关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
分子生物学实验中常见的问题与对策-9
分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。
2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。
4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。
另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。
5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。
对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。
6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。
9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。
2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。
另外，不要使⽤过多菌体。
经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。
如何避免食用菌接种环节的杂菌污染
摸索蘑菇种植规律 。功夫不负有心人 ，蘑菇 种植 当年就给他带来丰厚的收入 ，
年产值 达８ 万元 ，纯收入５ 万元 以上 。
依靠种植蘑 菇使袁德 永走上致富路 ，但他并没有忘记带动乡亲共 同致富 。 当他成功的消息传遍 了周边村庄 ，吸引不少 人过来取经学艺时 ，他不管是生人
还 是亲戚朋 友 ，总是热情接待 ，毫无保 留地传授香菇 生产 经验 和技术。如今 ，
在 他的帮助下 ，江苏连云港 、新沂和本县周 围一 些农 民也种起 了蘑 菇 ，开始 走 上 蘑菇致富路。 （ 李静 良 山东省 郯城县 归昌 乡党委 邮编 ：２ ７ ６ １ ２ ２）
１ ． 各种 接种工具 和用 品等应随 同料 中暴 露时 间过长 ， “ 准” 指的是接 种动 袋 、料 瓶 、菌种等一 并进行 消毒处理 ，
２ ． 接 种 箱 消 毒 使 用 物 无菌 操 作 规 程 。
气 雾 消毒 剂 、福尔 马林 等对 空气 消毒 时 ，会 发 生 氧化 反 应产 生 大量 的 热 量 ，因此 ，在保 证 消 毒 效果 的 前提 下 ，消 毒 剂的使用不宜过量。 ３ ． 提 高接 种速 度 ， 控 制 好接 种 时间 。接 种 速 度慢 、时 间长 ，不 仅 工 作 效率 低 、生产 周 期
品。
作要 准确 到位过程 中 向箱 内传 递 物 要到处乱撞 、乱放 。 ５ 、接种操作完毕 ，及时移走物品 ， ２ 。 进箱操作前 ，在箱外用清水洗净双 并将箱 内收拾干净 。
三 、避 免接种箱 内空气 杂茵 引起的
焰 “ 封 口”的 目的。 ４． 接 种操 作 要做 到 “ 轻 、快 、
使用 同一种 消毒剂 引起消毒 效果差 ，生 产上 应注意 不 同的消毒剂 轮换使用 ）。
《防止杂菌污染的技术》 讲义
《防止杂菌污染的技术》讲义一、引言在各种生产和实验环境中，防止杂菌污染是至关重要的。
杂菌的污染不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致严重的安全问题。
因此，掌握有效的防止杂菌污染的技术是必不可少的。
二、杂菌污染的来源（一）空气传播空气中存在着大量的微生物，如细菌、真菌孢子等。
在通风不良的环境中，这些微生物容易随着空气流动进入工作区域，造成污染。
（二）人员带入操作人员自身可能携带杂菌，如皮肤表面、衣物上的微生物。
在操作过程中，如果不遵循严格的卫生规范，就容易将杂菌引入到工作环境中。
（三）原材料污染原材料在采集、运输和储存过程中，如果受到污染，也会成为杂菌的来源。
（四）设备和器具未经过彻底清洁和消毒的设备、器具表面可能附着有杂菌。
三、防止杂菌污染的技术措施（一）环境控制1、清洁和消毒定期对工作环境进行彻底的清洁，包括地面、墙壁、天花板等。
使用有效的消毒剂，如含氯消毒剂、过氧乙酸等，按照规定的浓度和作用时间进行消毒处理。
2、通风系统安装良好的通风系统，保证空气的流通和新鲜。
可以采用过滤装置，如高效空气过滤器（HEPA），过滤空气中的微生物。
3、温度和湿度控制保持适宜的温度和湿度条件，不同的生产或实验环境可能有不同的要求，但一般来说，较低的温度和湿度不利于微生物的生长繁殖。
（二）人员管理1、培训对操作人员进行严格的培训，使其了解杂菌污染的危害和预防措施，掌握正确的操作方法和卫生规范。
2、着装要求操作人员应穿着专门的工作服、帽子、口罩和手套，进入工作区域前要进行清洁和消毒。
3、洗手和消毒在操作前后，操作人员要严格洗手，并使用消毒剂进行消毒。
（三）原材料控制1、采购选择质量可靠的原材料供应商，确保原材料在采集和运输过程中不受污染。
2、检验对原材料进行严格的检验，检测是否存在杂菌污染。
对于有污染风险的原材料，要进行预处理，如消毒、灭菌等。
3、储存原材料应储存在适宜的环境中，避免受潮、受污染。
（四）设备和器具的清洁与消毒1、定期清洁制定设备和器具的清洁计划，定期进行拆卸、清洗和消毒。
质粒提取实验注意事项
质粒提取实验注意事项质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它能够从细菌中提取目标质粒，用于后续的转染、定量PCR、序列测定等实验。
质粒提取实验虽然操作简单，但是仍然需要遵循一定的注意事项，才能确保实验的顺利进行和结果的准确性。
下面将介绍质粒提取实验的注意事项。
1. 实验前的准备工作：在进行质粒提取实验之前，首先要做好实验室的准备工作。
要确保实验室中的工作台、仪器和试剂瓶都是干净整洁的，避免污染影响实验结果。
另外，要准备好所需的耗材和试剂，如离心管、离心管架、洗涤缓冲液、溶解缓冲液等。
并根据实验计划，提前准备好质粒所在的宿主菌培养液，提取缓冲液等相关材料。
2. 操作过程中的注意事项：在进行质粒提取实验的操作过程中，需要严格遵守操作规程，确保实验操作的准确性和稳定性。
