第八章 分子杂交技术
分子杂交技术的应用原理
分子杂交技术的应用原理1. 引言分子杂交技术是一种在分子生物学中广泛应用的重要技术。
它通过将两种不同来源的DNA序列进行杂交，形成新的DNA复合物，从而实现对特定基因的检测、克隆和表达等操作。
本文将介绍分子杂交技术的应用原理及其在基因组学、遗传学和生物工程学等领域的应用。
2. 分子杂交技术的原理分子杂交技术主要基于DNA的双链互补配对原理，其步骤包括：DNA断裂、杂交、杂交产物的检测与分析。
2.1 DNA断裂DNA断裂是将待杂交的DNA序列进行打断的步骤。
常用的方法有限制性内切酶切割和机械剪断。
2.2 杂交杂交是将待杂交的DNA序列与用于杂交的探针进行互补配对的步骤。
探针可以是用于检测特定基因的标记DNA。
DNA杂交过程中，两个互补的单链DNA会形成稳定的双链结构。
2.3 杂交产物的检测与分析杂交产物的检测与分析是为了确定杂交是否成功，并进一步分析杂交的特征。
常用的方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern印迹杂交等。
3. 分子杂交技术在基因组学中的应用分子杂交技术在基因组学中有着重要的应用。
例如，它可以用于检测和定位特定基因片段。
通过使用探针进行杂交，可以将特定基因的位置精确标记出来，从而帮助研究人员对基因组进行研究和分析。
4. 分子杂交技术在遗传学中的应用分子杂交技术在遗传学研究中也得到了广泛的应用。
它可以用于分离和纯化特定基因，帮助研究人员更好地理解基因的结构和功能。
此外，通过分子杂交技术还可以进行基因的克隆和表达等操作，为遗传学研究提供了强有力的工具。
5. 分子杂交技术在生物工程学中的应用分子杂交技术在生物工程学中具有重要的应用价值。
例如，在转基因技术中，人们可以利用分子杂交技术将外源基因导入到目的生物体中。
这项技术被广泛用于农业、医学和工业等领域，可以改良作物品种、生产重要的药物以及提高工业生产效率。
6. 总结分子杂交技术是一种在分子生物学领域中被广泛应用的重要技术。
它基于DNA 的双链互补配对原理，通过断裂、杂交和检测与分析等步骤，实现对特定基因的检测、克隆和表达等操作。
8.印迹杂交技术
片段的大小和含量
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41
第四节 核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
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根据杂交探针标记的不同： 同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同： 液相杂交 点杂交/狭缝杂交
菌落杂交 固相杂交 Northern 杂交 Southern杂交
②为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性解链
③具有高度特异性，只与待测核酸杂交
④探针序列通常是基因编码序列，因为非编码序列 特异性低
⑤探针标记灵敏度高而稳定，标记方法简便而安全
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二、探针的种类 1.基因组DNA探针 2. RNA探针 3. cDNA探针
4.寡核苷酸探针
11
⒈ 基因组DNA探针
基因组DNA探针多为某一基因的全部或部
第八章 印迹杂交技术
1
第一节 核酸分子杂交的基本原理
基本概念:
核酸分子杂交:
将一种核酸单链标记成为探针．再与另一种核 酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源双链核酸 分子的过程。
杂交体:杂交形成异源双链核酸分子
2
核酸分子杂交
不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些局 部碱基互补片段在复性时形成杂化双链，此过程称 分子杂交。
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核酸的固定
烘烤：80℃ 2小时 紫外线固定：几分钟
碱固定：使用碱溶液转印DNA或
RNA过程中，DNA或RNA可以自动地
共价地结合到带正电荷或不带电荷的
尼龙膜上。
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⒋预杂交
将固相膜上能够结合核酸的位点全部封闭
能够结合核酸片段的固相膜同样能够结合探针，
分子杂交技术
分子杂交技术引言分子杂交技术是一种重要的实验手段，在生物学和生物化学领域被广泛应用。
它通过将两个不同源的核酸序列（DNA或RNA）进行杂交，从而得到具有特定性质和功能的新分子。
在本文中，我们将介绍分子杂交技术的原理、应用和未来发展方向。
原理分子杂交技术主要基于核酸的互补配对原理。
DNA和RNA 分子中的碱基有互补配对性质，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）互补配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）互补配对。
在杂交过程中，两个互补的核酸序列会通过碱基间的氢键相互结合，形成一个稳定的双链结构。
应用分子克隆分子杂交技术在分子克隆中起到至关重要的作用。
通过将目标基因的DNA序列与载体DNA进行杂交，可以实现基因的定向克隆。
例如，使用限制性内切酶将目标基因和载体DNA切割开后，通过杂交技术将两者粘合在一起，形成重组DNA，然后可以通过转化、转染等手段将重组DNA导入到宿主细胞中，实现基因的表达。
基因探针分子杂交技术也被广泛应用于基因探针的设计和制备。
基因探针是一种用于检测目标基因在细胞或组织中表达情况的分子工具。
通过将特异性的探针与目标基因进行杂交，可以实现对目标基因的检测和定位。
分子杂交技术可以用于制备放射性或非放射性的探针，例如荧光探针或生物素标记的探针，从而实现对目标基因的高灵敏度和高特异性的检测。
基因组分析分子杂交技术还可以用于基因组分析。
例如，通过杂交技术可以将特异性的探针与目标基因组中的特定区域进行杂交，从而实现对基因组的定位和映射。
此外，分子杂交技术还可以用于研究基因组中的DNA重复序列、非编码RNA等。
DNA鉴定分子杂交技术在DNA鉴定领域也有广泛的应用。
例如，通过杂交技术可以将可疑犯罪嫌疑人的DNA样本与现场留下的DNA样本进行比对，以确定是否属于同一人。
此外，分子杂交技术还可以用于亲子鉴定、物种鉴定等。
未来发展方向随着科技的不断发展，分子杂交技术也在不断更新和发展。
未来，我们可以预见以下几个方面的发展：1.高通量分子杂交技术的发展：随着高通量测序技术的发展，分子杂交技术可以与测序技术结合，实现对大规模样本的高效分析，从而推动基因组学、转录组学等领域的研究进展。
分子杂交技术
分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。
该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。
根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。
探针必须经过标记，以便示踪和检测。
