有关物质检查常见问题的探讨

•
- ICH对杂质的定义
杂质按活性分类 杂质
活性杂质
无活性杂质
（无毒无效）
毒性杂质 （有毒无效） （毒大效低）
有效杂质 （有效无毒） （高效低毒）
杂质按来源分类
杂质
有关物质
（related substances）
无关杂质
外源物质
杂质来源
1
有关物质
－起始原料 －中间体、副产物
异构体和聚合物 多晶型 －降解产物 异构体和聚合物 多晶型
其他方法
比色比浊
原子吸收
重量法
有有关关物物质质检检查查的的其其他他方方法法
• 物理常数测定法
•
旋光度- 检查具有光学活性的杂质
• 紫外分光光度法
•
杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质
• 容量滴定法
•
游离脂肪酸、过氧化物、还原糖
• 重量法
•
酸中不溶物、水中可溶物
• 比色比浊法
•
游离淀粉、碘化物、铁盐等；氯化物、硫酸盐
HPLC方法的建立与验证
• 高效液相色谱法系用高压输液泵将规定的流动相泵 入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内被分
离并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据 处理系统记录色谱信号。
检测器的种类
色谱柱
溶液浓度
HPLC方法的建立
检测波长
系统适应性 试验方法
有关物质检查常见问题 的探讨
杂质质控理念的变迁
纯度控制
杂质控制
杂质谱 控制
第一次飞跃 第二次飞跃
杂质（Impurity）的定义与分类
• 任何影响药品纯度的物质均称为杂质。
பைடு நூலகம்• -《中国药典》2010年版附录对药品杂质的定义
• 原料药中：化学结构和该药品不一样的任何物质
• 制剂中： 除原料药和辅料外的任何其他成分
其他参考资料
《化学药物杂质研究的技术指导原则 》 《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 》
有关物质检查的常用方法
TLC
HPLC
其他方法
主要用于没 有紫外吸收
的杂质
（定性＋半定量）
适用多种 杂质
（定性＋定量）
适用不同的 特定杂质
（定性＋定量）
有关物质检查的其他方法
物理常数
紫外
容量滴定
在质量标准中 规定检查并有 自己限度标准 的杂质。已鉴 定或未鉴定
理论推测在 生产或贮藏 过程中可能 产生的杂质 实际产品中 不一定存在
存在于药 品中的所 有杂质组 成或模式
▪ 新杂质的研究
▪
－药物杂质的可能来源
阿奇霉素中可能存在的杂质：37种
1.原料：红霉素 A、红霉素 B、红霉素 C、红霉素D、红霉素 E、红霉素 F、 阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F 2.中间体：红霉素A肟（Z）、6，9-亚胺醚、氮红霉素A、红霉素A肟（E）、红 霉素 C肟（E）、9，11-亚胺醚、红霉素C 6，9-亚胺醚、红霉素A内酰胺 3.副产物：红霉素-N-氧化物、N-去甲基红霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、 氨基阿奇霉素A、N-甲酰基-N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇 霉素、阿奇霉素N-氧化物、3’-去（二甲氨基）- 3’,4’-去氢阿奇霉素、 O-甲苯 磺酰基红霉素肟、红霉素Z肟重排物、氮红霉素11，12-硼酸酯、 N，N-去 二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3’-N， N-去二甲基氨基-酮 基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯
溶液的配制
• 需要注意的几点：
• - 需否避光？ • - 可否超声、加热、多久？过滤？滤材
？ - 浓度与线性范围和检测限是否匹配？
• 弃20ml初滤液？用xx膜过滤？ • 用聚四氟酰胺小瓶？ • 机械振摇xx分钟等等？
二、H进PL样C方体法积的的建确立定与验证
• - 常用10μl～100μl • -过低误差大，影响重现性 • -太多过载，影响峰形与分离
2
无关杂质
－试剂 配位体、无机 盐、溶剂
－重金属催化剂 －过滤介质、活
性炭
3
外源物质
－微生物 －污染异物 －非法添加
物
已鉴定杂质
Identified Impurity
特定杂质
Specified Impurity
潜在杂质 Potential Impurity
杂质谱
Impurity Profile
