corning Transwell 孔径大小选择指南

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Transwell实验超详细

Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明白两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模子.关于Transwell这个词该若何解释,查了许多材料也未见精确的注解,我以为可以这么懂得吧,trans这个词根有转移.转运.穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上懂得,这是一类有通透性的杯状的装配,依据Corning公司的Transwell解释书中的介绍,可以以为这是一种膜滤器（Membrane filters）,也可以为是一种有通透性的支架（permeable supports）.更精确地说,Transwell应当是一种实验技巧,这项技巧的重要材料是Transwell小室（Transwell chamber,Transwell insert）,其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不合厂家对Transwell会有不合的定名,而不合型号也可有不合外形,不合大小,依据实验须要,可有不合选择.但无论是何种外形,其症结部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与通俗的孔板是一样.这层膜带有微孔,孔径大小有0.1－12.0µm,依据不合须要可用不合材料,一般经常运用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.下图是一个Transwell装配的纵切面将Transwell小室放入造就板中,小室内称上室,造就板内称下室,上室内盛装上层造就液,下室内盛装基层造就液,高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内,因为聚碳酸酯膜有通透性,基层造就液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研讨基层造就液中的成分对细胞发展.活动等的影响.运用不合孔径和经由不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共造就.细胞趋化.细胞迁徙.细胞侵袭等多种方面的研讨.下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不合细胞其体积不合,具体选择时要斟酌到细胞大小.这里重要谈几种大家经常运用的实验：（1）共造就系统：小于3.0um孔径前提下,细胞不会迁徙经由过程,是以,若研讨不涉及细胞活动才能,不须要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm 以下孔径.经常运用0.4.3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的影响.（2）趋化性实验可用5.0.8.0.12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室细胞的趋化才能.①细胞B对细胞A的趋化感化：将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的趋化感化.②趋化因子对细胞的趋化感化：将细胞种于上室,下室参加某种趋化因子,可研讨该趋化因子对细胞的趋化感化.（3）肿瘤细胞迁徙实验经常运用8.0.12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙才能.（4）肿瘤细胞侵袭实验经常运用8.0.12.0µm膜,道理与肿瘤细胞迁徙实验相似.上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁徙实验不合的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模拟体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要排泄基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解,方可经由过程聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭才能.用于研讨肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强《细胞造就》）：2.1 体内癌细胞侵袭模子2.1.1 皮下移植侵袭模子2.1.2 肌肉内移植侵袭模子2.1.3 腹腔内移植侵袭模子2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模子2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模子2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模子2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模子2.1.8 视网内界膜侵袭模子2.2 体外癌细胞侵袭模子2.2.1 体外静止器官造就法2.2.1.1 半固体造就基单细胞器官造就法2.2.1.2 液体造就基单细胞器官造就法2.2.2 半体外半体内器官造就法2.2.3 单层细胞器官造就法2.2.4 瘤细胞球体器官造就法2.2.4.1 静止球体器官造就法2.2.4.2 扭转动摇球体器官造就法2.2.5 单层细胞侵袭实验模子2.2.6 Transwell侵袭小室测定法可见,Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号,Transwell有多种运用,侵袭实验也有多种办法.所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技巧运用于肿瘤细胞侵袭研讨的一种实验.因为其简略易行.反复性好,因而得到了越来越普遍的运用,但不克不及以为研讨肿瘤侵袭只有Transwell 一种办法.第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁徙实验,其他方面的Transwell运用我不太清晰,是以这里重要谈谈Transwell侵袭实验.1.实验用品：① Transwell小室：多种厂家可供给,论坛里经常运用的是Costar.Corning.BD临盆的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,尚有Boyden lipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.这些厂家供给的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很便利,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是异常贵,24孔板配套的小室,每个价钱约130元,不推举给大家.BD也有已包被好的,价钱不清晰.Coster和Corning公司临盆的小室,是论坛里比较经常运用的,似乎是要本身铺胶,但据说每个小室成本只有40阁下,应当比较合适中国国情.下面是一些战友供给的价钱,具体建议大家接洽代理商咨询.linanping1979战友供给的价钱：coster的24孔板的transwell的价钱是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy 战友供给的价钱：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友供给的BD价钱： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert）,似乎是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy供给的价钱是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人平易近币不到.平均每个20元不到.Transwell小室按照公司的请求,都是一次性运用的.不过其实洗洗泡泡照样可以反复用的.我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很清洁,用前用紫外里外都照30min.sword01战友供给的处理办法：用棉签轻轻擦去胶和不和细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,不和6h,微波,低火10min×2.