使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。
下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。
同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
分子杂交技术(精)
1、检测受体细胞中的标记基因是否表达，即是否表现出标记基因的性状，从而判断受体细胞中是否已导入含有目的基因的运载体。
如果检测出标记基因表达的性状，说明运载体已导入受体细胞。
2、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。
检测方法是：采用DNA分子杂交技术。
先将转基因生物的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。
3、检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。
采用DNA与RNA分子杂交技术。
从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mR NA。
4、检测目的基因是否翻译成蛋白质。
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原——抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
5、个体生物学水平的鉴定。
如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度。
又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
目的基因的检测与鉴定的补充课本Southern杂交法一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
分子杂交技术原理
分子杂交技术原理
分子杂交技术原理是一种利用DNA或RNA的互补配对性质
来研究、检测和改变基因序列的方法。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 提取目标基因的DNA或RNA：首先从目标生物体中提取所需的DNA或RNA，作为杂交反应的靶标。
2. 制备探针：根据目标基因序列的已知信息，设计并合成一条能与目标基因序列特异性互补配对的DNA或RNA探针。
这
条探针通常用核酸合成技术制备。
3. 杂交反应：将目标基因的DNA或RNA与探针在一定条件
下进行杂交反应。
在杂交反应中，探针的互补碱基序列与目标基因的碱基序列形成互补配对，通过氢键结合在一起。
这种互补配对使得目标基因与探针发生特异性结合。
4. 杂交探测：通过一系列实验手段来检测杂交反应的结果。
其中最常用的方法是利用标记物标记探针，然后观察标记物的信号，如荧光、放射性同位素等，从而确定目标基因的存在与否。
5. 数据分析：根据杂交反应的结果，对目标基因的序列、结构或表达进行分析。
根据需要，可以进一步应用其他技术手段来研究基因功能、突变、启动子活性等。
分子杂交技术的原理基于DNA和RNA的互补配对性质，利
用了基因的遗传信息传递和互补配对的特点。
通过对目标基因
序列的特异性杂交，可以实现对基因结构、表达和功能等方面的研究。
这种技术在基因工程、遗传学研究、疾病诊断和治疗等领域具有广泛的应用。
分子杂交技术
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5．聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针 DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达 70%～80%。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非 放射性标记。
(三）非放射性探针的显示体系
标记物性质 生物素 标记分子
Bio-11-dUTP
标记方法
杂交体的检测法
NT 、 TL 、 酶标亲合素或酶标抗生物 PCR 素抗体显色
半抗原
地高辛
RPL , PCR
酶标抗体 + 底物显色
* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶链反应；RPL： 随机引物标记； TL：末端标记
（二）核酸探针的非放射性标记技术 1．光敏生物素标记核酸 目前使用的光标生物素试剂有两种： 光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都有一个光敏 基团。 2．酶促生物素标记核酸 以生物素化的脱氧核苷三磷酸 （Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应32P 标记的脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入DNA。 3．寡核苷酸的生物素末端标记 有5’-磷酸的化学标记法和 3’-OH的酶促标记法。前者将寡核苷酸的5’-磷酸接上一个乙二胺， 然后用琥珀酰亚胺生物素，将生物素基团连接在磷酸酰胺基上。 后者是用末端转移将Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脱去一个焦 磷酸）。 4．酶标DNA 标记试剂是辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶 （AP）。通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成 （HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结 合，使HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。
分子杂交技术的原理及应用
分子杂交技术的原理及应用1. 引言分子杂交技术是一种在分子水平上研究和探索生命现象的方法。
它是通过将两个不同的DNA分子进行杂交，从而实现两者信息的交流和组合。
本文将重点介绍分子杂交技术的原理以及其在生物科学领域的应用。
2. 分子杂交技术的原理分子杂交技术的原理基于DNA的互补配对原则。
DNA是由四种碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胸苷和胞嘧啶）组成的双螺旋结构，其中腺嘌呤与胞嘧啶之间通过氢键形成稳定的配对，鸟嘌呤与胸苷之间也通过氢键形成稳定的配对。
基于这种互补配对的原理，可以将两个不同的DNA分子通过杂交技术进行结合。
分子杂交技术主要包括以下几个步骤：2.1 DNA提取DNA提取是分子杂交技术的首要步骤。
可以通过破碎细胞膜，使用特定的试剂或酶来提取DNA。
2.2 DNA标记DNA标记是为了便于检测和分析杂交结果而给DNA分子添加或连接一些标记物，常见的标记物有放射性同位素、荧光染料和酶等。
2.3 DNA杂交DNA杂交是将两个标记过的DNA分子放在一起，使其互相配对。
杂交可以在液相中进行，也可以通过固相法在试剂盒中进行。
2.4 检测杂交结果检测杂交结果可以使用放射性测量、荧光检测或酶活性检测等方法。
这些方法可以帮助确定DNA分子之间的交流和结合情况。
