甘油冷冻保藏法
严格厌氧菌菌种保藏方法
严格厌氧菌菌种保藏方法以下为本实验严格厌氧细菌的保藏方法，如果是兼性厌氧菌可参照好氧菌保藏方法保藏。
一、厌氧细菌的甘油保藏方法：1、厌氧甘油的制备：厌氧瓶或厌氧管中放置一定量的甘油，甘油的量根据需要加入，不要多加，因为厌氧甘油制备好以后不能反复灭菌，反复灭菌甘油会变性而呈黄色，且有一股芳香味道。
加入终浓度为0.04%的L-cysteine和1%的5%的N2S母液。
往厌氧瓶中通N2，通气时间和配制培养基时时间相同。
盖上塞子和盖子。
121℃，20min灭菌后备用。
2、取新鲜菌液（对数期），在通N2的情况下，用针筒和针头往有菌液的厌氧管中加入终浓度为15-20 %的厌氧甘油，再通一会N2，目的是赶走在转移甘油过程中带进去的O2。
盖上塞子和盖子，混匀，冻于-80℃。
3、活化：用针头和针头吸取一定甘油保藏的菌液，加到培养基当中，加的量一般要多于1%，因为厌氧菌的生物量比较小，一般2到5%左右。
目测加完甘油菌液的培养基是否浑浊，并作记录。
如果加入的菌液太多，造成一开始培养基就比较浑浊，会干扰我们对菌是否生长的判断，而且甘油太多也会抑制菌的生长。
二、厌氧细菌的冷冻干燥保藏方法：1、厌氧牛奶的制备：先配置10% Difco Skim Milk（BD）的母液。
和厌氧甘油配制方法一样，转移到厌氧瓶中，加入加入终浓度为0.04%的L-cysteine和1%的5%的N2S母液。
通N2，盖上塞子和盖子。
113℃，15min灭菌后放置过夜，于4℃放置备用。
放置过夜后牛奶不结块，溶液均匀，不沉淀才可以用，否则牛奶变性，需要重新配制。
同样，厌氧牛奶只能灭菌一次，反复灭菌牛奶会变性。
2、准备冷冻干燥用的安瓿管，管口要用棉花封住，棉花缠在牙签上，这样拔出比较方便，灭菌并烘干后备用。
3、新鲜菌液离心，尽量除去上清，根据菌量加入10%的厌氧牛奶，一般大拇指盖大小的菌体能做15-20支安瓿管左右。
将菌体打散后，迅速分装到安瓿管中，每支安瓿管0.2ml，并用棉花封住管口，防止杂菌污染。
甘油保藏菌种的原理
甘油保藏菌种的原理
甘油保藏菌种是一种常用的方法，用于在低温下保存细菌菌种。
其原理基于甘油对细菌细胞具有保护作用的特性。
首先，甘油具有很强的渗透压调节能力。
当细菌在培养基中暴露在低温环境下时，温度的下降会导致细胞内水分结冰，形成冰晶，而冰晶的出现会导致细胞膜的破裂，从而对细胞造成损害甚至死亡。
而甘油在低温下具有降低水的结冰温度的作用，可以有效防止细胞内部的冰晶形成，从而保护细胞完整性。
其次，甘油还可以作为一种保护剂。
细菌在低温下容易受到氧化损伤，导致DNA、RNA和蛋白质的降解和损伤。
甘油可以
通过与细胞内部的分子相互作用，形成一种稳定的保护层，减少氧化应激对细胞的影响，防止DNA、RNA和蛋白质的降解
和损伤。
最后，甘油还可以提供能量和碳源。
在低温下，细菌的新陈代谢速度下降，细胞内能量储备减少。
甘油可以作为有机碳源和能量的供应者，为细菌提供所需的能量和营养物质，维持菌种的活力和存活。
因此，甘油保藏菌种的原理是通过甘油的渗透压调节、保护作用以及提供能量和碳源的功能，来保护细菌在低温环境下的完整性和存活能力。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
保藏菌种的方法
保藏菌种的方法
在微生物研究中，保藏菌种是非常重要的一环。
保藏菌种可以保证菌种的纯度和活力，并且方便长期保存和传递。
以下是一些常见的保藏菌种的方法：
1. 冷冻保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用生理盐水或甘油溶液混合菌体，制成菌悬液，然后用干燥冰或液氮冷冻保存。
2. 真空干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后在真空条件下干燥保存。
3. 常温干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌纸片或无菌土壤将菌体均匀涂抹在上面，然后在阴凉通风处晾干保存。
4. 液氮保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后用液氮冷冻保存。
在保藏菌种过程中，需要注意以下几点：
1. 保证菌株的纯度和活力，避免杂菌和死菌的混入。
2. 在保存菌种前，要对菌株进行鉴定和存档。
3. 在保存过程中，要保证温度、湿度、氧气和光照等环境条件
的稳定和适宜。
4. 定期检查保存的菌种，确保其纯度和活力。
综上所述，保藏菌种是微生物研究中不可或缺的一环。
通过选择合适的保藏方法和严格的管理，可以确保菌种的纯度和活力，方便长期保存和传递。
甘油冷冻保藏法以及一些注意事项
甘油冷冻保藏法以及一些注意事项
本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。
（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。
（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。
（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL（LB）的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。
（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。
（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。
