免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以帮助我们更好地了解细胞的结构和功能。
那么，免疫组化的完整步骤及各步原理究竟是什么呢？别着急，让我来给大家一一道来。
我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去寻找目标蛋白，然后通过化学染色的方式将这些蛋白标记出来，这样我们就可以更加清晰地看到它们在细胞中的分布情况了。
那么，免疫组化的第一步是什么呢？没错，就是要准备好实验所需的材料和设备。
这包括：抗体、抗原、酶标板、洗涤缓冲液、PBS缓冲液、DAB染色剂等等。
当然啦，这些材料和设备都是非常珍贵的，所以我们在使用的时候一定要小心谨慎哦！接下来，我们就要开始进行免疫组化实验了。
我们需要将抗原加入到酶标板中，然后用洗涤缓冲液将其充分稀释。
接着，我们就可以将待检测的细胞涂布到酶标板上了。
这里需要注意的是，涂布的时候一定要均匀涂抹，否则就可能会影响后续的实验结果哦！涂布好细胞之后，我们就需要让它们休息一会儿了。
这个过程叫做“孵育”。
在孵育的过程中，抗体会自己找到抗原并与之结合。
这个过程通常需要几个小时的时间，具体时间取决于所使用的抗体和抗原的性质。
孵育完毕之后，我们就可以进行下一步操作了——洗涤。
洗涤的目的是去除未结合的抗原和未被抗体识别的细胞残留物。
这个过程通常需要用到PBS缓冲液或洗涤缓冲液，并且要反复洗几次才能彻底清除所有的残留物。
洗完之后，我们就可以进行染色了。
这个过程叫做“DAB染色”。
DAB染色剂可以与抗体结合产生紫色的颜色反应，从而使我们能够清晰地看到被标记出来的目标蛋白。
染色的时间通常也只需要几分钟左右就可以了。
我们还需要进行一个叫做“复染”的操作。
复染的目的是让细胞核也被染上颜色，这样我们就可以看到细胞的整体结构了。
复染通常需要用到碱性染料，比如伊红染料。
不过复染的时间也要控制好哦，过度染色可能会影响到后续的实验结果。
好了，以上就是免疫组化的完整步骤及各步原理了。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等, 用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
，免疫组化步骤1, 切片，烤片60C, 1h;2, 脱蜡及复水二甲苯10min，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，80%乙醇5min，75 %乙醇5min，60%乙醇5min，50%乙醇5min，30%乙醇5min，自来水1min，双氧水1min ；3，1份30%H2O加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min;4, 微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98E -100C）加热至沸腾，冷却（约5-10min）,反复两次；5, 将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6, 封闭，5%BSA室温20min,甩去多余液体；7, 滴加一抗，37C, 1h,或者4C过夜；8, PBS洗涤3次，每次3min；9, 滴加二抗，37°C, 15-30min ；10, PBS洗涤3次，每次3min；11, 滴加SABC 37C, 30min ；12, PBS洗涤3次，每次5min；13, 1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）;15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水；16, 苏木素复染2min,自来水冲洗；17, 脱水30%乙醇3min, 50%乙醇3min, 70%乙醇3min, 80%乙醇3min, 90%乙醇3min, 95%乙醇3min, 100%乙醇3min,二甲苯20min ；18, 树胶封片，镜检。
病理学中的免疫组化技术
病理学中的免疫组化技术病理学是临床医学的重要分支之一，其主要研究疾病的发生、发展和变化规律，以及疾病对人体的影响和治疗方法等。
在病理学研究中，免疫组化技术被广泛应用于疾病诊断、治疗和预防。
本文将详细介绍病理学中的免疫组化技术，包括其原理、应用范围、标记物及其特点、实验步骤、优点和局限性等方面。
一、原理免疫组化技术是利用免疫学原理和化学标记方法，将抗原与抗体相互作用标记，通过显微镜观察细胞或组织内部的形态、结构、组织类型等信息。
具体来说，免疫组化技术的过程包括以下几个步骤：制备标本，抗原提取、分离和纯化，制备特异性抗体，选择合适的标记物，进行免疫反应，显色和观察等。
二、应用范围免疫组化技术在病理学研究中应用广泛，包括疾病的诊断、治疗和预防方面。
例如，免疫组化技术可用于诊断肿瘤、感染性疾病、免疫系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病等。
此外，免疫组化技术也可用于药物研发、新药筛选和药物治疗监测。
三、标记物及其特点在免疫组化技术中常用的标记物包括荧光标记、辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、生物素标记等。
不同的标记物具有不同的特点。
荧光标记具有较好的定量性、灵敏度和多标记能力；辣根过氧化物酶标记具有高灵敏度和尺寸较小的优点；碱性磷酸酶标记具有高灵敏度和较小的背景信号；生物素标记具有灵敏度和多标记能力等。
四、实验步骤免疫组化技术的实验步骤包括标本制备、抗原提取、制备抗体、标记试剂制备、免疫反应、显色和观察等。
其中，标本制备是一个非常重要的步骤，直接影响实验结果。
通常标本制备需根据不同的组织类型进行不同的处理，如切片、染色、脱水、透明、封片等。
五、优点与局限性免疫组化技术具有以下优点：（1）高灵敏度和特异性，可用于检测极微量的抗原。
（2）定量性好，可用于确定抗原的浓度和分布情况。
（3）成本较低，设备简单，易于掌握。
（4）样品来源广泛，不受细胞和组织来源限制。
然而，免疫组化技术也存在着一些局限性。
如抗原存在交叉反应，标本制备不当会造成影响实验结果的问题，而且实验过程需要操作技能较高的人员。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理1. 引言免疫组化，听起来就像科学家们的秘密武器，其实它在病理学和生物医学中扮演着不可或缺的角色。
简单来说，这个方法能帮助我们在组织切片中找出特定的蛋白质，就像在侦探故事中找线索一样。
你可能会想：“这玩意儿到底是怎么回事？”别急，今天就带你深入了解免疫组化的每一步，绝对让你大开眼界。
2. 准备工作2.1 组织样本的获取首先，我们得有个“样本”。
这就像做菜，得有食材。
我们通常会从病人那儿获取组织切片，可能是肿瘤、炎症等地方。
切片越薄，越能让我们看的清楚，像是把面包切得薄薄的，涂上黄油才好吃。
2.2 切片处理接下来，把这些切片用固定剂处理，最常用的是福尔马林。
这个步骤就像给切片穿上“保护衣”，确保里面的蛋白质不会在过程中跑掉。
然后，我们还得用乙醇脱水，把水分抽走，这样才不会稀释我们要找的“宝贝”。
最后，用二甲苯清洗，让切片变得干净透亮，准备好迎接接下来的挑战。