在进行菌培养和离心等步骤时，要避免振荡或剧烈振动，以免对菌体和质粒的完整性产生影响。
另外，在使用洗涤缓冲液、溶解缓冲液和纯化缓冲液时，要注意溶液的pH值和温度是否符合要求，以及是否在有效期内。
同时要注意防止留下DNA和蛋白质残留，避免污染影响后续实验。
3. 质粒提取后的保存和处理：在完成质粒提取实验后，提取得到的质粒需进行适当的保存和处理。
一般情况下，提取得到的质粒可以用无菌的ddH2O或TE缓冲液溶解后，分装成适量的小份，然后在-20或更低的温度下保存。
另外要注意标记好每份提取得到的质粒，以免混淆。
在进行保存和后续实验过程中，要避免频繁的冻融，以免对质粒的完整性产生影响。
4. 实验后的清洁和记录工作：在完成质粒提取实验后，要及时清理实验台和操作工具，保持实验室的整洁。
同时要详细记录实验过程中的操作步骤、使用的试剂和仪器，以及实验结果等相关信息。
这些记录对于实验结果的分析和后续实验的开展都是十分重要的。
总之，质粒提取实验是一项重要的实验技术，在进行实验时需要严格遵循操作规程，注意操作细节，确保实验结果的准确性和可靠性。
希本通过本文介绍的注意事项，能够帮助实验人员顺利进行质粒提取实验，并获得高质量的实验数据。
质粒提取常见问题
细菌太老，活力不够 质粒为严谨型 在 DNA 结合溶液中已经 形成沉淀
画线培养细菌使之活化。 使用 5-10ml 菌液但是不要超过 10ml 菌液。
将 DNA 结合溶液加热到 37℃混匀冷却到 30℃备用。
DNA 结合柱太干 用错试剂
步骤 7 之后立即用 DP 洗脱液洗脱。 请仔细核对试剂名称。
用自动 荧光 测序没 有结果
悬器或剧烈震荡
紫外测定 DNA 浓度 低于琼 脂糖 凝胶测 定浓度
微量的 污染物 同时 被洗脱 出来， 会影响 紫外 分光光 度计读数
用酚/仿抽提， 酒精沉淀，70%酒 精清洗后干燥， 水溶，重 新紫外定量。
质粒酶切效果不好
要优化
使用 TE 缓冲液 使用 EndA+菌株导致 DNA 在酶切时降解
总体积的 1/10，酶切时间不要超过 2 小时。 尽量使用 DP 洗脱液洗脱。 在步骤 5 之后用 1ml 40%异丙醇/4.2M 盐酸胍溶液清洗 DNA 胞 裂解溶 液后 使用涡 加细胞裂解溶液后不要剧烈震荡
测序反应体系中 DNA 的 量加得不够
使用 TE 洗脱
杂质多 内切酶 浓度和 酶切 时间需
提取的质粒要经过琼脂糖凝胶电泳定量。要使用新鲜的 LB 培养基和新活化的菌株摇菌。
最好使用 DP 洗脱液洗脱（TE 中的 EDTA 能降低测序反应 中 M g2+的有效浓度）。 重复步骤 6。 尽量使用内切酶 的最佳酶切 缓冲液；内 切酶浓度不 要超过
DNA 结合柱中酒精没有除 增加步骤 7 的离心时间，如果 DNA 已经洗脱出来，可以用
干净。
酒精沉淀 DNA 并风干，然后水溶。
摇细菌 时间太 长， 造成空 菌生长过量。
确认是否所有的 培养基都加 了抗生素， 不要培养细 菌超过 24 小时（固体/液体培养基），一般 12-16 小时已经足够。
质粒提取中常见的问题
质粒提取中常见的问题质粒DNA提取常见问题分析1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
《防止杂菌污染的技术》 讲义
《防止杂菌污染的技术》讲义一、引言在各种生产和实验过程中，杂菌污染是一个经常面临的问题。
杂菌的存在不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致严重的经济损失和安全隐患。
因此，掌握有效的防止杂菌污染的技术至关重要。
本讲义将详细介绍防止杂菌污染的相关技术，希望能为大家提供有益的参考。
二、杂菌污染的来源与危害（一）杂菌污染的来源1、空气传播空气中存在着大量的微生物，如细菌、真菌孢子等。
在通风不良的环境中，这些微生物容易进入生产区域，造成污染。
2、人员操作操作人员的手部、衣物、头发等可能携带杂菌。
如果操作不规范，如未进行严格的消毒、未遵循无菌操作流程等，就容易将杂菌引入。
3、原材料原材料本身可能带有杂菌，如果在使用前未进行有效的处理和检测，就会成为污染源。
4、设备和器具生产设备、容器、工具等如果清洁消毒不彻底，也会滋生和传播杂菌。
（二）杂菌污染的危害1、降低产品质量杂菌的生长和代谢可能会改变产品的成分、结构和性能，导致产品质量下降，不符合标准要求。
2、影响生产效率杂菌的存在可能会消耗营养物质，干扰正常的生产过程，从而降低生产效率，增加生产成本。
3、引发安全问题某些杂菌可能会产生毒素或有害物质，对人体健康造成威胁。
在食品、药品等行业，杂菌污染更是可能引发严重的安全事故。
三、防止杂菌污染的基本原则（一）清洁卫生保持生产环境、设备、器具等的清洁是防止杂菌污染的基础。
定期进行清洁、消毒，去除污垢和微生物滋生的条件。
（二）无菌操作在涉及微生物培养、药品生产等对无菌要求较高的操作中，必须严格遵循无菌操作规范，如使用无菌器具、在无菌环境中操作等。
（三）控制污染源对可能的污染源进行有效控制，如对原材料进行严格检测和处理，加强人员培训和管理，确保操作规范。
（四）监测与检测建立有效的监测和检测机制，及时发现杂菌污染的迹象，采取措施进行处理，防止污染扩散。
四、防止杂菌污染的具体技术（一）环境控制技术1、空气净化采用高效空气过滤器（HEPA）等设备，对进入生产区域的空气进行过滤，去除空气中的微生物。
质粒提取常见问题解析
其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱
缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
△ 洗脱体积太小
洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降
溶液，才能使用。
△ 吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若
用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高
的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
△ 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）
