贴壁细胞培养实验讲义
贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞培养HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO27天。
贴壁-悬浮培养
动物细胞培养的操作方式
• 1、分批式操作 • 一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进
行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和 积累，最后将条件培养基（conditioned medium），即经培养已含有细胞产物的培养基， 或连同细胞一并取出，培养结束。
• 另一种是先将细胞和培养 基加入反应器，待细胞生 长至一定密度后，向反应 器内加入诱导剂或病毒等， 经一端时间作用后，将反 应物取出，如产生Namalwa 干扰素和疫苗等。
• 80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。
• （2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在 凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合 成的polymer、糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、 纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种 生物反应器进行大规模培养。
• （3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再 用悬浮的方法培养，操作简培养）
（1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴 附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅 拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分 发挥悬浮培养的一切优点。
理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面 惰性、比重适当（1.030~1.045g/mL）、粒径均一， 在60~250m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、 耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料 充分。
贴壁细胞chip实验原理及步骤-概述说明以及解释
贴壁细胞chip实验原理及步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以是关于贴壁细胞chip的基本介绍和背景信息。
可以参考以下示例进行编写：概述贴壁细胞chip是一种先进的实验平台，用于研究和观察贴壁细胞在特定环境下的行为和反应。
贴壁细胞是指能够附着在固体表面上生长和繁殖的细胞。
在许多生物学和医学研究中，贴壁细胞被广泛应用于细胞生物学、药物筛选、细胞力学以及组织工程等领域。
贴壁细胞chip的概念最早出现在上世纪80年代，其原理基于微流体技术和微型加工技术的结合。
利用微流体通道和微型孔洞，贴壁细胞可以被定向排列在特定位置，从而使得对于细胞的观察和实验更加精确和可控。
与传统细胞培养相比，贴壁细胞chip具有更高的细胞存活率和更好的细胞黏附性能。
贴壁细胞chip的制备需要一系列复杂的步骤和技术，包括微型加工、微流体控制、表面处理等。
通过精确控制微流体的流动和细胞的附着，研究人员可以模拟和重建生物体内的特定环境，以便更好地理解细胞在不同条件下的行为和反应。
贴壁细胞chip在各个领域都有广泛的应用。
在细胞生物学中，它可以用于观察细胞的形态学、生长动力学、迁移和侵袭能力等。
在药物筛选领域，贴壁细胞chip可以用于评估药物的毒性和疗效。
此外，贴壁细胞chip 还可以应用于细胞力学研究，如细胞的拉伸、压缩和应变等。
最近，贴壁细胞chip也被用于组织工程的研究，以构建和培养人工组织。
通过本文对贴壁细胞chip的原理和制备步骤进行详细介绍，希望能够提高读者对贴壁细胞chip的了解，并推动其在科学研究和医学应用中的发展。
同时，本文还将对实验原理的重要性、操作要点以及未来的发展方向等进行探讨和总结。
1.2 文章结构文章结构是指文章整体的组织方式和框架。
一个良好的文章结构可以使读者更好地理解和接受所传达的内容。
本文的结构分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分首先概述了贴壁细胞chip实验的背景和意义，引发读者对该实验的兴趣。
《细胞工程》实验三 贴壁细胞株的传代培养
谢 谢！
0.25g胰酶+100mlPBS+0.02gEDTA
4℃过夜溶解
超净台滤器除菌
0.25%胰酶（ 4℃保存，-20 ℃长期保存）
实验步骤：
弃去培养基，PBS洗2-3次
加胰酶（每瓶0.5ml左右，覆盖细胞即可）
消化适当时间，加完全培养基中和（与胰酶比例2:1）
吸取细胞悬液至离心管中
离心（1200转左右，3分钟）
弃去上液，加入新的培养基
成细胞悬液后，转移到培养瓶中
3. 细胞冻存与复苏
收集细胞时，除需用胰酶消化外，其它同悬浮细胞
4. 作 业
贴壁细胞培养的关键技术流程
4.常见问题
传代频率：每2-3天传代（至细胞长满至80%）
传代比率：1:6-1:8传代
消化条件：室温或者37℃
消化时间：依据不同细胞的贴壁牢固程度而不同 1.肉眼观察：细胞团的产生 2.显微镜观察：细胞变圆，部分漂浮 消化过度：传代后细胞不贴壁
贴壁细胞株的传代培养
贴壁细胞
细胞来源：人乳腺癌细胞：MCF-7
肿瘤相关成纤维细胞：CAF
1.培养条件
培养基：1640培养基（或DMEM）（含10%FBS）
PH： 7.2-7.4（可稍偏酸） 温度： 37℃