3. 免疫反应3.1 抗体的选择免疫组化的核心就是抗体。
选择抗体就像选队友，得找对的！我们得确保这个抗体是专门针对我们想要检测的那个蛋白质的。
想象一下，你在寻找某个特定的明星，当然得找那个最熟悉的粉丝来帮忙。
3.2 抗体结合一旦选择好抗体，就把它涂在切片上，等待它和目标蛋白质结合。
这个过程就像约会，抗体和蛋白质在切片上“相遇”，彼此结合。
结合得越紧密，后面的结果就越清晰！4. 显色反应4.1 连接二级抗体接下来，我们要用二级抗体来“加油”。
这一步是让我们能看到“结合”的效果。
二级抗体会识别一级抗体，并且带上标记，像给你的队伍加上标志，显得更亮眼。
4.2 显色剂的使用然后，加入显色剂，这一步就像给你的作品上色，瞬间让切片变得活灵活现。
显色剂和标记结合后，就会产生颜色反应，形成我们最终需要的信号。
这时候，你能看到那些特定蛋白质的位置，就像在黑暗中点亮了灯塔。
5. 观察与分析5.1 显微镜观察当颜色形成后，我们就可以用显微镜观察结果了。
免疫组化原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
免疫组化的原理和步骤
免疫组织化学的概念:免疫组化就是利用抗原与特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的有哪些？免疫组化实验中常用的抗体为单抗体与多抗体。
单抗体就是一个B淋巴细胞分泌的抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。
多克隆抗体就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织与细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,前者包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,后者包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片。
其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本的方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用的修复液就是pH6、0的0、01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因:指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原- 一抗- 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,就是指带显色剂标记得特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学得呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定得一项新技术。
它把免疫反应得特异性、组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器与通风橱等、三、试剂配制1、0。
01M PBS(ｐH 7.34 ):9.０g ＮａCl + ５0 mｌ０.2 M PB加双蒸水至１0０0ml;１000 mｌ0。
２M PB(ｐH7、4)＝5。
93 ｇＮaH２ＰＯ4 ·2Ｈ2 O+５8。
０2 g Na ２HPO 4 ·１2Ｈ 2 O in １000 ｍl双蒸水或=190ml A +810 ml B(A、０、2ＭＮaH 2 ＰO 4 ·2H ２O:15。
6 ｇｉn 500ml ddH 2 O;Ｂ。
０、2ＭNa 2 ＨPＯ 4 ·12H 2 O:７1、６32ｇin 1000 ｍl ｄH 2 O)。
2. Ｃｉｔrate Buｆfered Saliｎe(０。
01 M 柠檬酸缓冲液,PＨ6.０):28 ml A + 72 mｌB + ２00 mｌｄdＨ２Ｏ(Ａ。
Cｉtｒate aciｄ(柠檬酸):10.５g 加双蒸水至1０00ml;Ｂ。
C ｉtrate sodｉum(柠檬酸钠):29。
41 g 加双蒸水至1000 ml)、３、细胞通透液:由终浓度分别为0.3％双氧水与0、３%Trｉton X－100 混合而成。
配制方法就是先用微波加热得36ｍｌPBS,再接着加120 ｕｌＴritonＸ－10０,并加热一儿,冷却至临用前加0。
４ｍl 30％H 2 O 2 。
免疫组化原理及流程介绍
免疫组化原理及流程介绍免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用免疫反应来检测组织内特定抗原的技术。
它通过将特定的抗体与要检测的组织染色连接，从而实现对该抗原的可视化检测和定位。
免疫组化广泛应用于病理学领域，可以用于诊断和鉴定疾病，研究疾病发生机制以及评估治疗效果。
下面将介绍免疫组化的工作原理和流程。
免疫组化的工作原理可以分为两个步骤：抗原-抗体反应和可视化。
抗原-抗体反应是指将固定的组织样本与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
这种特异性的结合是由于抗原与抗体之间具有互补的结构，类似于锁与钥的关系。
一旦抗原-抗体结合发生，可以通过一系列的化学反应来可视化这种结合，从而观察到抗原的位置和表达水平。
免疫组化的流程一般可以分为样本制备、抗原修复、抗体染色和结果分析四个主要步骤。
样本制备：首先，需要取得要检测的组织样本。
这些组织样本可以是切片、细胞涂片或者细胞悬液。
然后，将样本固定在载玻片上，以保持组织结构的完整性。
抗原修复：组织样本的形态学上常常被固定剂和时间的影响而改变，导致抗原的结构发生损坏。
为了修复抗原使其可被抗体识别，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括高压蒸汽处理（例如蒸气胶片锅或蒸箱）和化学处理（例如酶解或化学溶解）。
抗体染色：通过将特异性抗体与要检测的抗原结合，可实现抗原-抗体复合物的形成。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用直接染色或间接染色技术。
直接染色是将抗原和抗体直接连接，通过抗原-抗体复合物可视化抗原的表达水平。
间接染色是先与一种包含特异性抗体的二抗结合，再利用第二抗体与标记物（通常是酶或荧光标记）结合，从而放大信号。
结果分析：通过显微镜观察染色结果，评估抗原的表达情况和分布。
常用的评估方法包括定性评估和定量评估。
定性评估是通过观察染色强度和细胞定位来判断抗原的表达水平和细胞类型。
定量评估则是通过计算染色阳性的细胞数量或染色强度来定量化抗原的表达水平。
免疫组化超详细步骤
免疫组化一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况二实验原理:应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术.三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机五主要试剂配置:缓冲液应用液ANaH2PO438.4g配成1000毫升溶液应用液BNa2HPO4·12H2O114.8g配成1000毫升溶液配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。