已确证了 结构特征 的杂质
特定杂质峰定位的方法
相对保留时间+参考图
临时降解
混合对照品
杂质对照品
峰定位
www.themegallery.com
Company Logo
方法的验证
• 验证
• - 准确度 • -精密度
•
重复性
•
中间精密度
• -专属性
• - 检测限
• - 定量限
- 线性范围
-耐用性
定量
+ + +
（+ ）
+
（+ ）
• 有效杂质宽管：
• -不能不管（三磷酸腺苷二钠、头孢拉定 ） -不超越前期标准 -以投入产出比等利弊平衡为科学依据
原方法
在对已有方法比较的基础 上确定最佳分析方法新方法
分析方法的有效性（氨苄西林钠/舒巴坦钠）
中国抗生素杂志，2009，34：734
典型的HPLC方法测定有关物质
有关物质 照高效液相色谱法（附录Ⅴ D）测定。
• 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂；以磷酸盐缓冲液（pH6.3）［取磷酸二氢钾 9.07g，加水1000ml使溶解，用无水磷酸氢二钠溶液（ 9.46g→1000ml）调节pH值至6.3，临用前稀释10倍］乙腈-甲醇（36：11：3）为流动相，流速每分钟1.5ml； 检测波长为200nm；柱温40℃。分别取前列地尔对照品 溶液、前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品溶液各适量 ，按（1：1：1）比例混合，摇匀，作为系统适用性试验 用溶液。取该溶液25μl注入液相色谱仪，调节色谱系统， 使前列地尔峰的保留时间约为11～13分钟，前列腺素A1 峰与前列腺素B1峰的分离度应符合要求；同时调节检测灵 敏度，使前列腺素B1峰的高度约为满量程的10%。
•
• 测定法 精密称取本品适量，用乙腈-水（9：1）溶解并定量稀 释制成每1ml中约含1mg的溶液作为供试品溶液；精密量取含 量测定项下的对照品溶液适量，用乙腈-水（9：1）稀释制成 每1ml中约含10μg的溶液，作为前列地尔对照品溶液；另精密 称取前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品各适量，用乙腈-水 （9：1）分别溶解并定量稀释制成每1ml中约含15μg和5μg 的溶液作为前列腺素A1和前列腺素B1的杂质对照品溶液。精 密量取供试品溶液、前列腺素A1、前列腺素B1杂质对照品溶 液和前列地尔对照品溶液各25μl,分别注入液相色谱仪，记录供 试品溶液的色谱图至主成分峰保留时间的4倍。前列腺素A1和 前列腺素B1均按外标法计算，分别不得过1.5%和0.5%；其他 杂质按主成分自身对照法计算，单个最大杂质的峰面积不得过 前列地尔对照品溶液的主峰面积（1.0%）；杂质总量不得过 2.0%（小于0.01%的色谱峰不计）。
+
+ +
限度
+ + +
杂质含量的计算
对照品
外标法
主成分自 身对照法
加校正因 子的自身 对照法
面积归 一化法
www.themegallery.com
Company Logo
对照品外标法
优点
缺点
定量 准确
定位 方便
50%
费用 高
70%
要求 严
有条件时首选的方法
主成分自身对照法
优点
缺点
费用 低
不需 定位
HPLC方法的建立与验证
• 溶剂的选择：溶液稳定性考察
• - 溶解度高且稳定 • ＞8小时不需提示 • ＜4小时提示临用现配或立即进样 • ＜2小时改换溶剂
- 无背景干扰或小 溶剂峰、倒峰
- 低毒价廉
检测波长的选择
•
检测波长的选择
主波长、低波长、杂质波长、权衡波长 •
检测波长的选择
• 检出杂质的数与量 • 干扰因素 • 操作的便捷性
- 结构性质相近且 不干扰测定的物质
二、HP分LC离方度法的的要建求立与验证
• -准确定量分析时通常两峰间R≥1.5 • -峰高峰谷比
拖尾因子（T）的要求与应用
• 为保证分离效果和测量精度用于评价色谱峰对称性
• 的指标
T=W0.05h/2d1
• 式中W0.05h 为5％峰高处的峰宽； • d1 为5％峰高出峰顶点至峰前沿 • 之间的距离 • 除另有规定外，峰高法定量时 • T 应在0.95～1.05 之间。 • 峰面积法测定时，若拖尾严重，将 • 影响峰面积的准确测量。峰前峰后有 • 紧邻杂质峰时，对拖尾因子作出规定。
（控制在主成分降低10%~20%为宜 ） - 中和方法 - 目的不明确，结论不正确
二、HPL柱C方温法的的确建定立与验证
• - 不规定柱温 • （不需加温且对温度不敏感）
- 25℃或30 ℃ （不需加温但对温度敏感，需保持恒温 ） - 35 ℃～70 ℃ • （需加温且对温度敏感，需保持恒温） • 作为耐用性试验之一 • 且可与溶液稳定性同时进行