洗脱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
△ 混有RNA
RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如
果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。
△ 混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从
而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用
应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
△ 碱裂解不充分
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、
P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能
有助于增加质粒提取量和质粒质量。
△ 溶液使用不当
溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的
△ 大肠杆菌老化
请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
质粒提取问题与心得
质粒提取问题与心得质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA。
质粒是细菌细胞内的环状DNA分子，通常用于在细菌中传递外源基因。
质粒提取的过程涉及细胞破裂、DNA纯化和浓缩等步骤，下面我将从几个方面来谈谈质粒提取的问题与心得。
首先，质粒提取的关键步骤包括细胞破裂、DNA纯化和浓缩。
在细胞破裂过程中，使用适当的细胞破裂缓冲液和方法对细菌进行破裂，释放质粒DNA。
在DNA纯化过程中，通过离心、溶液添加和酚/氯仿提取等方法，将质粒DNA与蛋白质、RNA等杂质分离。
最后，通过乙醇沉淀等方法对DNA进行浓缩，得到纯净的质粒DNA。
其次，质粒提取过程中可能遇到的问题包括DNA污染、纯化不彻底、DNA浓度不足等。
为了解决这些问题，可以在细胞破裂缓冲液中添加蛋白酶等物质，提高DNA的纯化效果；在DNA纯化过程中，可以多次进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀，提高纯化的彻底性；在最后的浓缩过程中，可以根据实际情况调整乙醇的浓度，以获得所需浓度的质粒DNA。
此外，质粒提取的心得体会包括操作技巧、实验条件和耐心。
在进行质粒提取实验时，需要熟练掌握各个步骤的操作技巧，尤其是在细胞破裂和DNA纯化过程中需要细心操作；实验条件也很重要，包括细菌培养的状态、破裂缓冲液的配制和储存等；此外，需要有耐心，因为质粒提取是一个细致而耗时的过程，需要耐心等待和细心操作。
综上所述，质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，需要注意细节、耐心等。
在实际操作中，我们需要不断总结经验，积累心得，以期获得更好的实验结果。
希望以上内容能够对你有所帮助。
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。
我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。
其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。
但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。
可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。
说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。
为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。
实验方案实验步骤根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。
实验结果（一）Buffer II裂解不完全如上图所示1、2号为正常的大肠杆菌加入BufferII后溶液变粘稠的澄清液体；而部分染菌的细菌3、4号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5、6号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊液体。
在加入Buffer II时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物。
对于1、2号正常的革兰氏阴性细菌，Buffer II溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的澄清液体，而3、4号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II溶液能溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、真菌）的细胞壁却不能破裂，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。
5、6号都为杂菌，它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。
质粒提取常见问题及解决办法
质粒提取常见问题及解决办法涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死?参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。
蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。
建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。
同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。