3. 分子杂交技术的应用分子杂交技术在生物科学领域有广泛的应用，下面将介绍几个常见的应用领域：3.1 亲缘关系分析通过分子杂交技术，可以对家族成员之间的亲缘关系进行分析。
通过比较DNA 序列的相似性和差异性，可以判断是否存在血缘关系。
这对于进行亲子鉴定、法医学鉴定和家谱研究等方面具有重要意义。
3.2 病原体检测分子杂交技术可以应用于病原体的检测和鉴定。
通过将病原体的DNA与特异性探针进行杂交，可以快速准确地检测和鉴定病原体。
这在临床诊断和疫情监测方面具有重要的应用价值。
3.3 基因工程分子杂交技术在基因工程中也有广泛的应用。
通过将目的基因与载体DNA进行杂交，可以将目的基因导入到宿主细胞中，从而实现基因的转移和表达。
分子杂交技术原理
分子杂交技术原理引言：分子杂交技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、农业育种、遗传疾病诊断等领域。
本文将介绍分子杂交技术的原理及其应用，以期加深对这一技术的理解。
一、分子杂交技术的基本原理分子杂交技术是通过将两种不同的DNA序列进行配对结合，从而产生新的DNA分子。
其基本原理可以简单地概括为以下几个步骤：1. DNA的提取和纯化：从目标生物体中提取所需的DNA，并经过一系列纯化步骤，以去除杂质和其他干扰物。
2. DNA的标记：将目标DNA标记上荧光染料或放射性同位素等标记物，以便于后续的检测和分析。
3. 杂交反应：将标记的目标DNA与待检测的DNA样本一起进行杂交反应。
这一步骤需要一定的条件，如适当的温度和盐浓度等。
4. 杂交后的检测：通过特定的检测方法，如Southern blotting或原位杂交等，对杂交后的DNA进行检测和分析。
二、分子杂交技术的应用分子杂交技术在生物学研究和应用中有着广泛的应用。
下面将重点介绍分子杂交技术在基因工程、农业育种和遗传疾病诊断等方面的应用。
1. 基因工程：分子杂交技术被广泛应用于基因工程领域。
通过将外源基因导入宿主细胞中，并与宿主基因进行杂交，可以实现基因的定点插入、基因的表达调控等功能。
2. 农业育种：分子杂交技术在农业育种中起到了重要的作用。
通过将不同植物或动物的优良基因进行杂交，可以培育出具有抗病性、高产性等优良性状的新品种。
3. 遗传疾病诊断：分子杂交技术在遗传疾病的诊断中具有重要意义。
通过将患者样本中的DNA与已知遗传病变相关的基因进行杂交，可以准确地检测出患者是否携带相关的遗传突变。
三、分子杂交技术的优势和局限性分子杂交技术作为一种重要的生物技术手段，具有以下优势：1. 高度特异性：分子杂交技术可以准确地检测目标DNA序列，具有高度特异性。
2. 灵敏度高：分子杂交技术可以检测到非常低浓度的目标DNA序列，具有很高的灵敏度。
3. 定量性强：分子杂交技术可以对目标DNA序列进行定量分析，可以精确地测量目标DNA的含量。
分子杂交技术的原理
分子杂交技术的原理介绍分子杂交技术是一种重要的生物技术方法，用于研究和改变生物体的基因组。
它通过将两个不同物种的DNA序列进行杂交，创造出新的DNA序列，从而实现对基因组的改变和研究。
本文将深入探讨分子杂交技术的原理。
DNA的结构在了解分子杂交技术的原理之前，我们需要先了解DNA的结构。
DNA是由核苷酸组成的双链螺旋结构，每个核苷酸由一个糖分子、一个碱基和一个磷酸基团组成。
碱基有四种类型：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
两条DNA链通过碱基间的氢键相互连接，形成一个稳定的双链结构。
分子杂交技术的步骤分子杂交技术主要包括DNA提取、DNA片段制备、DNA杂交和杂交产物的分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的原理和操作方法。
DNA提取DNA提取是分子杂交技术的第一步，它的目的是从生物样本中提取出纯净的DNA。
DNA提取的方法有很多种，常用的方法包括酚/氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
不同的方法适用于不同类型的样本，但基本原理都是通过破坏细胞膜和细胞核，释放出DNA分子。
DNA片段制备DNA片段制备是分子杂交技术的关键步骤，它的目的是获得需要杂交的DNA片段。
DNA片段制备可以通过PCR（聚合酶链式反应）技术进行，也可以通过限制性内切酶切割DNA分子得到。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，它利用DNA聚合酶酶和两个引物，通过多轮循环反应，扩增出目标DNA片段。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并切割DNA链的酶，通过选择合适的限制性内切酶，可以将DNA分子切割成特定的片段。
DNA杂交DNA杂交是分子杂交技术的核心步骤，它通过将两个不同物种的DNA片段进行杂交，形成新的DNA序列。
DNA杂交的原理是DNA的碱基互补配对规则，即A与T互补，G与C互补。
在杂交过程中，两个DNA片段通过碱基间的氢键相互结合，形成一个新的双链DNA分子。
DNA杂交可以在体外进行，也可以在体内进行。
分子生物学 第八章 杂交与芯片技术
探针的体外标记法分为化学法和酶法 ①化学法：利用标记物分子上的活性基因与探针
分子上的基因（如磷酸基因）发生的化学反应， 将标记物直接结合到探针分子上。
探针标记
②酶法标记：预先将放射性同位素或非放射性标 记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将 标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核 苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。
然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及 纯化该cDNA片段，标记即可。
cDNA探针
也可采用PCR方法扩增。 该方法的优点：双链探针，长度较长，可与靶序列
形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高， 杂交信号强。 缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过 程中还存在自我复性现象。
4．RNA探针
寡核苷酸探针
③比活度高，适用于大多数杂交。如DNA序列测 定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。
缺点是探针短，特异性差，杂交体稳定性差，杂 交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难 度大，背景噪音也大。
2．基因组DNA探针
基因组DNA经机械剪切或限制性内切酶消化制备 成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当 的学习目标
掌握：1．核酸分子杂交的基本概念。 2．探针的种类与标记方法。 3．常见核酸分子杂交技术的原理。 4．DNA芯片的设计与制备。
熟悉：1．核酸分子杂交信号的检测方法。 了解：1．核酸杂交与DNA芯片技术的应用。
第一节
杂交的基本概念
杂交
杂交（hybridization）是指不同来源的单链核酸， 根据碱基互补配对原则，在适当的条件下形成杂化 双链的过程。