孵育箱
气体组成： 5%CO2+95%空气
2. 传 代
0.25%胰酶
配制方法：
细胞贴壁实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。
2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。
3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。
二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。
细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。
细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。
三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。
2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。
2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。
3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。
2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。
5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。
2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。
五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。
2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。
2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。
3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。
贴壁细胞培养
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养
细胞名称：293T，人胎肾细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3～1:4传代，一周2~3次
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁且细胞连接松散时再吹打，将细胞分离成单个后，加培养基混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
第1页，共1页。
细胞生物学实验讲稿 (20)
视频4.3 贴壁细胞的传代培养同学们好！贴壁细胞是必须附着在某一支持物表面才能生长的细胞。
传代培养则是分割细胞培养物进行的再培养。
可以进行细胞克隆，形成细胞株或提供大量一致、持久的实验材料。
实验原理：在贴壁细胞和培养瓶皿之间存在胞外蛋白形成的连接，适当的酶可分解这些胞外蛋白，使细胞得以与培养瓶、皿底部分开。
实验材料和用品：贴壁培养细胞样品，D-Hanks液，胰酶，完全培养液，培培养箱。
养瓶，一次性吸管，超净工作台，倒置显微镜，CO2实验操作环节：检查细胞——清洗细胞——加酶消化——终止消化——收集细胞——加液培养。
详细操作过程如下：培养箱里取出细胞培养瓶，先目测培养液的状况，判1、检查细胞：从CO2断是否染菌；然后用显微镜观察细胞生长状态及铺满度。
传代细胞应生长状态良好，铺满度一般达到80%~90%。
2、清洗细胞：在超净工作台内，将原有培养液倒掉；加入D-Hanks液，晃动培养瓶数次，弃D-Hanks缓冲液；重复洗涤1次，以尽量去除培养液中的血清成分与死亡细胞。
3、加酶消化：加入1mL酶液，晃动培养瓶使酶液覆盖培养物；倒掉；重新加入酶液覆盖细胞；拧好瓶盖，置倒置显微镜下监测消化过程；至细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形时即可终止消化。
如细胞贴壁牢固，可放置37℃培养箱内静置1min，再置倒置显微镜下观察。
4、终止消化：加入新鲜完全培养液，终止消化。
5、收集细胞：用吸管反复吸取培养液，有序地冲洗整个培养瓶皿底部，使细胞脱离瓶底并充分分散；显微观察细胞分散情况，如细胞成团，分散不充分，可在超净台内继续吹打至细胞完全分散。
将分散良好的细胞悬液转入离心管，1500 r/min离心5 min，沉淀细胞。
6、加液培养：吸弃上清，向细胞沉淀里加入适量新鲜完全培养液，用吸管吹打混匀细胞；等分到几个培养瓶皿中；补足培养液；做好标记；放置培养箱内培养。
注意事项1、严格避免微生物污染。
2、控制消化程度。
细胞贴壁生长实验报告
1. 掌握动物细胞培养的基本技术，特别是细胞贴壁生长的过程。
2. 观察细胞在体外培养中的生长和形态变化。
3. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
二、实验原理细胞贴壁生长是指动物细胞在体外培养过程中，细胞会附着在培养皿或瓶壁上，形成单层细胞层。
这一过程依赖于细胞表面的粘附分子与培养皿表面的相互作用。
细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，也是进行细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验的前提。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 小鼠成纤维细胞（或其它动物细胞）- 培养基（DMEM或RPMI-1640）- 10%胎牛血清- 0.25%胰蛋白酶- 灭菌的细胞培养皿- 灭菌的移液器- 灭菌的移液管- 培养箱- 显微镜2. 仪器：- 超净工作台- 离心机- 恒温水浴锅1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，在37℃水浴中快速解冻，然后加入适量的培养基，用移液器吹打均匀，使细胞分散。