因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次运用的小室只用来做不须要铺胶的迁徙实验.以前的Chemicon ECM550系列,膜很壮实,擦不坏,可以反复用许多次,但如今的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能反复用一次,真黑啊！许多战友说Costar 和Corning也是可以反复用的,大家可以尝尝.本身没见过,有兴致的可以本身研讨一下.别的,依据论坛战友供给的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理.Transwell小室用事后,可把本来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,如许又可以用了,不过我没用过,有兴致的可以尝尝.maojianwen战友的运用办法： trasnwell小室做一次后,将本来的膜去掉落,从新泡酸,泡酒精,运用前照紫外,然后用密斯用指甲油（留意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上,剪掉落过剩的边沿.再照紫外.② 上层造就液：上层造就液采取无血清造就基,为保持渗入渗出压,需参加0.05%0.2% BSA.③ 细胞：值得留意的是,有侵袭才能的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP2的表达.假如不清晰细胞MMPs的表达情形,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不须要的糟蹋,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,其实不是笔小数量,照样当心为妙.别的,为了让实验成果更显著,可先撤血清让细胞饥饿12－24h,再进行实验.④ 基质胶：经常运用的是人工重构基底膜材料Matrigel,重要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,临盆厂家有BD.美国Collaborative Rsearch 公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司临盆的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不成逆.同样的器械在sigma叫ECM.zhangyong1036战友供给的价钱：BD 公司的matrigel 1500阁下.假如购置的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不须要购置了.⑤ 基层造就液：基层经常运用含5%－10% FBS的造就基,具体浓度依据细胞侵袭力而定,侵袭力衰的细胞可恰当进步FBS浓度.基层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白参加基层造就液作为趋化因子,但小我以为,FBS仍是最合适的.⑥ 细胞造就板：经常运用于Transwell侵袭实验的细胞造就板有6孔板.12孔板.24孔板等,以24孔最经常运用.细胞造就板没什么特别请求,通俗的细胞造就板就可以.但要留意,细胞造就板应当与购置的Transwell小室相配套.⑦ 此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin,FN,Sigma有售),如许做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.许多战友以为这不是必须的,并且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好.假如贴壁不好的话可以尝尝看.linanping1979战友以为,假如造就时光很长（>24h）,细胞照样会掉落到下室里面去,所以有前提的话,最好照样在膜基层涂上FN.别的,值得一提的是,膜基层涂上FN还有必定的趋化感化.2．步调2.1 Transwell小室制备2.1.1 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干.假如须要鄙人室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉落,汲取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话,一班配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上.② 水化基底膜：吸出造就板中残存液体,每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清造就液,37℃,30min.尚有tianjin_glioma战友供给的办法：在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 6080µl (留意体积不成太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶.2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列解释书请求,将小室放入造就板中,在上室参加300µl预温的无血清造就基,室温下静置15－30min,使基质胶再水化.再吸去残剩造就液.2.2 制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.② 消化细胞,终止消化后离心弃去造就液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清造就基重悬.调剂细胞密度至1－10×105,小我以为不要超出5×105.具体实验时采取密度要本身探索,因为不合细胞,其侵袭才能是不合的.小我经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,假如最后用计数法统计成果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时光点,所有的细胞都已穿过,是以起码也要包管在收样的时刻,上室内还要有必定量的细胞消失.小我以为,对比组和处理尽量不要离开计数,因为细胞数量标差别会轻微影响实验成果.假如须要对细胞预处理而不克不及不离开计数,那么计数必定要多反复几回,力图精确,尽量包管对比组和处理组细胞密度一致.2.3 接种细胞① 取细胞悬液100－200µl参加Transwell小室,不合公司的.不合大小的Transwell小室对细胞悬液量有不合请求,请参考解释书.24孔板小室一般200µl.② 24孔板下室一般参加500µl含FBS或趋化因子的造就基,不合的造就板加的量有不合请求,具体请参考解释书.这里要特别留意的是,基层造就液和小室间常会有气泡产生,一旦产朝气泡,基层造就液的趋化感化就削弱甚至消掉了,在种板的时刻要特别留意,一旦消失气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进造就板.③ 造就细胞：通例造就12－48h（重要依癌细胞侵袭才能而定）.时光点的选择除了要斟酌到细胞细胞侵袭力外,处理身分对细胞数量标影响也不成疏忽.以我的课题为例,我运用的药物不但会克制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有显著克制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h 的IC50.用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并没有显著克制,但24h后,克制造用就开端消失了.所以,用这个浓度来做Transwell,处理时光也必须限制在24h内,不然一旦药物克制了细胞增殖或者引诱出凋亡,使处理组细胞数量少于对比组,那么就难以确定穿过膜的细胞比对比组少,毕竟是因为侵袭被克制引起,照样处理后细胞数量本身就比对比组少而引起的了.时光过长不成以,同样,过短也不成,因为细胞内会有必定量的MMPs储存,短时光内可能侵袭才能不会有太大转变.同时从药物被接收进去,进而施展感化,影响MMPs表达,到最后释放到造就基中,还须要一个进程.时光点的选择可尽量长点,也可选择多个时光点研讨时光依附效应,但前提是这个时光规模内细胞数量不克不及有显著变更.别的,我看到细胞在小室内的形态不是正常造就贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会集合成团,所以看到细胞不正常贴壁也没紧要张,是正常现象在造就进程中,膜下会逐渐有少量吝啬泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我碰到过造就一段时光后,膜下消失了大气泡,亏得实时发明,不然效果将异常轻微.