Lowry法蛋白浓度测定试剂盒使用说明

Lowry氏法测定蛋白质含量

蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易
使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应）
操作步骤
1.取三支试管分两组，按下表操作
试管编号
01
2
牛血清白蛋白标准
-- 1.0 --
分光光度计使用前需预热，绝对调零和空白管调 --
--
待测蛋白质溶液(mL)
-- --
1.0
2. 各管加入试剂甲5ml混匀放置10分钟。 3.各管加入试剂乙0.5ml后立即混匀，37℃ 水浴30分钟后用500nm单色光比色测定。 4.计算样品蛋白质含量（ug/ml）
结果与计算：
根据测定管光密度值计算血清蛋白质含量，C测=A测*C标/C测
注意事项：
各管加酚试剂时必须快速，并立即摇匀，不应出现
混浊。
移液管使用前要看清楚刻度和是否写着快、吹，如
有则需要用洗耳球吹出剩余液体
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因
为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
Lowry氏法测定蛋白质含量
The Lowry Method for Protein Quantitation
目的与要求：
掌握Lowry氏法测定蛋白质含量的
原理及方法；
掌握分光光度法
实验原理：
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯
合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反应 Biuret Reaction）

Lowry’s法(Folin-酚试剂法)

然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(μg/ml)。
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！
Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method

Lowry法蛋白含量检测试剂盒

Lowry法蛋⽩含量检测试剂盒Lowry法蛋⽩含量检测试剂盒（1000T）-南京森贝伽⽣物提供⼀、试剂盒说明蛋⽩质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋⽩质⼀铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产⽣蓝⾊化合物，在⼀定条件下，利⽤蓝⾊深浅与蛋⽩质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋⽩质的浓度。

Lowry法测定较为不受脂类物质⼲扰，适于脂类含量较⾼的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。

本试剂盒可进⾏1000次1mL⽐⾊杯测定。

⼆、试剂盒组份组份1000T 储存蛋⽩质标准溶液（2.5mg/mL BSA）10mL -20℃5×Buffer A-1 100mL 室温5×Buffer A-2 100mL 室温Buffer B-1 10mL 室温Buffer B-2 10mL 室温Folin-酚试剂（1N）100mL 室温避光注意事项：①1×Buffer A⼯作液配制：⽤前将5×Buffer A-1、5×Buffer A-2（如储存温度较低，可能有结晶析出，可370C⽔浴加热溶解）⽤蒸馏⽔稀释5倍后等体积混合即得1×Buffer A⼯作液；②BufferB⼯作液配制：⽤前将Buffer B-1 与Buffer B-2等体积混合即得BufferB⼯作液；③碱性铜试剂⼯作液配制： 1× Buffer A⼯作液、BufferB⼯作液按50：1⽐例混合，即为碱性铜试剂⼯作液。

该⼯作液须在24hr内使⽤，过期失效。

④蛋⽩质标准⼯作液（0.25mg/mL）配制：蛋⽩质标准溶液（2.5mg/mL BSA）⽤前⽤蒸馏⽔稀释10倍⾄蛋⽩质标准⼯作液（0.25mg/mL）。

⑤还原物质、酚类物质对此反应有⼲扰。

⑥如染料吸附到⽐⾊杯上，可⽤甲醇清洗。

三、操作步骤1．标准曲线的绘制：取6个带盖的1.5 mL离⼼管，编好号后，按下表顺序加⼊试剂：管号0 1 2 3 4 50 40 80 120 160 200蛋⽩质标准⼯作液（0.25mg/ml）（µl）蒸馏⽔（µl）200 160 120 80 40 0碱性铜试剂⼯作液（µl）1000 1000 1000 1000 1000 1000每管加后⽴即混匀，置20～250C⽔浴保温10分钟1N Folin-酚试剂（µl）100 100 100 100 100 100蛋⽩质含量（µg/µl）0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25具体步骤：1. 如染料吸附到⽐⾊杯上，可⽤甲醇清洗。

改良Lowry氏法测定蛋白质含量

改良Lowry氏法测定蛋白质含量[原理]蛋白质分子中含有带酚基的酪氨酸，在碱性条件下其肽链与Cu2+ 螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物中酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝混合物）。