2. 制备细胞悬液：将细胞悬液用移液器吹打均匀，确保细胞均匀分布。
3. 接种细胞：将制备好的细胞悬液加入培养皿中，每皿约1×10^5个细胞。
4. 培养：将培养皿放入37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔24小时更换一次培养基。
5. 观察细胞生长：在显微镜下观察细胞的生长和形态变化，记录细胞贴壁、生长和分裂情况。
6. 细胞传代：当细胞长满培养皿底部时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，按照1:10的比例进行传代培养。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中迅速贴壁，形成单层细胞层。
2. 细胞呈梭形、多边形或不规则形，细胞之间紧密连接。
3. 细胞不断增殖，形成致密的细胞层。
4. 经过多次传代培养，细胞生长状况良好。
六、实验讨论1. 细胞贴壁生长是动物细胞培养的基础，对于细胞生物学研究、药物筛选和基因治疗等实验具有重要意义。
2. 细胞贴壁生长过程受到多种因素的影响，如细胞种类、培养基成分、温度、CO2浓度等。
3. 在实验过程中，应严格控制实验条件，确保细胞正常生长。
细胞实验课讲义
实验一实验前准备（4学时）组织细胞培养技术要求无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。
一目的及要求了解细胞培养实验室的设置和设备，掌握培养用品的清洗和消毒灭菌。
二细胞培养实验室的设置及设备1．细胞培养实验室的设置⑴无菌操作区：无菌操作室，净化工作台，无菌操作箱⑵孵育区⑶制备区⑷储藏区⑸清洗和消毒灭菌区2．细胞培养实验室的设备⑴仪器：①显微镜②培养箱③干燥箱④水纯化装置⑤冰箱⑥细胞冻存储存器⑦离心机及天平⑧消毒器⑨滤器⑵培养用器皿①培养器皿：培养瓶培养皿多孔培养板②培养操作有关的器皿：储液瓶吸管加样器⑶器械三培养用品的清洗和消毒灭菌1 目的：去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。
2 步骤2.1 培养用品的清洗（1）清洗：实验后必须及时，彻底清洗，不同的器皿清洗方法和程序不同，应进行分别，分类处理。
①玻璃器皿：用于培养细胞,细胞冻存，培养用液的存放等。
A目的：玻璃表面清洗干净，无油迹，不残存任何毒性物质，而且带适当的电荷（苛性碱清洗剂使细胞表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。
）B 步骤：a刷洗:毛刷和洗涤剂（不宜用力过猛），注意瓶角等部位的洗涤。
洗刷后将洗涤剂冲洗干净，晾干。
b 清洁液浸泡：清洁液（由浓硫酸，重铬酸钾及蒸馏水配置而成）浸泡过夜，或至少为6h以上。
c 冲洗：流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满，倒掉，重复10次以上→蒸馏水漂洗2-3次→三蒸水漂洗一次→烤箱烘干备用。
②胶塞、盖子等步骤：（不能用清洁液浸泡）新胶塞先自来水冲洗，再进行常规清洗。
用过的胶塞、盖子及时浸泡清水中，用洗涤剂刷洗。
针头用洗涤剂洗涤干净→1%稀盐酸浸泡30min，冲洗→蒸馏水漂洗2-3次→三蒸水漂洗1次→晾干⑵包装：消毒前进行包装。
A目的：便于消毒及储存，防止落入灰尘即消毒后再次污染。
B步骤：皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作为包装材料，对培养瓶、滤器、存放培养瓶用储液瓶、吸管、胶塞和盖子等物品的容器瓶口部分做局部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备用。
支原体检测-贴壁细胞培养法
支原体检测(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。
实验基本材料准备：（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。
（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用实验试剂试液配制：(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；(2)二苯甲酰胺荧光染料(3)封片液；(4)1×PBS细胞样品制备及实验步骤（1）待检细胞处理：①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5天；（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。
血小板贴壁培养-概述说明以及解释
血小板贴壁培养-概述说明以及解释1.引言1.1 概述血小板贴壁培养是一种重要的实验技术，通过将血小板与培养基贴壁培养在细胞培养皿表面，使血小板形成单层薄膜，有利于其功能的研究。
血小板作为血液中的重要细胞成分，其功能异常会导致多种疾病的发生。
因此，血小板贴壁培养在疾病机制研究、药物筛选和治疗效果评估等方面具有重要的应用价值。
本文将对血小板贴壁培养的定义、原理、优势及应用进行详细介绍，以期为读者提供更深入的了解。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下几个方面:1. 简要介绍文章的结构，说明文章将从哪些方面展开讨论，包括引言、正文和结论部分。
2. 引导读者对整篇文章的内容有一个整体的了解，以便他们更好地理解和阅读后续的内容。
3. 提醒读者文章各个部分之间的逻辑关系和衔接，使其更容易跟随文章的思路和论证过程。
4. 强调文章的完整性和逻辑性，让读者对文章的组织和内容有一个清晰的认识。
5. 最后,可以陈述作者的写作目的，即通过不同章节的论述来阐明血小板贴壁培养这一技术的重要性和广泛应用。