1．缺口平移法 缺口平移法 （nick translation，NT）
分子杂交技术
分子杂交技术分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术,主要用于检测和鉴定,可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。
常用的技术有下列三种。
杂交——DNA和DNA分子之间的杂交。
目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA 中,这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。
如何证明这一点,就需要通过Southern杂交技术。
基本做法:第一步,将受体生物DNA提取出来,经过适当的酶切后,走琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的片段分开;第二步,将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上;第三步,用标记了放射性同位素(或生物素)的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交;第四步,将X光底片压在硝酸纤维素膜上,在暗处使底片感光;第五步,将X光底片冲洗,如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。
杂交——DNA和RNA分子之间的杂交。
它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法,具体做法与Southern杂交相同,只是第一步从受体生物中提取的是mRNA而不是DNA,杂交带的显现也与Southern杂交相同。
杂交——蛋白质分子(抗原—抗体)之间的杂交。
它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。
具体做法:第一步,目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质;第二步,将表达出的蛋白质注射入动物体内进行免疫,产生相应的抗体,并提取出抗体(一抗);第三步,从转基因生物中提取蛋白质,凝胶电泳;第四步,将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上;第五步,将抗体(一抗)与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交,这时抗体(一抗)与目的基因表达的蛋白(抗原)会特异性结合。
由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带,所以加入一种称为二抗的抗体,它可以与一抗结合,二抗抗体上带有特殊的标记。
如果目的基因表达出了蛋白质,则结果为阳性。
分子杂交技术原理
分子杂交技术原理分子杂交技术是一种重要的分子生物学技术，它可以用于研究DNA、RNA和蛋白质等生物分子的结构、功能和相互作用。
分子杂交技术的原理主要包括杂交、探针和探针标记三个方面。
首先，杂交是指两条不同DNA或RNA分子之间的碱基互补配对。
在实验室中，可以通过将一条标记有放射性同位素或荧光染料的DNA或RNA探针与待检测的DNA或RNA样品进行杂交，来检测目标分子的存在和数量。
杂交的原理是基于DNA和RNA的碱基互补配对规律，即腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（T）之间形成两个氢键，胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）之间形成三个氢键，因此可以利用这种互补配对关系来进行特异性的分子识别。
其次，探针是分子杂交技术中的重要组成部分，它是一段已知序列的DNA或RNA分子，可以与待检测的目标分子特异性地进行杂交。
探针的选择对于分子杂交技术的准确性和灵敏度有着重要的影响，因此需要根据待检测目标的特点来设计合适的探针序列，以确保杂交的特异性和稳定性。
最后，探针标记是指在探针上标记放射性同位素、荧光染料或酶等标记物，用于检测探针与目标分子的杂交情况。
通过标记探针，可以使其在杂交后产生特定的信号，如放射性同位素探针可以通过放射性测定来检测目标分子的数量，荧光标记探针可以通过荧光显微镜或荧光成像系统来观察目标分子的位置和表达水平，酶标记探针可以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法来检测目标分子的存在和活性。
综上所述，分子杂交技术的原理包括杂交、探针和探针标记三个方面，通过这些原理可以实现对DNA、RNA和蛋白质等生物分子的检测和分析。
分子杂交技术在基因工程、生物医学研究和临床诊断等领域具有重要的应用价值，对于揭示生命活动的分子机制和疾病发生发展的机理具有重要意义。
希望本文对分子杂交技术的原理有所帮助，谢谢阅读！。
分子杂交技术
DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品
3. 分子杂交的一般程序
1) DNA和RNA的杂交
制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→ 预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。
2）蛋白质的免疫分析
制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭 剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反 应（EIA）
iv. 真空转移法 (Vaccum bllotting ) 转移速度与凝胶的速度和厚度成反比，在相同转移率
（50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛 细管法损失率20%。
v. 各种转移方法的比较 i) 扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器， 但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条 件要求较严。
4）离子膜
i. DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制备回收) ii. CM-纤维素纸 (可用于碱性蛋白质的结合)
2. 固定基质的选择依据
1）强度，耐久性，操作简便
2）高信噪比（低本底高信号）
3）生物大分子的结合容量和稳定性
4）重现性好
3. 各种杂交样品膜的制备
1）原位杂交样品膜的制备
3) 两类标记化合物的比较
i. 灵敏度 i ) 检测蛋白质，两种方法差不多。 ii) 检测核酸，放射法比酶法敏感。
ii. 稳定性 酶法探针可在4℃保存一年，放射性标记需每次制备。 iii. 安全性 非放射性标记安全。 iv. 效率 非放射性标记所需时间短。
2. 标记探针的制备
1）链标记法
i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-