蓝色深浅与蛋白质含量成正比的关系可绘制标准曲线，测出样品中蛋白质的含量。

[试剂]1．蛋白质标准溶液（0.16mg/L）：取80g/L牛血清白蛋白作500倍稀释。

取已标定的牛血清白蛋白8mg，用0.9%NaCl稀释至50ml。

2．碱性铜溶液：甲液：取Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH100ml中。

乙液：取CuSO4·5H2O 0.5g溶于1%酒石酸钾100ml中。

取甲液50ml、乙液1ml混合，此液需临用前配制。

3．酚试剂：取Na2WO4·2H2O 100g和Na2MoO4·2H2O 25g溶于蒸馏水700ml中，再加85% H3PO4 50ml和浓HCl 100ml充分混匀后，置1500ml圆底烧瓶中温和地回流10小时。

冷却，取下冷凝装置，加入硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，蒸馏水50ml及溴水数滴。

再煮沸15分钟以除去多余的溴。

因溴气甚毒，这一步骤应在通风橱中进行。

冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液呈黄色或金黄色（如带绿色则不能用）。

贮于棕色试剂瓶中，临用前，取酚试剂5.0ml，加蒸馏水约50ml，以酚酞为指示剂，以1mol/L NaOH溶液进行滴定，求出酚试剂的当量浓度。

然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释成1mol/L。

4. 0.9% NaCl：[主要器材]1．50ml容量瓶2．721型分光光度计[操作步骤]1．取试管6支分别编号，按表12操作：表12试剂（ml）管号 0 1 2 3 4 测定管蛋白质标准溶液（0.16mg/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 —0.9%NaCl 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 —待测血清（1：1000） — — — — — 1.0 碱性铜溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀后，室温放置15分钟。

蛋白质检测(Lowry)--方法学验证

Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。

2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。

4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。

0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。

0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。

0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。

酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。

3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。

2010版药典lowry法测定蛋白含量的方法

第二法，Lowry法------摘自2010版药典本法用于微量蛋白质的含量测定。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质的含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

试剂（1）酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g,置1500ml 蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10 小时。

取下回流管，加入硫酸锂150g、水50 ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。

冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂储备液。

酚试剂储备液用氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）测定酸浓度，然后加水稀释至相当于1mol/L沿酸浓度。

（2）碱性铜溶液量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5ml，4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25ml，摇匀，即得。

本液临用配制。

（3）氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）的配制及标定去氢氧化钠适量，加水搅拌使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后，量取澄清的氢氧化钠饱和溶液28ml，加新煮沸后的冷却水，使成1000ml，摇匀。

取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新煮沸过的冷水50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。

每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。

根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。

标准蛋白溶液的制备用水将蛋白标准品定量稀释至每1ml含1mg，作为储备液。

精密量取储备液2.5ml置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为每1ml含100µg 的标准蛋白质溶液。

改良Lowry法蛋白定量试剂盒

仅供科研版本号：170322改良Lowry法蛋白定量试剂盒【产品组成】【保存条件】室温,避光,6个月【产品概述】目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是：BCA蛋白定量试剂盒(BCA ProteinAssay Kit)和Bradford 蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。

改良Lowry法蛋白定量试剂盒是利用蛋白中肽键与铜离子结合成四配位基铜离子复合物，后者与Folin试剂(福林酚)反应，产生蓝色比色物，用分光光度法(酶标仪或分光光度计)检测750nm处吸光度，并与标准曲线比较，求得待测蛋白样品的浓度，在1～1500μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。

【使用方法】1、取1ml蛋白标准配制液加入到蛋白标准(BSA)(20mg)中，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。