实验需要预准备的材料：
平皿培养基50％甘油母液，1.5刻度离心管（保存菌种用，最好买进口的，质量较好）注意事项：
（1）50％甘油母液要多灭几次，因为甘油对细菌有很好的保护作用，所以灭菌除杂时也就相对难一点，多灭几次可解决。
（2）平皿要提前灭好培养基倒进去后要计算好过一周附近再涂平板，因为冷却不久的平板积水汽比较多，不利用涂布弄干。
放几天可减少水分，利于涂布，不过放太久平皿也会干掉的哦！
（3）最后的甘油浓度一般15～30％，太多不容易冻上，而且如有质粒也有可能丢（有质粒时甘油浓度尽量低一些），。
实验室最常用的五种菌种保藏方法
在现代生物学研究和生物技术应用中，菌种保藏是至关重要的环节。
恰当的菌种保藏方法能够确保菌种的活性、遗传稳定性和可用性，为科学研究的持续开展以及相关产业的发展提供坚实的基础。
本文将重点介绍实验室中最常用的五种菌种保藏方法，深入探讨它们各自的特点、适用范围以及操作要点。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻保藏法是目前最为广泛应用且效果较为可靠的菌种保藏方法之一。
其基本原理是将菌种置于超低温环境（通常为液氮温度，即-196℃）下，使菌种细胞处于极度冷冻的状态，从而抑制其代谢活动，达到长期保存的目的。
该方法具有诸多显著优点。
低温能够极大地减缓细胞的生理活动，几乎使其处于完全停滞状态，从而有效地延长菌种的存活时间。
低温冷冻保藏对菌种的遗传稳定性影响较小，经过长期保存后，菌种的特性通常能够较好地保持。
操作相对简单，只需将菌种制备成适宜的冷冻保存液，然后置于液氮罐中即可。
在具体操作时，首先要选择合适的冷冻保存液。
常用的冷冻保存液一般含有一定比例的保护剂，如甘油、二甲基亚砜等，它们能够降低细胞内冰晶的形成对细胞的损伤。
制备好冷冻保存液后，将菌种接种到冷冻保存液中，制成菌悬液。
将菌悬液分装到合适的冷冻管中，迅速放入液氮罐中进行保存。
在液氮罐中，要定期检查液氮的液位，确保菌种始终处于适宜的低温环境中。
低温冷冻保藏法适用于大多数微生物菌种的长期保存，尤其对于那些对温度敏感、容易变异的菌种，如细菌中的一些致病菌、真菌中的丝状真菌等，具有良好的保藏效果。
然而，该方法也存在一些不足之处，例如液氮的成本较高，液氮罐的储存空间有限，以及在取出菌种进行复苏时可能存在一定的风险等。
二、干燥保藏法干燥保藏法是利用菌种在干燥环境下代谢活动受到抑制的原理来实现保藏的方法。
常见的干燥保藏法包括沙土管保藏法、滤纸保藏法等。
沙土管保藏法是将菌种接种到无菌的沙土中，然后将沙土管置于干燥器中进行干燥保存。
该方法具有操作简便、成本低廉的特点。
在干燥过程中，菌种细胞内的水分逐渐散失，代谢活动减缓，从而达到保藏的目的。
菌种保藏方法
一、石蜡油低温保藏法本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。
保藏温度要求在-4～4℃下。
液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。
具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为宜。
二、甘油管冷冻保藏法1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。
其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。
将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。
取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。
-20℃保存时间较短。
或采用体积比为8：2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。
2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。
甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。
三、真空冷冻干燥法1．试验原理真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。
冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。
为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
菌种甘油管保藏操作方法
菌种甘油管保藏操作方法
菌种甘油管是用于保存微生物菌种的一种常用方法。
以下是菌种甘油管保藏操作方法的步骤：
1. 准备好所需材料，包括菌种甘油管、保存微生物菌种的培养基、无菌赛瓶、无菌一次性注射器、无菌棉签等。
2. 在无菌条件下，准备培养基。
一般使用甘油-酵母提取液培养基，将其加热至溶解。
3. 取一小块接种棒蘸取菌液，接种到培养基上。
轻轻转动培养基使其均匀分布。
4. 将培养基和菌液充分混合后，用一次性注射器吸取混合液。
5. 打开一个菌种甘油管，将混合液缓慢注入管内。
注入过程中要确保无气泡形成。
6. 将注满混合液的菌种甘油管放入赛瓶中，倒入约1 cm深的无菌水。
7. 用无菌棉签擦拭赛瓶外壁湿润的部分，使其与周围环境隔离。
8. 将赛瓶盖盖严，放入冰箱中保存。
9. 定期检查保存的菌种甘油管，如果有菌落生长，可以取出菌种进行进一步培养。
注意事项：
- 操作时要保持无菌条件，避免污染。
