光合细菌不同属类的分离培养

光合细菌的分离培养光合细菌（Photosynthetic Bacteria，略作PSB）是一大类能进行光合作用的原核生物的总称。

除蓝细菌外，都能在厌氧光照条件下进行不产氧的光合作用。

研究与应用的实践表明，光合细菌在高浓度有机废水处理与资源化、水产养殖的水质调控与促进健康生长、在农业生产中作为高效活性菌肥等方面，发挥着十分有益的和令人瞩目的作用。

关于光合细菌的类群、形态与生理特征、在生态系统中的地位和作用等内容，请参考有关文献与专著。

这里仅就光合细菌的分离、培养方法作一介绍。

1光合细菌的富集培养的一般方法①分离源光合细菌四个科-红螺菌科(Rhodospirillaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、绿菌科(Chlorobiaceae)、绿色丝状菌科(Chloroflexaceae)的各种菌，广泛分布于地球生物圈的各处。

作为光合细菌的分离源，一般可从富营养化的湖泊、池沼、海滩、以及水田、硫黄泉、灌水土壤、和污水厂活性污泥、畜牧场水沟等厌氧或缺氧环境采样。

在较深的水体，可使用采水器采取厌氧层的水。

在较浅的地方，可直接用吸管吸取带底泥的水。

采样的同时记录水温、pH、有无H2S气味等项内容。

将采集到的水样或泥样放在厌氧、低温条件下，带回实验室进行分离。

②光合细菌富集培养基用于光合细菌富集培养用的培养基有许多配方，这里仅介绍日本星野氏推荐的基本培养基I和基本培养基II。

前者适合于红螺菌科的光合细菌，后者适用于着色菌科和绿菌科的菌。

基本培养基I：KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.6g (NH4)2SO4 1.0g MgSO4·7H2O 0.2gNaCl 0.2g CaCl2·2H2O 0.05g酵母浸出汁 0.1g微量元素溶液（见后）1mL 生长因子溶液（见后）1mL蒸馏水1000ml以上配制成的培养基pH值约6.7根据需要，可在上述培养基中添加一些成分，如富集的是缺少同化型硫酸还原系的菌种，则可在基本培养基I中加入0.01%硫代硫酸钠；如是海洋性菌种，可加入3%NaCl等等。

另外，如分离源中含有较多的硫酸还原菌时（尤其是采自海洋的样品），为了抑制硫酸还原菌的生长，可把基本培养基I中的(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O替换成NH4Cl和MgCl2·6H20。

含单一有机化合物的基本培养基I配置方法如下：①在容积为20mL的螺口试管中，加入最终浓度为一定量（0.05～0.1%）的有机物。

②加入基本培养基I至1/2试管的量，松松地旋上螺盖。

③ 121℃，灭菌15分钟。

④冷却后加入过滤除菌的10%抗坏血酸钠溶液0.1mL（最终浓度为0.05%），作为还原剂。

⑤用另行灭菌的基本培养基I注满试管，旋紧螺盖。

用同样方法可配制含各种不同的单一有机化合物的基本培养基I。

基本培养基II：KH2PO4 1.0g，NH4Cl 1.0g，MgCl2·6H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.05g，微量元素溶液（见后）1mL，生长因子溶液（见后）1mL，蒸馏水1000mL，根据需要，可在该培养基中加入0.1%硫代硫酸钠、3% NaCl或0.05%乙酸钠等。

含一定浓度的H2S和CO2，并有特定pH的基本培养基II的配制，可参照表5-5进行。

例如，要配制NO.1的基本培养基II，其中含0.1%Na2S·9H2O 和0.2%NaHCO3，pH=6.4，具体方法如下：①在螺口试管（容积为20mL）中加入半管量的基本培养基II，松松地旋上螺盖。

②121℃，灭菌15分钟。

③冷却后依次加入0.3mL1NHCl、0.5mL8%的NaHCO3溶液（过滤除菌）和1.0mL2%的Na2S·9H2O溶液（高压灭菌）。

④用另行灭菌的基本培养基II注满试管，旋紧螺盖。

用同样方法可配制含所需H2S浓度和pH值的各种基本培养基II。

将制得的装有培养基的试管充分振荡后，在冷暗处放置1昼夜，使培养基内完全呈厌氧状态。

在这种状态下可保存1个月左右。

表5-5 各种基本培养基II 的配制方法 培养基中的浓度（%）*最终培养基20mL 中应加入mL 数 培养基编号NaHCO 3 Na 2S·9H 201NHCl 1NaOH 培养基的pH1 0.2 0.1 0.3 6.42 0.2 0.1 0.26.7 3 0.2 0.1 0.15 6.9 4 0.2 0.1 0.17.1 5 0.2 0.1 0.05 7.3 6 0.2 0.1 7.67 0.2 0.1 0.05 7.9 8 0.2 0.05 0.15 6.6 9 0.2 0.05 0.16.9 10 0.2 0.05 0.057.0 11 0.2 0.05 7.212 0.2 0.050.05 7.5 13 0.2 0.050.15 7.8 14 0.2 0.025 0.056.9 15 0.2 0.0257.116 0.2 0.0250.05 7.3 17 0.2 0.0250.1 7.5 18 0.2 0.025 0.15 7.9 * 最终培养基量20mL 中，加入8%NaHCO 3溶液0.5mL 时，其最终浓度为0.2%；若分别加入2%Na 2S·9H 2O 溶液1.0、0.5、0.25mL ，它们的最终浓度分别为0.1%、0.05%、0.025%。