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分子杂交技术
Байду номын сангаас 第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下 按碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（ 主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序 完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此 之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同 源性）就可以形成杂交双链
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双 链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成 中心序列 （4）形成完整的双链分子
二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
电泳
制备探针核酸片段
探 针 标 记 加入标记核酸探针
滤膜上核酸固化 杂 交
去除未参与杂交的探针
同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝
胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
凝胶
滤 板玻 璃 纸
尼龙膜
滤纸
白瓷盘
吸水纸
玻璃板
重物
吸水纸转膜
优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转 移时间较长,转移后杂交信号较弱
（2）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤
膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真 空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层 容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中， 同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜
（五）Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点
将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交 之前，必须先进行一个预杂交的过程。 因为能结合DNA片段的膜同样能够结合 探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上 所有能与DNA结合的位点全部封闭，这 就是预杂交的目的。
预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在 水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装 有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流 动。 预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该 DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与 DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些 大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附 位点
离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳
和羟甲基汞变性电泳。DNA电泳前和电泳 中不变性
3、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理。在烘烤 前RNA与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓 冲液洗膜，否则RNA会被洗脱。
或硝酸纤维素膜上。
优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(45mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中 定量地转移出来。转移后得到的杂交信 号比Southern转移强2-3倍。 缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗 膜不严格时,其背景比毛细转移要高。
（3）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。 该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移 较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难 以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效 时,才采用电泳转移。
杂交过夜（至少18h），然后在较高温度下用盐溶液洗膜。
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特 异结合的DNA 在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射 性检测仪探测膜上的放射强度。当放射 强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即 停止洗膜。 洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用 滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包 裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡 。
1、鉴别RNA 2、探针可用DNA或RNA片段 3、待测样品为总RNA或mRNA
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1. 总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式 存在，可直接应用于电泳； 2、变性：RNA电泳前加热变性，电泳在变性条件下进
行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分
GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一 定条件下按碱基互补原则重新结合为双 链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补 形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