1.3 目的：本文旨在介绍血小板贴壁培养这一实验技术的定义、原理、优势和应用，以及在疾病研究中的意义。
通过深入探讨血小板贴壁培养的相关知识，旨在增进读者对于该技术的理解，进一步推动相关领域的研究和应用，促进医学科研的发展。
同时，希望通过本文的介绍，能够引起更多人对于血小板贴壁培养在疾病治疗和研究中的重要性的关注，为未来的相关研究提供有益的参考资料。
2.正文2.1 血小板贴壁培养的定义和原理血小板贴壁培养是一种体外实验技术，通过将血小板与细胞培养皿表面贴壁培养，使其在一定的条件下附着生长，有助于模拟体内环境，促进血小板的活化和功能研究。
血小板贴壁培养的原理主要是利用培养皿表面的亲水性和亲油性相结合的特点吸附血小板，使其在培养皿上形成完整的单层薄膜。
一般来说，先将培养皿表面特定涂覆液体，形成亲水或亲油表面，然后加入抗凝血剂处理后的血液，在倒置培养皿的过程中，液体薄层将血小板留置在表面。
贴壁细胞培养
***细胞培养：指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质。
氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
无机盐，培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。
此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg −320 mOsm/kg。
标准培养液的渗透压在此范围内波动。
特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。
向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
缓冲系统大多数细胞所需pH 在7.2 - 7.4。
但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。
成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。
细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。
pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1）NaHCO3溶液：NaHCO3是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。
贴壁细胞培养
贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密2个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
度为3×10PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，2.66，3.994.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO，饱2和湿度条件培养箱内孵育7天。
贴壁培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞贴壁培养的基本方法。
2. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程。
3. 了解细胞培养技术的基本原理和应用。
二、实验原理动物细胞贴壁培养是一种常见的细胞培养方法，适用于大多数动物细胞。
该方法将细胞悬浮于含有营养物质的培养液中，使其附着于培养皿底部或盖玻片上，形成单层或多层细胞。
在适宜的培养条件下，细胞可进行增殖、分化等生物学活动。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶4. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、盖玻片等四、实验方法1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞取出，用预热的DMEM培养基溶解，37℃水浴箱中复温至37℃，加入10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，制成细胞悬液。
2. 细胞接种：将细胞悬液用移液器吸取，接种于培养皿中，每孔加入2ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养。
3. 细胞传代：待细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
按照1:3的比例传代培养。
4. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程：每隔一定时间，观察细胞在培养皿中的生长状态，包括细胞形态、数量、融合程度等。
五、实验结果1. 细胞复苏：冷冻细胞在37℃水浴箱中复温后，逐渐恢复活力，出现典型的细胞形态。
2. 细胞接种：细胞接种后，约24小时开始贴壁，约48小时形成单层细胞。
3. 细胞传代：细胞传代后，生长状态良好，形态、数量、融合程度与原代细胞相似。
4. 细胞生长曲线：观察细胞生长过程，绘制细胞生长曲线，显示细胞呈指数增长。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了动物细胞贴壁培养，观察了细胞贴壁、生长、增殖过程。
2. 细胞贴壁培养过程中，温度、CO2浓度、pH值等环境因素对细胞生长具有重要影响。
本实验中，CO2培养箱的温度设置为37℃，CO2浓度为5%，pH值稳定在7.2-7.4。
贴壁细胞的培养
