表达载体的构建

关于表达载体的构建

1.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子；

2.大肠杆菌中的表达载体应含有

（1）强启动子

（2）在启动子下游区和A TG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3.载体构建的步骤

（1）.设计引物

1.引物的长度用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。

2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR

反应失败。

3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)

4. 引物的GC含量引物中GC含量应占到45％一60％左右。在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3，端不应有互补结构。引物3，端应与目的片段完全配匹，而其5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设计时可在其5，端加上限制酶位点或其他短的序列，这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因的两侧又有了新的限制酶位点，用相应

的限制酶切割后即可将PCR产物定向克隆到载体中。以基因GhAGP31为例说明，以下是GhAGP31的ORF序列：ATGGGGTTTGCTGTAATAGTACTAGTAGTTAAAGCTGCTTTGCTTGTGCAGCTTTCACT GTTGTTACTGAGCACCTTCACTGTCTCTGCTCCCATTTGGCCTCAGGCTTCTCCTCCTC ATTACCATGCTGTTTCACCTGTAGTCCCGCCTACTCACCCACCAACCCACCACCATCAC CACCACCCTCACCCTCACCCTCACCCCCATCCTCATCCACCCACTAAGCCCCCAACCC CCACTCCTCCTCCAGTTCA TCCACCACCCAAGGCGCCAGTGCAACCACCAACCAAGC CACCAGTTCACCCACCACCCAAGCCACCAGTTCAACCTCCAACTAAGCCACCAACCA AACCTCCAACTCAACCCCCGACTAAGCCACCAACTCAGCCCCCGACTAAGCCACCAA CCAAGCCTCCAACTCAGCCCCCGACGAAGCCACCAACACACCCACCATCTCATCCTC CGGCCAAGCCACCTAAA TCGAGCCAGGTGGCAGTGCAGGGCGTTGTTTATTGCAAGT CA TGCAAGTACGCCGGAGTCGACACCCTTTTGGGAGCTAAACCAATTCTTAGTGCCAC CGTAAGGCTGACA TGCAAAGACGCTAAAAACGAATTAACGGTCCAGTTCAAGACTGA CAAGAATGGTTA TTTCTTCCTGCAAGCACCAATTACCATCTACAATTTTGATCTCCACA ATTGCAGCGTCTCCCTCGTATCTTCACCATTGAAAGCATGCAGCAAGCCA TCTAATCTA AACGGTGGATTGAAGGGCGCCCCCTTGAAGCCTGAGAAACCATCTACTTCAAAGAAG CTCCCATATGTTCTCTACAGCGTTGGGCCCTTCGCTTTCGAACCCACATGTCACAAGAA CTAG

GhAGP31Up1: 5’>CTTGGA TCCATGGGGTTTGCTGTAATAGTAC<3’BamHI GhAGP31Dn1: 5’>CTTTCTAGAGTTCTTGTGACA TGTGGGTTCG<3’XbaI 两条引物都有CTT作为保护碱基，同时平衡引物中的G+C含量。CTT后面6个碱基为酶切位点，分别为BamHI（GGATCC）、XbaI（TCTAGA）酶切位点，接下来Up1为ORF 内一段以ATG开头的上游序列，共22个碱基，Dn1为终止密码TAG结尾的22个碱基。Tm=66.8，（G+C）%=45.2%。实际上，设计引物时应根据实际情况而定，尽量满足引物设计原则，但与理想情况会有偏差。

（2）.目的基因的克隆PCR扩增目的基因，根据Tm （Tm=66.8）值和ORF（800bp 左右）的长度决定退火温度和延伸时间。

（3）.酶切目的基因和载体连接利用相同的限制性内切酶酶切克隆的目的基因和PBI121（BamHI和XbaI），以除去保护碱基和切出相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下连接载体和目的片段。

（4）.连接产物转化感受态细胞16℃连接过夜后，42℃热激90秒，转化到0.1MCaCl2制作的DH5a大肠杆菌感受态中，在加有Kan的固体LB培养基上筛选阳性单菌落.

（5）.阳性克隆的筛选和检测可以接种摇菌后用菌液PCR检测或碱裂解法提取质粒后PCR检测若能扩增出ORF大小的片段后；再用相同的限制性内切酶（BamHI和XbaI）酶切质粒若能切出ORF大小的片段，则载体构建成功！