第四章 基因克隆载体1
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染色体整合在一起． 3）在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合
的受体细胞染色体DNA一起复制． 4）外源基因能在受体细胞中表达． 5）克隆载体进入细胞后有可供选择标记
２ 克隆载体的分类
2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类
a)质粒载体：大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体， 酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体
3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。
4、Ori区：复制起始区
3) 农杆菌Ti质粒载体的构建
双质粒系统介导外源基因整合的流程
第三节 噬菌体衍生的克隆载体
１ λ噬菌体克隆载体
１.1λ噬菌体的一般特性 λ噬菌体的组成
结构：外壳蛋白 DNA
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr． F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）． G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．
H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．
2 质粒载体的构建
2.1 质粒构建的基本要求
1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行 松弛型复制.
3 几种常见的质粒载体
１）pBR322：
2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始 点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组
装了MCS．
3）pGEM-T TA克隆载体(promega Co.)
4）pGEX系列融合蛋白表达载体(Pharmacia Co.)
5）
体：pGEX-2T，pGEX-3X d)真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV e)转录（TranscHale Waihona Puke Baiduiption）载体：pSL1190 f)普通载体（General vector）：pBR322，pUC18
第二节 质粒克隆载体
１ 质粒载体的一般特性
1）质粒的组成与构型
质 粒 (plasmid) 是 一种存在于宿主细 胞中染色体外裸露 的双链DNA分子．
b) λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点． c) λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的
75-105%( 38-54 kb)．
λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式
1.2 λ基因组DNA的结构
1.3 λ噬菌体载体构建的策略
a)去除部分限制酶识别位点 b)去除非必需区DNA J-N；P-Q c)插入可供选择的标记基因
细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子 细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒载体的特性
质粒DNA分子的大小: 细菌质粒的大小相差较大，小 的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同 的质粒不能存在于同一细胞中．
B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿 主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．
C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同 一宿主细胞中．
D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
pET-28 系列融 合蛋白 表达载 体
6) 真 核 表 达 载 体
7)启动子活性分析载体pAc-GFP1-1
8）Ti质粒载体
1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA
2、Vir区：毒区，激活T-DNA转移。与T-DNA区相邻， 共占Ti质粒DNA的1/3。
第四章 基因克隆载体
第一节 基因克隆载体的特点与分类
1 基因克隆载体的含义及特点
含义：能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗 传的DNA或RNA分子．
Foreign gene
MCS
Marker
基因克隆载体的特点
特点:1）具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点． 2）进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
段较大.
2.2 质粒构建的策略
1. 选择合适的出发质粒； 2. 正确获得构建质粒载体的元件； 3. 组装合适的选择标记基因； 4. 选择合适的启动子。
形态：头部 尾部
λ噬菌体的电子显微镜照片
λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp) 在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘 性末端(Cohesive end ),进入宿主细胞后, 粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’
b)噬菌体载体：双链DNA噬菌体载体λ；单链DNA噬菌 体载体，M13，T3，T7
c) 病 毒 载 体 ： 植 物 病 毒 载 体 CaMV （ 花 椰 菜 花 斑 病 病 毒）；动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）
d)质粒和噬菌体DNA兼有的载体：Phasmid 载体（含有 f1 噬菌体的ori）；Cosmid 载体（含有λDNA的Cos 区）
可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的 宿主细胞中．
复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制， 其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制， 质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．
质粒上的相关基因
A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细 胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积 累到足以阻止质粒的复制．
外源片段的整合及体外组装
2. Cosmid克隆载体
2.1 Cosmid载体的特点 a)兼有λ噬菌体和质粒载体的特点． 含有λ噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和 细菌质粒载体的复制子(选择标记, 可在细 菌中保存和大量复制)． b)可插入大片段外源DNA．
的受体细胞染色体DNA一起复制． 4）外源基因能在受体细胞中表达． 5）克隆载体进入细胞后有可供选择标记
２ 克隆载体的分类
2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类
a)质粒载体：大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体， 酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体
3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。
4、Ori区：复制起始区
3) 农杆菌Ti质粒载体的构建
双质粒系统介导外源基因整合的流程
第三节 噬菌体衍生的克隆载体
１ λ噬菌体克隆载体
１.1λ噬菌体的一般特性 λ噬菌体的组成
结构：外壳蛋白 DNA
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr． F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）． G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．
H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．
2 质粒载体的构建
2.1 质粒构建的基本要求
1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行 松弛型复制.
3 几种常见的质粒载体
１）pBR322：
2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始 点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组
装了MCS．
3）pGEM-T TA克隆载体(promega Co.)
4）pGEX系列融合蛋白表达载体(Pharmacia Co.)
5）
体：pGEX-2T，pGEX-3X d)真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV e)转录（TranscHale Waihona Puke Baiduiption）载体：pSL1190 f)普通载体（General vector）：pBR322，pUC18
第二节 质粒克隆载体
１ 质粒载体的一般特性
1）质粒的组成与构型
质 粒 (plasmid) 是 一种存在于宿主细 胞中染色体外裸露 的双链DNA分子．
b) λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点． c) λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的
75-105%( 38-54 kb)．
λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式
1.2 λ基因组DNA的结构
1.3 λ噬菌体载体构建的策略
a)去除部分限制酶识别位点 b)去除非必需区DNA J-N；P-Q c)插入可供选择的标记基因
细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子 细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒载体的特性
质粒DNA分子的大小: 细菌质粒的大小相差较大，小 的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同 的质粒不能存在于同一细胞中．
B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿 主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．
C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同 一宿主细胞中．
D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
pET-28 系列融 合蛋白 表达载 体
6) 真 核 表 达 载 体
7)启动子活性分析载体pAc-GFP1-1
8）Ti质粒载体
1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA
2、Vir区：毒区，激活T-DNA转移。与T-DNA区相邻， 共占Ti质粒DNA的1/3。
第四章 基因克隆载体
第一节 基因克隆载体的特点与分类
1 基因克隆载体的含义及特点
含义：能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗 传的DNA或RNA分子．
Foreign gene
MCS
Marker
基因克隆载体的特点
特点:1）具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点． 2）进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
段较大.
2.2 质粒构建的策略
1. 选择合适的出发质粒； 2. 正确获得构建质粒载体的元件； 3. 组装合适的选择标记基因； 4. 选择合适的启动子。
形态：头部 尾部
λ噬菌体的电子显微镜照片
λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp) 在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘 性末端(Cohesive end ),进入宿主细胞后, 粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’
b)噬菌体载体：双链DNA噬菌体载体λ；单链DNA噬菌 体载体，M13，T3，T7
c) 病 毒 载 体 ： 植 物 病 毒 载 体 CaMV （ 花 椰 菜 花 斑 病 病 毒）；动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）
d)质粒和噬菌体DNA兼有的载体：Phasmid 载体（含有 f1 噬菌体的ori）；Cosmid 载体（含有λDNA的Cos 区）
可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的 宿主细胞中．
复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制， 其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制， 质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．
质粒上的相关基因
A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细 胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积 累到足以阻止质粒的复制．
外源片段的整合及体外组装
2. Cosmid克隆载体
2.1 Cosmid载体的特点 a)兼有λ噬菌体和质粒载体的特点． 含有λ噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和 细菌质粒载体的复制子(选择标记, 可在细 菌中保存和大量复制)． b)可插入大片段外源DNA．