2、取适量20mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为1500μg/ml或所需浓度。

如取75μl20mg/ml蛋白标准，加入925μl稀释液，充分混匀，即配制1500μg/ml蛋白标准。

特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。

例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取20mg/ml蛋白标准溶解于蔗糖中。

一般也可以用0.9%NaCl或PBS作为溶解BSA稀释液。

稀释后的1500μg/ml蛋白标准也应-20℃长期保存。

3、根据样品数量，按Folin-CiocalteuReagent:ddH2O=1：1的比例配制Folin-Ciocalteu工作液，充分混匀。

4、根据样品数量，按试剂(B1):试剂(B2):试剂(B3)=50:1:1的比例配制改良Lowry Reagent工作液，充分混匀。

例如取10mlLowryA、0.2mlLowryB、0.2mlLowryC，配制成10.4ml改良Lowry Reagent工作液。

5、将1500μg/ml蛋白标准用稀释待测样品的溶液5倍梯度稀释，浓度分别为300μg/ml、60μg/ml、12μg/ml、2.4μg/ml、0μg/ml，各取40μl加到96孔板的标准品孔。

稳定型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒

稳定型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒说明书修订日期：2016.03.02 Cat Number：KGSK4051Store at2-8℃for6months，避光For Research Use Only（科研专用）一、产品简介在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物。

此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。

此法灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5-100µg/mL蛋白质。

经典的Lowry法的主要缺点是由Reagent A和B按照一定比例配置成的碱性铜试剂（Reagent C）不稳定,需要当天配制，经典的Lowry法产生的颜色稳定性也不高，在反应20-120min内变化9.2%。

本试剂盒采用一种改进的即用型稳定的碱性铜试剂代替经典Lowry法的Reagent A；B；C，使得实验操作更加的简单便捷，反应产生的蓝色复合物能够稳定存在至少2小时。

而且该稳定型碱性铜试剂在4度，避光的条件下可稳定保存至少6个月以上，实验制得的标准曲线与经典方法基本吻合。

用酶标板使用1000次或分光光度法100次。

二、产品特点1．即用型而且稳定的碱性铜试剂，使用更加方便。

2．有离心管法和酶标板法两种定量方法。

3．蛋白质浓度的线性范围在5-100µg/mL。

4．高的灵敏性保证了低蛋白质浓度样品的精确定量。

三、试剂组份本试剂盒由稳定型碱性铜试剂、Folin-酚试剂和BSA蛋白质标准液（1mg/mL）构成，可以用酶标板使用1000次或分光光度法100次。

组份名称规格保存温度稳定型碱性铜试剂100mL2-8℃，避光1N Folin-酚试剂10mL1mg/mL BSA蛋白标准品5mL-20℃注：BSA蛋白质标准液-20℃保存，其余试剂2-8℃避光保存，稳定型碱性铜试剂用铝薄包被，保质期半年。

四、使用方法1、制作BSA蛋白的浓度梯度1．1取8支1.5mL离心管，按照下表的比例分别加入各溶液。

高中生物 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

(一)试剂甲
(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液
(2)0.2N氢氧化钠溶液
(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)
(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。
(一)试剂乙：
(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。
取试管7支、编号、按下表操作：
立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。
操作注意事项：
1．按顺序添加试剂
2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。
[计算]
(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
[器材]
(一)721型分光光度计
(--)恒温水浴箱
(三)中试管7支
(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5Байду номын сангаасl一支；5.0ml一支。
[试剂]
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
[目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[原理]
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

(SOP-QC-003-03)_Lowry法检测蛋白质含量标准操作规程[1]

Lowry法检测蛋白质含量1.目的：保证产品蛋白质含量测定按规范进行和检定结果的准确可靠。

2.依据：2005年版中华人民共和国药典（三部）。

3.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

4.器皿与耗品：所有玻璃器皿为清洁级，37度烤干。

tube、tip：一次性使用，容量瓶，96孔酶标板，5.仪器设备：酶标仪：旋涡混匀器。

6.溶液的配置：6.1.4%碳酸钠溶液：称取4g碳酸钠, 加水90ml, 搅拌，使完全溶解，并定溶至100ml。

贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为一个星期。

6.2.0.2mol/L氢氧化钠溶液：称取0.8 g氢氧化钠, 加水90ml, 搅拌，使完全溶解，并定溶至100ml。

贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为一个星期。

6.3.0.04 mol/L硫酸铜溶液：称取1g硫酸铜(CuSO4 5H2O) (分析纯), 加水90ml, 搅拌，使完全溶解，并定溶至100ml。

贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为一个星期。

6.4.0.1mol/L酒石酸钾(或0.1mol/L酒石酸钠)：称取2g酒石酸钾(或酒石酸钠), 加水90ml,搅拌，使完全溶解，并定溶至100ml。

贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为一个星期。

6.5.碱性铜液：临用前取试剂6.1（Na2CO3）和6.2（NaOH）各5 ml，试剂6.3（硫酸铜）和6.4（酒石酸钾）各0.1 ml混匀配制而成，即用即配。

