灯亮，开盖（复位：速度、时间均为0)1．从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织（已称重标记好的），取2-3块（30mg/块），放在EP管中，一直浸在冰水中2．锡铂纸剥去，组织直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4摄氏度保存）约700ul 冰上EP管中，用小弯剪将心脏组织剪碎，越碎越好组织、裂解buffer比例：1：10冰上操作3．开匀浆机取几块冰块于小烧杯中，接自来水成冰水液将EP管置于盛有冰水的小烧杯中，固定于匀浆机上先做对照组将转头插于组织液面下，打开电源，逐渐调大速度至max，上下搅动，直至浑浊，基本无小的组织块为止调小速度至零，关电源，取出转头，EP管放回冰水底座用蒸馏水冲洗转头，液冲至废烧杯中依次以同样方法将样本组进行匀浆注意：放空转，慢慢加速，别转别上下移动轴4．匀浆后置于离心机内先设时间10min “起动”；缓慢增大离心速度至1000×10r/min；缓慢减小离心速度，降至30×10r/min时，“停机”灯亮，即可取出注配平：套管A、B、C、D配平5．取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀释100倍）吸取上清至小EP管依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物时，每加一次换一个枪头（因为要混匀）注：底物每取完一次都要盖盖，避光；加完底物后，混匀。
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细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应
1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
结果如下图
2 荧光分光光度计分析
原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。
根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
结果如下图
3 流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
结果：
/experiment/430/488/498/31933.htm。