- 注入混合液时要缓慢，避免气泡形成。
- 冰箱中的温度应保持在-20左右，避免冷冻过度。
- 定期检查保存的菌种甘油管，如发现有菌落生长异常，应及时更换。
两种菌种保藏方法的比较
临时保藏法 适应对象 适用于频繁使用的菌种 将菌种接种到固体斜 面培养基上，在适宜的温 度下培养。当菌落长成以 后，将试管置于4℃的冰箱 中保藏。 保存时间不长，菌种容易 被污染或产生变异 甘油冷冻管藏法 适用于需要长期保存的菌 种
方法
在3mL的甘油瓶中，装 入1mL甘油后灭菌。将1mL 培养的菌液转移到甘油瓶 中，与甘油充分混匀后， 放在-20℃的冷冻箱中保藏。缺点来自操作相对复杂，要求严格
相同点
菌种放在低温环境中保藏的目的是降低新陈代谢速率， 延缓菌种衰老。
严格厌氧菌菌种保藏方法
严格厌氧菌菌种保藏方法以下为本实验严格厌氧细菌的保藏方法，如果是兼性厌氧菌可参照好氧菌保藏方法保藏。
一、厌氧细菌的甘油保藏方法：1、厌氧甘油的制备：厌氧瓶或厌氧管中放置一定量的甘油，甘油的量根据需要加入，不要多加，因为厌氧甘油制备好以后不能反复灭菌，反复灭菌甘油会变性而呈黄色，且有一股芳香味道。
加入终浓度为0.04 %的L-cysteine和 1 %的5 %的N2S母液。
往厌氧瓶中通N2，通气时间和配制培养基时时间相同。
盖上塞子和盖子。
121 ℃，20 min 灭菌后备用。
2、取新鲜菌液（对数期），在通N2的情况下，用针筒和针头往有菌液的厌氧管中加入终浓度为15-20 %的厌氧甘油，再通一会N2，目的是赶走在转移甘油过程中带进去的O2。
盖上塞子和盖子，混匀，冻于-80℃。
3、活化：用针头和针头吸取一定甘油保藏的菌液，加到培养基当中，加的量一般要多于1 %，因为厌氧菌的生物量比较小，一般2到5 %左右。
目测加完甘油菌液的培养基是否浑浊，并作记录。
如果加入的菌液太多，造成一开始培养基就比较浑浊，会干扰我们对菌是否生长的判断，而且甘油太多也会抑制菌的生长。
二、厌氧细菌的冷冻干燥保藏方法：1、厌氧牛奶的制备：先配置10 % Difco Skim Milk（BD）的母液。
和厌氧甘油配制方法一样，转移到厌氧瓶中，加入加入终浓度为0.04 %的L-cysteine和 1 %的5 %的N2S母液。
通N2，盖上塞子和盖子。
113℃，15 min 灭菌后放置过夜，于4℃放置备用。
放置过夜后牛奶不结块，溶液均匀，不沉淀才可以用，否则牛奶变性，需要重新配制。
同样，厌氧牛奶只能灭菌一次，反复灭菌牛奶会变性。
2、准备冷冻干燥用的安瓿管，管口要用棉花封住，棉花缠在牙签上，这样拔出比较方便，灭菌并烘干后备用。
3、新鲜菌液离心，尽量除去上清，根据菌量加入10 % 的厌氧牛奶，一般大拇指盖大小的菌体能做15-20支安瓿管左右。
将菌体打散后，迅速分装到安瓿管中，每支安瓿管0.2 ml，并用棉花封住管口，防止杂菌污染。
微生物的保藏原理
微生物的保藏原理微生物的保藏原理：微生物保藏是指将微生物保存在适当的环境下，以保持其活力和遗传特性的一种方法。
微生物保藏的目的是为了长期保存有用的微生物资源，以供科学研究、工业应用和教学实验等方面的需要。
一、低温冷冻保藏：低温冷冻保藏是常用的微生物保藏方法之一。
它的原理是通过将微生物培养物暂停在低温环境中，减缓其新陈代谢并有效抑制微生物的繁殖。
常见的低温保藏方法有甘油冻存和液氮冻存。
甘油冻存是将微生物培养物加入含有甘油溶液的冻存管中，然后经过特定的冷冻程序，将培养物保存在低温下。
液氮冻存是将微生物培养物直接置于液氮中进行保藏。
这些低温冷冻方法可以长期保存微生物，并保持其原有的功能和特性。
二、真菌与酵母菌的干燥保藏：真菌和酵母菌常常通过干燥来进行保藏。
干燥保藏的原理是利用干燥条件下的低水分环境，抑制微生物的生长和代谢活动。
首先，将微生物培养物涂布在导电性载体上，然后置于无菌环境中进行干燥。
常见的干燥方法有热浸法和真空浸法。
热浸法是将微生物培养物置于高温环境中，利用蒸发的方式将水分去除。
真空浸法是将微生物培养物放置在真空环境中，通过降低压力使水分蒸发。
这些干燥方法可以在长时间内保存微生物，并保持其遗传特性和功能。
三、冷冻干燥保藏：冷冻干燥保藏是将微生物在冷冻状态下进行干燥，以提高微生物的保藏效果。
冷冻干燥的原理是先将微生物培养物冷冻，然后将其放置在真空环境中，通过升华的方式将水分去除。
这种方法可以在同时保持微生物活性的同时，减少微生物在干燥过程中受到的损伤。
冷冻干燥保藏方法适用于对微生物活性和遗传特性要求较高的保藏。
总结起来，微生物的保藏原理主要包括低温冷冻保藏、真菌与酵母菌的干燥保藏以及冷冻干燥保藏。
这些方法都能够有效地延长微生物的保存时间，并保持其活力和遗传特性，在科学研究和实际应用中起到重要的作用。
菌种甘油保藏方法
菌种甘油保藏方法
菌种甘油保藏方法是将菌种进行冻存，用甘油作为保护剂。
具体步骤如下：
1.选取优良的菌株，进行预处理，将其生长到最佳状态。
2.将菌株分装到无菌冰盒中，添加等量的甘油，并彻底混合。
3.快速冷冻菌种冰盒，放入-80冰箱冻存。
4.定期检查冻存菌株的完整性和活性。
5.需要用菌种时，从冰箱取出冰盒，在无菌条件下迅速解冻，将菌株接种在合适培养基上。
注意事项：
1.菌种的密度要合适，冻存密度过高会影响菌株的生存率，过低会使冻存时间延长。
2.菌种的保存期限一般为半年至一年，应定期检查菌株的完整性和活性，如有损坏或无法生长，应及时更换菌株。
甘油保存菌种的方法,保存菌种的温度
甘油保存菌种的方法，保存菌种的温度1、方法：准备好镊子、EP管、枪头等工具，并进行杀菌处理；手和镊子用酒精擦拭消毒，用镊子取出约10支的EP管放到试剂盒里；找到移液枪，取出50%的甘油（等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸）放到EP管里面，再取出菌种放到EP管里面；最后把所有的菌种都装入到一个大袋子里盖好盖子标注好保存起来，放入-20°C 的冰箱里保存。