6.6.酚试剂：商品化：注意酚需要稀释到1mol/L6.7.标准品来源：人血清白蛋白标准品HSA(中检所).6.8.配制标准品标准程序：参照《蛋白国家标准品使用说明书》取人血清白蛋白（HSA）一支（21.24mg），先用超纯水溶解，定容到一洁净的25ml 容量瓶中，摇匀，取23.54ml，再用一洁净的干燥的25ml容量瓶定容，即为浓度为800ug/ml浓度的标准品。

用2ml tip管分装，250ul/支，冻干。

蛋白含量(Lowry法)测定标准操作规程

细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于细胞因子原液的检定。

目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。

原理：lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。

是由试剂A和试剂B二部分组成。

试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。

在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。

内容：1 材料1．1样品：经二人核对好批号后测定。

1．2试剂钨酸钠Na2WO4·2H2O 化学纯钼酸钠Na2M O O4·2H2O 分析纯磷酸H3PO4 分析纯浓盐酸HCl 分析纯硫酸锂Li2SO4 分析纯酒石酸钾钠C4H4O6KNa·4H2O 分析纯硫酸铜CuSO4 分析纯氢氧化钠NaOH 分析纯无水碳酸钠Na2CO3 分析纯溴水Br2 分析纯1．3标准品：由中国药品生物制品检定所提供。

1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1．5其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。

1．6仪器、设备紫外分光光度仪,UV-265扭力天平，TN100B冰箱，BOD-170A1．7器皿试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。

2 方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。

2．1．2调试仪器设备2．1．2．1紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

2．1．2．2扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

2．1．2．3冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。

蛋白质定量(LOWRY法)

蛋白质定量/蛋白质含量的测定(LOWRY法)实验原理Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。

因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

实验试剂Na2WO4•2H2O；Na2MoO4•2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4•H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4•5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。

实验设备试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。

实验材料可溶性蛋白质实验步骤1. 酚试剂的制备（1）取Na2WO4•2H2O 100g，Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。

安上回流冷却装置（使用磨口接头。

用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。

冷却后加入Li2SO4•H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。

冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。

使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。

滴定终点由蓝变灰。

蛋白测定方法之Folin—酚试剂法(Lowry法)

蛋白测定方法之Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。

过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。

以后在生物化学领域得到广泛的应用。

这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。

而且对后者的影响还要大得多。

酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。

若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。

通常测定范围是20~250mg。

Lowry法蛋白浓度测定试剂盒使用说明

Lowry法蛋白浓度测定试剂盒使用说明货号：pc0030规格：1000t(微孔)留存：bsa蛋白标准品4℃留存有效期至少3个月，-20℃留存有效期至少一年，其他试剂室温留存有效期至少一年。

试剂洛阳采用后恳请及时密封留存，folin酚乙试剂颜色变为深绿色即为失灵。

folin酚甲试剂afolin酚甲试剂bfolin酚乙试剂(1n)pbs稀释液bsa蛋白标准品(5mg/ml)100ml×25ml20ml30ml1mlfolin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

定量范围为5～100µg/ml蛋白质。

folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

1.根据需要量，取适量folin酚甲试剂a和b按50:1混合，混合后有效期为24小时，过期失灵。

2.根据需要量，取适量bsa标准品用pbs稀释稀释10倍至浓度0.5mg/ml。

若使用酶标仪法(96孔)3.将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20ul加到96孔板中，加pbs补足到20ul。