枸橼酸钠抗原修复液应用液A枸橼酸10.55g配成1000毫升溶液应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）29.01g配成1000毫升溶液配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。
苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。
先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。
两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。
抗体说明书建议的抗体稀释度N-Ras1:50-1:500H-Ras1:50-1:500K-Ras1:20-1:200六实验步骤：1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。
2切片脱蜡水化程序⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟；⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯）⑶95%乙醇3分钟；⑷85%乙醇3分钟；3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。
4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入pH6.0，0.01M抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理一、前言免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤1. 取材首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。
对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。
然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性位点，使其能够被抗体识别。
抗原修复方法有多种，如高温加压法、微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。
常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其与靶分子结合。
然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。
通常二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。
底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化氢等催化剂。
9. 盖片封装最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。
这样可以保持样本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够被免疫系统识别并引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽等。
抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性结合能力的分子，可以识别和结合到相应的抗原上。
在进行免疫组化实验时，首先需要选择一种特异性较高的一抗，使其与靶分子结合。
然后加入来源于不同物种的二抗，使其与第一抗体结合。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化是一种广泛应用于生命科学领域的技术，可以用来检测和鉴定细胞和组织中特定蛋白分子的存在、定位和表达量。
免疫组化基于免疫学原理，通过使用特异性抗体与待检测分子特异性结合，再通过可视化和定量分析来观察和测定待检测分子的存在和分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的原理和步骤。
免疫组化的原理：免疫组化是基于免疫学原理的一种实验方法，其核心原理是特异性抗体与待检测分子的免疫反应。
免疫反应可分为两种类型：直接法和间接法。
1.直接法：直接法是指特异性抗体直接与待检测分子发生免疫反应。
在这种方法中，待检测物与特异性抗体结合后，通过标记在抗体上的标记物来直接检测待检测物的存在。
常用的直接标记物包括酶（如辣根过氧化物酶HRP）、荧光染料（如荧光素同工酶）和放射性同位素（如3H和125I）。
直接法的优点是操作简单，敏感度高，但标记物的选择受限。
2.间接法：间接法是指通过特异性抗体与检测物结合，再加入与抗体结合的二抗发生免疫反应。
间接法的优点是能够使用多种不同的二抗，从而提高了敏感度和特异性。
常用的二抗包括抗IgG的兔抗或小鼠抗。
这些二抗通常是与辣根过氧化物酶结合，并以酶标记物（如DAB）或荧光染料（如荧光素同工酶）来可视化。
免疫组化的步骤：免疫组化实验通常需要经过一系列的步骤，包括固定组织、制备切片、抗原解脱、抗体标记和可视化。
下面是免疫组化的详细步骤：1.组织固定：首先将待检的组织材料使用适当的固定剂进行处理，目的是固定细胞和组织结构，以保持其形态和抗原的保存。
常见的固定剂包括福尔马林、乙酸乙酯、乙醇等。
2.制备组织切片：使用组织切片机将固定的组织切割成薄片，通常厚度为3-5微米。
切片后，可以将切片保存在载玻片上待用。
3.抗原解脱：组织切片上的抗原往往由于固定处理而失去了原有的免疫反应活性，需要进行抗原解脱的处理。
抗原解脱的方法包括酶解法、热解法和酸解法等，可以恢复抗原的免疫反应性。
4.抗体标记：选择适当的特异性抗体，并将其与标记物结合。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
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免疫组化技术原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原- 一抗- 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。
3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。
胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。
因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。
由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。
