质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题

1．实验目的：

（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；

（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；

2．实验材料及用品

（1）实验仪器（apparatus）：

恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）

3）、材料与试剂（Reagents）：

①溶液I（Solution Ⅰ）：

50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合

0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀

60mL 5mol/L KAc，

11.5mL 冰醋酸，

28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）

④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）

⑤70% 乙醇；

⑥平衡酚：氯仿1：1：

将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

⑦LB培养基：

胰化蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl 15g

pH 7.0

⑧琼脂糖（Agarose）；

⑨1 liter（升）5×TBE备用溶液（stock solution）：

54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0；

⑩6×凝胶加样缓冲液：

0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue），40% 蔗糖（sucrose in water）；

另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview试剂

（2）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。

3．实验原理：

1）质粒DNA的提取：

（1）关于质粒：

质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA 分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。

（2）一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：

①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；

②收集和裂解细菌；

③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。

（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。

2）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：

（1）关于电泳技术：

电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp 大小的DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。（2）琼脂糖凝胶电泳条带的观察：

通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