4.将样品并作适度吸收(最出色多搞几个梯度)，提20ul至96孔板的样品孔中。

由于移液器在挑小量时的误差，标准线前面的点误差比较小，所以尽可能的使样品点落到标准线1/2后。

5.将配好的folin酚甲试剂每孔加入200ul，轻轻震动，混匀，室温放置10分钟。

6.各孔重新加入20持续上升folin酚乙试剂，快速搅匀，37℃置放30分钟。

用酶标仪测量a650排序蛋白浓度。

若采用分光光度计法（接上述步骤2）3.挑八支（或者更多）5ml离心管，标号，按下表中重新加入试剂。

4.混匀，37℃放置30分钟。

分光光度计测定a650计算蛋白浓度。

Lowry法和 Bradfard法测定蛋白质含量

Lowry 法和Bradfard法测定蛋白质含量一.试剂Folin酚试剂(甲) 70毫升Folin酚试剂(乙) 8毫升考马斯亮兰G250 70毫升BSA 10毫升二.实验材料血清 10 ml小白菜 2克(叶多梗少)三.实验仪器722分光光度计 ; 低速台式离心机;电热恒温水浴(37℃) ; 微型漩锅混合仪四.本次实验所需器皿洗涤普通试管 27只 0.5毫升移液管 2支离心试管4只 1毫升移液管 5支50毫升容量瓶 4只 5毫升移液管 2支￠7㎝布氏漏斗 1个研钵 1个150ml抽滤瓶 1个 50毫升烧杯 1个125毫升棕色试剂瓶 2个玻璃比色皿 1对说明:1.试剂乙加入后务必立即混合.2.血清与BSA在两种测定方法中浓度不同.用时从冰箱冷藏室取用.3.取试剂一律用本实验配给的专用干净量具,按给定取用量一次性取足,量具用毕放回原处,勿扯用.15ml以内试剂取用量可直接用自备试管(1.5×15)或具塞试管装取,其余用试剂瓶装取.4.实验材料一律用自来水、蒸馏水洗净,吸水纸吸干水分后再用称量纸称重.一般情况测定酶及RNA等材料都采用冰浴研磨.5.移液管、容量瓶用洗液洗涤.(洗瓶用毕倒回原瓶)其余用洗衣粉洗涤(务必用自来水反复冲洗十几遍后再用蒸馏水过一遍)6.使用所有仪器前必须清楚该仪器的正确使用方法及步骤,使用光度计时,自带洗瓶、废液杯(500ml塑料烧杯),并登记仪器使用情况.7.值日生负责本次实验工具取还,蒸馏水补充及实验室卫生.卫生要求:(1)所有实验台及公用台抹干净,地面拖干净.(2)检查所有仪器是否置正常关机位置.并拔出电源,盖好机罩.(3)垃圾倒干净,废液桶倒干净.。

蛋白质检测(Lowry)--方法学验证

Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。

2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。

4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。

0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。

0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。

0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。

酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。

3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。

Lowry’s法(Folin-酚试剂法)2012

Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
蛋白质含量测定的常用方法比较
方法凯氏定氮法
灵敏度
优点
缺点操作复杂，费时
0.2~ 1.0mg氮干扰少，准确
紫外吸收法
考马斯亮蓝法（Bradford）法双缩脲法 Lowry法
吸光度A
计算

根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升样品中蛋白质的微克数 (mg/ml)。

蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×稀释倍数
本方法的特点：

优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
按键切换到t档?将黑体放入光路中合上盖按键校零mode0?开盖将参比液按空白液标准液待测液顺序放入比色杯架上合上盖按键切换到a档mode?拉动比色架拉杆将空白液放入光路中合上盖按键校零?拉动拉杆将标准待测液依次放入光路中即可读取其吸光度a?读数后将黑体推回光路中开盖取出比色杯?将参比液倒回原试管中清洗比色杯并晾干?关机盖上防尘盖登记仪器使用登记本
Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
实验目的

1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

蛋白质定量(LOWRY法)

蛋白质定量/蛋白质含量的测定(LOWRY法)实验原理Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。

因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

实验试剂Na2WO4•2H2O；Na2MoO4•2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4•H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4•5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。

实验设备试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。

实验材料可溶性蛋白质实验步骤1. 酚试剂的制备（1）取Na2WO4•2H2O 100g，Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。

安上回流冷却装置（使用磨口接头。

用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。

冷却后加入Li2SO4•H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。

冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。

使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。

滴定终点由蓝变灰。