解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下!【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。
只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。
而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。
对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。
】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决?参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。
质粒提取注意事项
质粒提取注意事项1. 质粒制备的基本原理是什么？答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。
所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。
制备质粒最常用的方式是碱裂解法。
质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。
SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。
如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。
我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
2. 质粒DNA 制备的关键是什么？答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。
质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。
这些变性质粒，不能酶切。
所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。
3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。
如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。
要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。
杂菌污染的途径和防治
杂菌污染的途径和防治杂菌污染的途径和防治来源：青岛海博《微生物工程》一、种子带菌及其防治由于种子带菌而发生的染菌率虽然不高，但它是发酵前期染菌的重要原因之一，是发酵生产成败的关键，因而对种子染菌的检查和染菌的防治是极为重要的。
种子带菌的原因主要有保藏的斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所涉及的设备和装置染菌等。
针对上述染菌原因，生产上常用以下的一些措施予以防治。
①严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。
除常用的紫外线杀菌外，如发现无菌室已污染较多的细菌，可采用石碳酸或土霉素等进行灭菌；如发现无菌室有较多的霉菌，则可采用制霉菌素等进行灭菌；如果污染噬菌体，通常就用甲醛、双氧水或高锰酸钾等灭菌剂进行处理。
②在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。
为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度，保存温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化。
③对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用。
④对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌。
二、空气带菌及其防治无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。
要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度。
设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。
碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及可能出现的问题(最新整理)
碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及提取中可能出现的问题一、质粒提取三种溶液的作用：1.溶液I溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
1. 溶液II溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。
质粒DNA提取实验常见问题解答
3.出现严重的RNA污染？
（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？
是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。
8.质粒为何会丢失？
细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
（4）Solution II出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。
（4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。
5.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现基因组DNA的污染？