实验报告三（2015.5.17）贴壁细胞培养姓名：王亚斌班级：生物技术12（1）班学号：2012332860026一、实验目的初步掌握贴壁细胞培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、实验器材倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml 玻璃吸管、酒精灯等三、方法步骤、观察内容1.用倒置显微镜观察细胞，评估细胞(喉癌)生长状态以及确认无细菌和真菌污染。
弃旧培养液：吸除或倒掉培养皿中的旧培养基。
2.漂洗：每个培养皿加1mL PBS清洗单层细胞，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。
3.消化：每个dish加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养皿，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变圆后加适量完全培养液终止。
4.离心：1000rpm、5分钟离心沉淀细胞，去除培养基（含胰酶及EDTA）。
5. 计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度（个/ml）。
取对数生长期于10cm dish 的肿瘤细胞按上述操作消化计数后以2.5×105/孔（5×105/孔）密度铺于6孔板，再用完全培养液补至2 ml/孔。
四、观察结果试验中所添加的防己诺林碱浓度分别为0um/ml 2um/ml 4um/ml6um/ml 8um/ml 10um/ml，下图是各个梯度细胞存亡情况：0um/ml 2um/ml4um/ml 8um/ml10um/ml由上图可以看出，随着防己诺林碱浓度的升高，细胞数目在逐渐地减少，当防己诺林碱浓度在8um/ml的时候细胞形态发生明显变化，从圆球形变为梭形，而且数量有明显的减少，可以看出在这个浓度下细胞开始发生凋亡。
五、分析讨论本次试验在在不同浓度防己诺林碱作用相同时间下，细胞数目和形态有明显不同。
防己诺林碱浓度越高，细胞数目越少，形态也发生变化。
说明一定浓度的防己诺林碱可以起到抑制细胞的繁殖和数目的增长，而达到8um/ml及更高时，细胞开始发生凋亡，10um/ml浓度时，细胞的增殖受到了明显的抑制。
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贴壁细胞培养技术课讲义一、克隆形成及克隆形成抑制试验克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
平板克隆形成实验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
1.准备所需试剂及物品：①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组）②PBS③0.25%胰酶④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。
⑤甲醇：冰醋酸（3:1）⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可）⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC79012.操作：实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
第一天：⑪制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
具体操作如下：①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。
②加入1mlPBS稍摇动瓶，随即吸取弃之（不要直接冲洗细胞）③加入含10 % 血清RPMI-1640培养液6ml冲洗细胞（吸管，轻、均匀，一定要使瓶内细胞充分悬浮！！），再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
④根据计数结果，用10% 血清RPMI-1640培养液将瓶中细胞稀释约为4.0（左右）X 104cell/ml (15ml 离心管中) ，再用加样器吸出0.5ml至1.5Ep管，取10ul样品计数。
注意：此为所有实验用细胞，保存好无污染！⑤取上细胞悬液稀释两次：取上面计数好的细胞悬液1ml至15mL离心管中，再加9ml 10% 血清RPMI-1640培养液，混匀后，再从此细胞悬液中取1ml 加入到小瓶中，加13 ml 15%血清RPMI-1640培养液（具体操作：先加12mL 10%RPMI-1640培养液，再加1ml的小牛血清）mix，充分悬浮。
此时约为300个细胞/ml，准备进行克隆形成实验。
⑫种板：12孔板，每孔用加样枪加 1 ml ⑤稀释好之细胞（注意：种板时要不时轻摇小瓶，适时吹打，保持细胞悬浮状态；种板时要轻缓，不要快速将细胞悬液注入孔中；种板后，不要摇动）。
放入5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育37℃过夜培养第二天实验前，操作台例行消毒（至少提前30分钟）⑬克隆形成及抑制实验①至培养箱中取出过夜培养之细胞，贴壁生长良好。
②加入药物，本实验为5-氟尿嘧啶。
设6组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育4天5-Fu 0 ~5μg/ml具体配制：准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。
每组为两个复孔，多计算一孔，每组试剂用量均*3（以免加量不准，多备）。
2组：5-Fu 30 ul + 培养液270 ul（10ul*3孔=30ul 90ul*3孔=270ul）3组：5-Fu 60 ul + 培养液240 ul4组：5-Fu 90 ul + 培养液210 ul5组：5-Fu 120 ul + 培养液180 ul6组：5-Fu 150 ul + 培养液150 ul混匀后每孔按分组加入100ul配制溶液。
③震荡混匀（加药后不要摇动）④放入CO2孵箱中继续培养4-5天（根据对照空细胞生长情况而定）第五或第六天⑭细胞固定（或省去该步骤）吸去培养液，加入PBS洗涤后，用甲醇:冰醋酸固定10 min。