2、温度要求：长期保存，建议在-70°C下冻存；短期保存，可在-20°C保存。
一、甘油保存菌种的方法1、原料/工具甘油、镊子、EP管、移液枪。
2、方法/步骤（1）准备工具并杀菌：准备好镊子、EP管、枪头等工具，把这些工具放到高压灭菌的锅里进行杀菌。
（2）把EP管放入试剂盒：用酒精将手和镊子擦拭消毒，用镊子取出约10支的EP管放到试剂盒里。
（3）把甘油和菌种放入EP管：找到移液枪，取出50%的甘油（甘油稀释至50%浓度的方法：等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸）放到EP管里面，再取出菌种放到EP管里面。
（4）保存并放入冰箱：把所有的菌种都装入到一个大袋子里盖好盖子标注好保存起来，放在-20°C的冰箱里保藏。
二、甘油保存菌种的温度1、甘油保存菌种，若是长期保存，建议在-70°C下冻存，保藏时间一般为2-4年左右；在-20°C保存时间较短，通常只有1年左右。
目前实验室大都采用-80°C（-70°C）冰箱保藏。
2、甘油冷冻保藏菌种是目前实验室应用最为广泛的一种的菌种保藏方法，原理是以甘油为保护剂，低温冷冻条件下，使微生物的新陈代谢趋于停止，从而达到长期有效的保藏。
一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。
这种方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。
菌种保存大家谈。甘油的浓度。
菌种保存大家谈。
甘油的浓度。
2009-08-15 01:13大家好！我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。
因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项?甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
不适合酷友频繁的求助菌种。
我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。
就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。
微生物菌种保藏流程
微生物菌种保藏流程一、准备工作。
咱得先找个合适的保藏容器呀。
这就像给小微生物们找个舒服的小窝。
一般来说，像小安培瓶、试管这些就很不错。
而且容器一定要干净、干燥，要是脏兮兮的，微生物们肯定不乐意住啦。
然后呢，还得准备保藏的培养基。
这培养基就像是微生物的美食，不同的微生物喜欢的美食可不一样呢。
得根据咱们要保藏的微生物种类来调配合适的培养基，可不能乱喂呀。
二、菌种的选择。
这一步也很关键哦。
要选择生长状态良好的微生物菌种。
就好比咱们挑宠物的时候，肯定要挑那种活蹦乱跳、健康的呀。
那些长得歪瓜裂枣、病恹恹的微生物可不行。
怎么看生长状态好呢？要是在培养基上长得密密麻麻、活力四射的，那基本就没错啦。
三、保藏方法。
（一）斜面低温保藏法。
这个方法可简单又常用啦。
把选好的菌种接种到斜面培养基上，让它们在合适的温度下生长一段时间，等长得差不多了，就放到冰箱的冷藏室里。
不过要注意哦，温度不能太低，一般4摄氏度左右就很合适啦。
这就像是给微生物们放了个小冰屋，让它们在里面舒舒服服地待着。
但是呢，这种方法也有个小缺点，就是保藏的时间不能太长，隔一段时间就得重新接种一次，就像定期给宠物换个新窝一样。
（二）甘油冷冻保藏法。
这个方法能让微生物们保存得更久一点。
先把菌种放到含有一定比例甘油的溶液里，甘油就像是给微生物们穿上了一层保暖衣。
然后把混合好的溶液放到超低温冰箱里，温度可能要达到零下80摄氏度呢。
这么冷的地方，微生物们却能安安稳稳地待着。
不过从这么冷的地方拿出来的时候也要小心哦，要慢慢地让它们适应常温，就像我们从寒冷的室外突然进到温暖的室内要适应一下一样。
（三）真空冷冻干燥保藏法。
这个方法听起来就很高级呢。
先把微生物菌种在低温下快速冻结，然后在真空环境下让水分升华。
这就好比把微生物们变成了一个个小干尸，但其实它们还活着哦。
这种方法保藏的时间超级长，而且对微生物的活性影响比较小。
不过设备要求比较高，操作起来也有点复杂，就像做一道超级难的菜一样，得小心翼翼的。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
2、传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。
菌种保藏操作规程
菌种保藏操作规程目的：规范微生物学标准菌种和野生菌种的保藏。
职责：微生物检验员负责菌种的保藏、确认、传代、使用等。
范围：本规程适用于标准菌种的管理和实验过程中分离纯化的野生菌种。
编制依据：1.实验室生物安全通用要求(GB19489-2008)2.实验室质量控制规范食品微生物检测(GB/T 27405-2008)；3.中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的菌种保藏方法；4.《微生物学实验(第四版)》沈萍、陈向东主编，高等教育出版社；5.《食品微生物实验技术》，牛天贵主编，中国农业大学出版社；本中心主要采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对各类型标准菌种或野生菌种进行保藏，其详细操作如下：1斜面定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6C进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1.1试剂、培养基种类a.营养肉汤或BHI培养基适用于所有细菌(除真菌外)的增菌；b.营养琼脂平板适用大肠杆菌，枯草芽抱杆菌，金黄色葡萄球菌等的培养；c.沙氏葡萄糖液体培养基适用于酵母、霉菌的增菌。