微量元素溶液：EDTA -2Na 2000mg ， FeSO 4·7H 2O 2000mg ， H 3BO 3 100mg ，CoCl 2·6H 2O 100mg ，ZnCl2100mg， MnCl2·4H2O 100mg，Na2MoO4·2H2O 20mg，NiCl2·6H2O 20mg，CuCl2·2H2O 10mg， Na2SeO31mg，蒸馏水1000mL，保存于暗处。

生长因子溶液：维生素B1 50mg，烟酸（维生素PP）50mg，对氨基苯甲酸30mg，维生素B12 5mg，吡多酸（维生素B6） 10mg，生物素5mg，蒸馏水100mL，保存于冷暗处。

③接种适当的接种量对于有效地富集到目标菌种十分重要。

因为过多的接种量会使培养基条件发生变化，导致富集培养失败。

合适的接种量为：20mL富集培养基中加入分离用样品1～2滴。

④培养接种后的富集培养管，一般先在室内暗处放置数小时至1昼夜，然后移至光照下开始光合成培养。

培养时间因条件而异，大约需要1星期至1个月。

如果一次富集培养光合细菌尚未充分生长，则应继续进行富集培养。

即把上一次的富集培养物移接少量至无菌的富集培养液中，重复上述的培养过程，直至获得有光合细菌大量生长的富集培养物。

⑤光源进行光合成培养时使用的光源，以白炽灯为好。

因为与荧光灯相比，白炽灯不仅发出光合细菌的类胡萝卜素吸收的短波光（450-550nm），而且大量发出细菌叶绿素（Bchl）吸收的长波光（715-1050nm）。

由于不同的光合细菌菌种所含有的细菌叶绿素种类不同（见表5－6），因此也可利用特定波长的光源来进行相应菌种的富集培养（van Niel，1971）。

光合成培养的合适光照强度为500-2000Lux，把培养管放在距白炽灯（40-60W）15-5℃m处即可。

另外，由于白炽灯会发出大量的热，故因注意培养装置内温度的控制。

表5－6 各种Bchl及其主要吸收光波Bchl 最大吸收波长（nm）Bchl a 830～890Bchl b 1015～1035Bchl c 745～760Bchl d 725～745Bchl e 715～725⑥防止藻类生长富集培养中若有藻类生长，会因其光合产氧而使培养基内呈好氧状态，从而引起光合细菌的生长受抑制。

为了阻止藻类的生长，Swoager和Lindstrom（1971）提出可在培养基中加入光化学反应系II的抑制剂。

另外，也可利用滤波器得到波长700nm以上的光作为光源，在这样的光照条件下，光合细菌因含有Bchl（吸收波长为700nm以上）而能够生长，藻类则因所含Chl的吸收波长为700nm以下而不能生长。

（2）各科光合细菌的富集培养①.红螺菌科（Rhodospirillaceae）光合细菌的富集培养该科光合细菌包括4属17种1亚种。

这些菌种都能利用有机物作为碳源和光合成反应的氢供体进行生长。

因此，红螺菌科的菌可用含单一有机物的基本培养基I，并在20～30℃，1000～2000Lux 条件下进行富集培养。

培养物因菌种不同而呈现红、紫、茶色等色泽。

为富集红螺菌科中的特定菌种，一般的方法是依据该菌种对某种有机物的特异利用性，配制成以该有机物为单一碳源的培养基进行富集培养。

此外，可利用不同菌种对培养基pH、生长因子以及光源波长范围的不同要求，来对特定菌种进行富集培养。

实际应用时，常根据需要把上述培养基和培养条件组合起来，将能更有效地富集到所需的特定菌种。

以下就几种红螺菌科细菌的富集培养法作一简要介绍。

a．Rhodobacter sphaeroides（球形红菌）（原为Rhodopseudemonas sphaeroides，球形红假单胞菌）的富集培养：首先，在含有0.1%乙醇或醋酸钠的培养基中进行第一次富集培养。

然后，将一部分富集培养物接种到含0.1%酒石酸钠的培养基中，进行第二次富集培养。

用此法可选择性地富集到球形红菌（R. Sphaeroides）（van Niel，1971）。

但是，在R. Sphaeroides中也有些菌株不能利用酒石酸钠为碳源。

据星野氏的研究，对这些菌株的富集培养可在含3%NaCl的苹果酸钠培养基中进行。

b．Rhodopseudomonas acidophila（嗜酸红假单胞菌）的富集培养：根据Pfennig（1969）的研究，可采用不含生长因子的琥珀酸钠培养基（pH=5.1）进行嗜酸红假单胞菌的富集培养。

c．Rhodopseudomonas viridis（绿色红假单胞菌）的富集培养：采用乙醇或醋酸钠培养基，并利用该菌含Bchl b而以红外滤色器获得1000-1050nm波长的光进行照射，可有效地富集到绿色红假单胞菌。

其培养物呈绿色。

（Drews and Giesbrecht，1966）d．Rhodospirillum fulvum（黄褐红螺菌）的富集培养：采用只含对-氨基苯甲酸为生长因子的0.05%苯甲酸钠培养基，可有效地富集黄褐红螺菌。

（Pfennig，Eimhjellen and Liaaen，1965）②着色菌科（Chromatiaceae）光合细菌的富集培养法该科光合细菌包括10属27种。

该科菌种在以CO2为碳源、H2S为光合反应氢供体的碱性培养基中生长良好。