有有关关物物质质检检查查的的其其他他方方法法
• 原子吸收分光光度法： 检查金属杂质
• 毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑
•
肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两个特定杂质
• 气相色谱法：检查挥发性杂质
• 热分析法：检查不同晶型的杂质
• 拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射
• 生物检定法、酶联免疫试剂盒（抗生素残留量）
- 配合溶液浓度保证检测灵敏度
色谱系统的适用性试验
• - 指标的应用 • -分离度的保证 • -灵敏度的测试
- 精密度的要求
系统适用性试验要求
重复性
理论板数
常用指标
分离度
保留时间
www.themegallery.com
拖尾因子
Company Logo
分离度指标性物质的选择
• - 难分离物质对 • - 最常出现的杂质 • - 单独规定限度的特定杂质
重复性（RSD）的要求
• 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。 采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连 续进样5 次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对 标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制 相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规 定量的内标溶液，配成3 种不同浓度的溶液，分别至 少进样2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应 不大于2.0% •在质量标准中如果没有明确规定，就是≤2.0%
50%
定量 粗
70%
没条件时首选的方法
加校正因子的主成分自身对照法
优点
缺点
定量较 准确
定位 方便
50%
定位难
需测定 因子
70%
杂质与主成分响应因子差异大（超过0.9~1.1 ） 且对照品昂贵时选用的方法
面积归一化法
缺点
优点
费用 低
不需 定位
50%
定量粗 影响多 重复性差
70%
不提倡使用的方法
• 后改为0.02mol/L正辛胺溶液-乙腈（73 ：27），用磷酸调节pH值为6.5，仅由2 种成分组成
分离能力的考察
-粗产品溶液或配制各种杂质混合物
（起始原料，中间体，副产物） - 强制降解 • （酸、碱、光、热、氧化）
二、H分PL离C方能法力的的建考立察与验证
• 强制降解的考察方法误区：
• （酸、碱、光、热、氧化） - 破坏条件过于强烈
4.降解产物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮红霉素、红霉素8， 9-脱水-6，9-半缩酮、红霉素6，9：9，12-螺缩酮
2010年版 药典中的杂质分析
附录 ⅩⅨ F 药品杂质分析指导原则 附录 ⅩⅨ A 药品质量标准分析方法验证
指导原则
ICH中的杂质分析
Q3A－新原料药中的杂质 Q3B－新制剂中的杂质
• 最好专用！
• 因色谱柱填料性质已与原来有所不同 • 在该柱上所摸索的色谱条件，可能在其它同类柱子上
得不到重现！ •
流动相的选择
• -分离能力强
• （各种有关物质基本分离）
• -温和稳定
• （pH、比例适中对柱伤害小，性质稳定）
• -配制简单、易得价廉 • -无毒环保
流动相的选择
• 头孢曲松钠的流动相原来0.8%四庚基溴 化铵乙腈溶液-水-磷酸盐缓冲液-枸橼酸 缓冲液（500：440：55：5），由4种成 分组成，需配制3种缓冲液；
特定杂质
非特定杂质
毒性杂质严控 有效杂质宽管
杂质限度的规定
根据生产现状
单个不得过 0.10%
www.themegallery.com
Company Logo
杂质限度的规定
• 毒性杂质严控：
• -遵守公认标准 -不超越前期标准 -以相关安全实验数据为科学依据 -以保证临床安全为根本目的
杂质限度的规定
色谱柱的选择
• 反相色谱系统使用非极性填充剂
• C18、 C8；氰基柱、氨基柱
• 正相色谱系统使用极性填充剂
• 硅胶柱
•
离子交换填充剂；
•
凝胶或高分子多孔微球
；
•
手性键合填充剂
色谱柱的选择-常见问题
• 色谱柱与流动相性质不匹配
• 100%的水或Buffer最好选水相柱（AQ柱 ）
• 普通C18柱流动相中用到离子对试剂，用后应好好冲