⑮染色：刘氏染色法①加Liu A Solution (约0.5 ml~0.8 ml) 染色30 s。
②滴加Liu B Solution于A液上面(滴加量约为A液的两倍)，混合，染色1 min。
③水洗，干燥，镜检。
⑯倒置显微镜下计数细胞克隆(>20个细胞记一个克隆)并拍照。
克隆形成抑制率= (对照组细胞克隆数–实验组细胞克隆数)对照组细胞克隆数×100％。
二、MTT比色法MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。
实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。
化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。
商品名噻唑蓝，MTT。
活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。
而死细胞无此功能。
二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm 波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
与其他检测方法如细胞计数法，H3掺入法，LDH法有良好的相关性。
1.准备所需试剂及物品：①MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M，pH7.4）在电磁力搅拌仪上搅拌30min。
用0.22 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。
②10 %新生牛血清的RPMI-1640，0.25%胰酶，DMSO（分析纯）③5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
④ 96孔板2.操作：实验所需时间4天实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。
因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。
具体操作：2块96孔板，MTT与WST两方法同时做。
一块用MTT检测，一块用WST检测（方法基本同MTT法，见后）第一天①接种细胞，取上克隆形成实验④中计数好之细胞4 X 104cell/ml，每孔120 μL，接种到96孔板（为防止边缘效应，96孔板四周每孔加120uL 的PBS或生理盐水）。
每组3个复孔，分6组（见下表）。
每块板加18孔即可。
注意：保存细胞悬浮状态，以免时间过长细胞沉淀影响每孔细胞浓度。
37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育过夜第二天②加入药物40 ul/孔③药物浓度及配制5 – FU 约0——25 μg/ml具体配制：准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。
每组为三个复孔，多计算一孔（以免加量不准，多备）。
两块板（MTT与WST两法）一起配制。
2组：5-Fu 32 ul + 培养液288 ul（4ul*8孔=32ul 36ul*8孔=288ul）3组：5-Fu 48 ul + 培养液272 ul4组：5-Fu 96 ul + 培养液184 ul5组：5-Fu 192 ul + 培养液128 ul6组：5-Fu 288 ul + 培养液32 ul混匀后每孔按分组加入40ul配制溶液。
37℃，5％CO2，饱和湿度条件培养箱内孵育培养48 h。
第四天④每孔加入MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4 h后。
小心吸弃孔内的上清液。
⑤每孔加入150 ul的DMSO，震荡10 min，酶标仪中570 nm 测吸光值。
注意事项：1.选择适当地的细胞接种浓度：一般情况下，96孔板孔内贴壁细胞长满时约有100,000个细胞，但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，进行MTT实验前，对每一种细胞都应测定贴壁率，倍增时间，以及接种细胞数条件下的生长曲线，然后测定实验中每孔接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满，保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
2.避免血清干扰。
呈色后，吸尽空内残存培养液。
否则影响显色。
三、Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂）WST法基本原理：该试剂中含有WST–8［其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐］，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢染料（Formazan dye）。
生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。
因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。
操作：同MTT同时操作取对数生长期的细胞，用含10 %新生牛血清的1640培养液调细胞浓度为4.2×104 cells/mL，每孔120 μL，接种到96孔板.置37 ºC、5 % CO2 孵箱中培养48 h，每孔加入WST试剂10 μL，继续孵育90 min，多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸光度A450nm (激发波长450 nm，参比波长655 nm)，计算细胞的增殖抑制率。
（对照组呈粉红色）增殖抑制率=(对照组吸光度-实验组吸光度)/对照组吸光度×100%。