如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法5、放射免疫自显影法标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干→涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h②SP三步法1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min2、水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min3、PBS冲洗2-3次，每次5min4、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性5、PBS冲洗2-3次，每次5min6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温7、PBS冲洗2-3次，每次5min8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）10、PBS冲洗2-3次，每次5min11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h12、PBS冲洗2-3次，每次5min13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h14、PBS冲洗2-3次，每次5min15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）（A：DAB B：H2O2C：磷酸缓冲液）16、自来水冲洗10分钟终止反应17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化18、自来水冲洗10-15min19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检③结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
试剂、设备：1、PBS：0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制-- 取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g或Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。
2、固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制–a.0.1M磷酸盐缓冲液：取A液400ml与B液80ml混合后，调pH于7.4，再定容至500mlA液：0.1mol/L Na2HPO4（Na2HPO4•12H2O 35.8g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/L NaH2PO4（NaH2PO4•2H2O 15.6g加水定容至1000ml）b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g多聚甲醛溶于500ml 0.1M磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约2-3h后溶解3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%4、二甲苯5、包埋剂：石蜡6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）7、抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）配制-- 取A液8ml与B液42ml混合后加水至400ml，调pH于6.0，再定容至500mlA液：0.1mol/L 柠檬酸（C6H8O7•H2O 21.01g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/L 柠檬酸钠（Na3C6H5O7•2H2O 29.41g加水定容至1000ml）8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）试剂A -- 阻断剂：3%甲醇-H2O2溶液（30%H2O2和80%甲醇溶液配制）试剂B -- 封闭液：正常非免疫动物血清试剂C -- 二抗（辣根过氧化物酶标记）试剂D -- SP（链霉亲和素-过氧化物酶）9、一抗（特异结合底物）10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统附：EDTA（乙二胺四乙酸）：即依地酸钠钙，是钙离子络合剂、洗涤剂、血液抗凝剂常用固定液1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
（1）3%中性甲醛固定液液：30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml（2）24%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml，加热搅拌（注意不要沸腾）至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml（3）戊二醛－多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1％的戊二醛（4）Bouin液：40％甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.（5）PLP液(过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液)2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀（1）AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml（2）Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定（3）Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存（4）丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在4℃冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min3、其他固定剂（1）Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测（2）四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因：a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；b. 甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复（1）高压热修复：在沸水中加入0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。