沙氏葡萄糖琼脂培养基适用于酵母、霉菌的培养。
1.2试剂、培养基制备a.按照说明书要求溶解培养基并调pH值。
b.将配好的培养基趁热分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一（4-5mL）,穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
c.将试管加硅胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。
根据要求将培养基灭菌，高压蒸汽灭菌121C, 15-20min0d.斜面摆放：灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
e.无菌检查：将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30C培养1-3天。
无菌检查合格后将其保存于4C下备用。
1.3接种a.点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。
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甘油冷冻保藏法本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。
（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。
（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。
（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。
（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。
（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。
冷冻干燥保藏法（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6-7.5mm，长105mm，球部直径9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。
也可用没有球部的管状安瓿管。
塞好棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，备用。
（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。
细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。
一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7-10天。
（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。
（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。
将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。
（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。
装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。
抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6-8小时即可。
（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。
于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。
封口以后，保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。
适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。
滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。
（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。
（3）取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。
（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。
（6）将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于低温下。
（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。
此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。
滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。
（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。
（3）取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。
（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。
（6）将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于低温下。
（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。
此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。
沙土保藏法（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。
（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。
（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。
（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。
（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。
（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm 的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。
（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。
（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。
（9）于每支沙土管中加入约0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。
（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。
（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。
（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。
每半年检查一次活力和杂菌情况。
（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。
此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，但应用于营养细胞效果不佳。
斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。
酵母菌两个月，移种一次。
细菌最好每月移种一次。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。
缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液体的。
（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌15分钟。
（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。
浸入水中检查有无漏洞。
（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。
若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。
液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。
（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。
再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。
缺点是需要特殊设备。
液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。
（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。
（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。
（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
此法实用而效果好。
霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。
此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。
缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。
从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。