（1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。
（2）加Solution II时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：将裂解步骤控制在5分钟内完成。
（3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。
大提质粒注意事项
大提质粒注意事项
提取质粒时需要注意以下几点：
1. 注意操作规范，避免污染：提取质粒的过程需要严格控制，避免交叉污染和外界杂菌的侵入。
在操作过程中要保证在无菌环境下进行，并按照操作规范进行每一步操作。
2. 注意使用试剂的纯度：提取质粒所使用的试剂要求纯度较高，避免使用过期或劣质的试剂，以免影响提取效果。
3. 注意控制温度和时间：在提取质粒的过程中，需要控制好温度和时间，保证DNA的完整性和纯度。
同时，对于不同的质粒需要采用不同的方法和条件进行提取。
4. 注意观察和记录实验结果：在实验过程中需要随时观察实验结果，如有问题及时调整操作步骤或更换试剂。
同时，实验结束后需要记录实验结果，以便后续的分析和处理。
5. 注意安全：提取质粒过程中使用的试剂和器具具有一定的危险性，需要注意安全防护措施，避免对人体造成危害。
6. 做好质粒的保存工作：提取出的质粒需要妥善保存，避免污染和降解。
在保存过程中要选择适当的保存条件和方法，以保证质粒的质量和稳定性。
7. 实验人员要求：进行此实验前需具备一定的分子生物学实验基础，且应熟悉质粒提取的相关知识。
以上是提取质粒时需要注意的几点事项，仅供参考。
提取细菌质粒纯度浓度不高的原因
提取细菌质粒纯度浓度不高的原因细菌质粒纯度浓度不高的原因有很多，以下是一些可能的原因：1.细菌菌株选择不当：细菌质粒纯度浓度不高可能是由于选择的细菌菌株不适合质粒扩增。
不同的细菌菌株对质粒的扩增能力有所不同，有些菌株可能能够更高效地扩增质粒，而有些菌株则相对较差。
因此，在选择细菌菌株时需要考虑其适应性和扩增能力。
2.外源质粒结构不稳定：质粒的结构不稳定可能是导致质粒纯度浓度不高的原因之一、质粒可能存在构象不稳定、环结构不完整以及选择性缺失等问题，导致在细菌菌株中丧失或降低了质粒的稳定性。
为了提高质粒的稳定性，可以考虑优化质粒结构或使用更稳定的质粒载体。
3.构建质粒时存在操作失误：在构建质粒时，操作失误也会导致质粒纯度浓度不高。
例如，DNA片段连接不完整、连接酶反应时间不足等，都可能导致质粒构建不完整或不稳定。
此外，质粒的扩增条件和培养条件等也可能影响到质粒的纯度和浓度。
因此，操作过程中需要严格控制各个步骤，确保质粒构建的完整性和稳定性。
4.细菌培养条件不适合质粒扩增：质粒扩增需要适当的细菌培养条件，如温度、营养物质等。
如果培养条件不适合质粒的扩增，可能会导致质粒纯度浓度不高。
因此，在进行质粒扩增实验时，需要优化培养条件，确保细菌菌株能够在适宜的环境中进行高效的质粒扩增。
5.质粒提取方法不合理：质粒提取方法的选择也会对质粒纯度和浓度产生影响。
使用不合适的提取方法可能导致质粒的损失、降解或污染，从而影响到质粒的纯度和浓度。
因此，在进行质粒提取时，需要选择合适的方法，并严格控制各个步骤，以确保质粒的高纯度和高浓度。
综上所述，细菌质粒纯度浓度不高可能是由于细菌菌株选择不当、外源质粒结构不稳定、操作失误、细菌培养条件不适合以及质粒提取方法不合理等原因所致。
为了提高质粒纯度浓度，需要综合考虑以上因素，并优化相关的实验条件和方法。
提取细菌质粒纯度浓度不高的原因
提取细菌质粒纯度浓度不高的原因细菌质粒是细菌细胞内含有的一种环状DNA分子，它可以独立于细菌染色体复制和传递。
在分子生物学研究中，细菌质粒被广泛应用于基因克隆、重组蛋白表达等领域。
然而，有时候我们在提取细菌质粒时会遇到纯度浓度不高的情况。
下面我将就可能导致细菌质粒纯度浓度不高的几个原因进行详细介绍。
细菌质粒纯度浓度不高的一个原因可能是细菌培养条件不佳。
细菌在培养过程中，需要适宜的温度、pH值和培养基成分等因素来提供良好的生长环境。
如果这些条件不合适，细菌的生长和复制过程可能会受到影响，进而影响到细菌质粒的复制和产量。
因此，在进行细菌培养和提取质粒时，我们需要注意合理调节培养条件，确保细菌处于良好的生长状态。
细菌质粒纯度浓度不高的原因还可能与提取方法有关。
目前常用的提取细菌质粒的方法有碱裂解法、溶解法和离心法等。
不同的方法适用于不同的细菌，但是无论采用何种方法，都需要注意提取条件的控制。
例如，在碱裂解法中，细菌裂解液的pH值、浓度和处理时间等因素都会对提取效果产生影响。
如果这些条件控制不当，可能会导致细菌质粒的破坏或丢失，进而影响到纯度和浓度的提高。
细菌质粒纯度浓度不高的原因还可能与细菌的菌株和质粒本身的特性有关。
不同的细菌菌株在质粒复制和稳定性方面存在差异，有些菌株可能在质粒复制过程中容易产生突变或丢失。
细菌质粒纯度浓度不高的原因还可能与实验操作和处理过程中的一些误差有关。
在提取过程中，如操作不慎、杂质污染或提取液的浓度计算错误等因素都可能导致细菌质粒的纯度和浓度下降。
因此，在进行实验操作时，我们需要仔细操作，避免任何可能导致误差的因素。
细菌质粒纯度浓度不高的原因可能涉及细菌培养条件、提取方法、菌株和质粒特性以及实验操作等多个方面。
为了获得更高的细菌质粒纯度和浓度，我们需要合理调节培养条件，选择合适的提取方法和菌株，同时注意实验操作的准确性和细致性。
通过不断的优化和改进，我们可以提高细菌质粒的纯度和浓度，为后续的实验研究提供可靠的基础。
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。
我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。
其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。
但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。
可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。
说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。