（四）Southern印迹
高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸 纤维素滤膜（尼龙膜也较长用）上，烘干固定后 即可用于杂交 本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或
印迹)
（1）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中
的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，
第二节 核酸分子杂交的方法
按其分子种类划分
（1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
一、Southern杂交
2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
Southern杂交能否检出杂交信号取决于： 目的DNA在总DNA中所占的比例、 探针的大小和比活性、 转移到滤膜上的DNA量 探针与目的DNA间的配对情况等。
在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern 杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的 高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果 将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为 几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测 出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相 载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。 DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。 利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱 分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、 基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。
（七）Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量
3、基因突变分析
4、限制性片段长度多态性的分析
二、Northern印迹杂交
原理：Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将 分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原 位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜 等）上，再用放射性（或非放射性）标记的 DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交， 最后进行放射自显影（或化学显影），以目标 RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影 强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含 量（即目标RNA的丰度）。
（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针
（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中。将2张X光底片 放入曝光暗盒， （二）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝 光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （三）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上 升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若 感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片 子）。
限制性酶切割
限制片段 琼脂糖电泳
DNA分子
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶 滤膜
转膜 吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间 的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链 核酸 分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双 链核酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛 等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
检测杂交信号
制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交 →洗涤→放射自显影或显色反应。
三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目
的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。 制备方法：
(1) DNA重组技术
(2) PCR扩增
(3) 化学合成
2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为： (1) 基因组DNA探针
(2) cDNA探针
(3) RNA探针
(4) 寡核苷酸探针
合成寡核苷酸探针注意原则 (1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补；
如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤 (1) 把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH， 1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。 (2) 把凝胶浸在灭菌双蒸水中 (3) 把凝胶浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，Ph7.5 ，1.5mol/L NaCl），室温2×15分钟。 (4) 在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。
(4) 避免同一碱基连续出现；