为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。
实验方案实验步骤根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。
实验结果（一）Buffer II裂解不完全如上图所示1、2号为正常的大肠杆菌加入BufferII后溶液变粘稠的澄清液体；而部分染菌的细菌3、4号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5、6号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊液体。
在加入Buffer II时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物。
对于1、2号正常的革兰氏阴性细菌，Buffer II溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的澄清液体，而3、4号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II溶液能溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、真菌）的细胞壁却不能破裂，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。
5、6号都为杂菌，它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。
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关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过
对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。
我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。
其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。
但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。
可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。
说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。
为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。
实验方案
编号具体方案
号高拷贝质粒的大肠杆菌1 2号号染杂菌的大肠杆菌3 4号全为杂菌（酵母菌）号
5．6号
实验步骤
根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。
实验结果
（一）Buffer II裂解不完全
后溶液变粘稠的澄清液体；而部分BufferII2号为正常的大肠杆菌加入如上图所示1、号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊、64号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5染菌的细菌3、液体。
时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变Buffer II 在加入号正常的革兰氏阴性细2等细胞内容物。
对于1、性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的DNAII溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒菌，Buffer
溶液能号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II澄清液体，而3、4的细胞壁却不能破裂，真菌）溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、5、6号都为杂菌，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。
它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。
（二）拷贝数降低或质粒丢
失．
图2
如上图所示1、2号正常细菌浓度平均在545ng/μl左右，而3、4号染杂菌的细菌浓度平均在340ng/μl左右，较1、2号正常的细菌浓度有明显的降低，这是因为杂菌不含质粒DNA，故相同细菌量时，所得的质粒DNA就减少了；而全部为杂菌的5、6号则浓度最低，平均为83ng/μl。
看到这里同学们可能就有疑问了那为什么杂菌也会有浓度呢？这是因为Buffer II溶液对杂菌的细胞
壁仍有腐蚀作用，但是只能溶解部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），而浓度值主要是因为有RNA残留。
在我们平时转接菌液时，很多同学或实验室人员为了方便会多次转接我们要用的菌液。
其实这是个严重的不规范操作行为，会很容易造成杂菌污染，因为每次开盖转接都会存在染杂菌的风险，多次开盖会使染杂菌的风险增大，一旦染杂菌后就会对这次以及以后的实验会产生影响，即在一次次的转接时杂菌长时间在培养液中，大量传代，以至于它们在培养液中的比重加大，造成在随后的质粒抽提等的实验中影响实验结果，会产生最后所提的质粒得率降低等问题。
从电泳图的亮暗来判断
图3
号则6、5号细菌，而全为杂菌的4、3号正常细菌条带亮于染杂菌的2、1如上图所示
看不到条带，因为它不含质粒。
看到这里大家可能会问那怎么避免细菌培养中长杂菌呢，那就需要大家在实验的过程中注意细节，保证在无菌环境下操作且用到的东西都事先灭菌；控制细菌过夜培养时间；每次接种细菌都从新鲜制备或划线的平板中挑取单菌落接种；并且在质粒抽提前仔细阅读试剂盒说明书后进行操作；注意这些细节肯定会成功。
说明：simgen原创文章，如需转载请注明来源出处
杭州新景生物试剂开发有限公司
新景生物实验室。