是以,小我建议,最好接种细胞后1－2h把造就板从造就箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生.2.4 成果统计检测穿过的细胞数有两种办法：2.4.1 直接计数法2.4.1.1 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉落到下室里面去.如下图：经由过程给细胞染色,可在镜下计数细胞① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 染色：经常运用的染色办法有结晶紫染色.台肦蓝染色.Giemsa染色.苏木精染色.伊红染色等.小我推举采取0.1%结晶紫染色,这种办法有如下优势：(1). 不须要固定细胞,直接染色即可.(2). 配制简略便利.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完整洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值,间接反应细胞数.小我以为这是结晶紫染色最大的优势地点.因为,固然经由精确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以精确掌握,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,乃至细胞成堆,这种情形下就难以计数了,这种情形下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.运用结晶紫染色要留意,染色前要将膜风干,不然可能会染不上.③ 细胞计数：我们运用的是Leica DC 300F正置显微镜进行不雅察和摄影,把Transwell小室反过来底朝上就可清晰看到小室底膜高低室侧附着的细胞.也有许多人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保管,但是如许做小室就成了一次性的了,不免难免有点糟蹋.取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取3－5个视野,也有人用10个,都是随机拔取,小我以为如许选择的视野带有很大的有时性,也会掺进工资影响,特别是计数视野较少的时刻.我拔取16个视野,不是随机选择,而是有固定的地位.我们运用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.如图,蓝色部分暗示膜的大小,白色圆形暗示视野的大小,绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中间部分.如许,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,如许得到成果是比较客不雅和精确的.2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数因为某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上,而是掉落进下室.如下图：2.4.2 间接计数法间接计数法重要用于穿细致胞过多,而无法经由过程计数获得精确的细胞数所采取的办法,与经常运用的MTT实验是同样的道理.2.4.2.1 MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 24孔板中参加500µl含0.5mg/ml MTT的完整造就基,将小室置于个中,使膜浸没在造就基中,37℃ 4h后掏出.③ 24孔板中参加500µl DMSO,将小室置于个中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分消融.掏出小室,24孔板于酶标仪上测OD值.2.4.2.2 荧光试剂检测这类办法一般是与Transwell小室一路出售的,其道理与MTT 法相似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.2.4.2.3 结晶紫检测上文已说过,这里不再赘述,道理与MTT法也是相似的.但结晶紫染色还有个长处,就是染色和脱色的进程其实不影响膜上细胞,在脱色后还可从新染色.这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数.第三节 Transwell的其他运用的实验步调1．Transwell肿瘤细胞迁徙实验进程与Transwell侵袭实验根本一致,不合的只是不须要铺Matrigel.小我以为,因为没有基质胶的阻拦,细胞穿过膜的速度较侵袭实验显著加速,所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁徙实验的密度是1×106.别的,基层造就液的FBS浓度也可恰当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁徙实验的浓度是2.5%.2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞造就步调做了一段时光的原代细胞造就,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友配合商量：(1) 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管掏出,置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）.无Ca 2＋.Mg2＋,无血清的MEM.(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞.(3) 离心后立刻用新颖的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5％胎牛血清.100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC8 medium (Biofluids)冲洗一次.(4) 冲洗事后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活气,若存活率大于90％,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar）,以37°C 5％CO295% 空气含5% 胎牛血清(GibcoBRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC8 medium孵育6~10天.(5) 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电心理实验.显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中心,发展时常彼此慎密衔接成单层细胞片3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁徙实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁徙实验,具体是这么做的：起首把Transwell倒置,在Transwell的PVPF 膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml,50ul),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的造就基（含10%血清）的24孔板内,后在Transwell的闺阁参加细胞（100ul,用含0.1%血清的造就基稀释好本身所需密度）,放入造就箱,1218小时后,掏出Transwell,用棉签擦去PVPF膜接近闺阁那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下不雅察细胞,记数.4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁徙实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于造就箱中均衡1小时后,上室参加100µl用serumfree MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不合浓度的药物,下室参加0.6ml serumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁徙,同时设置响应阴性及阳性对比,置于CO2造就箱中感化8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉落上层未迁徙细胞,显微镜(Olympus, DP50, Japan).下不雅察并摄影,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD 值.克制率盘算公式为：克制率（%）=[(OD值给药组OD值无刺激阴性对比)/（OD值不加药阳性对比 OD值无刺激阴性对比)]×100%.。

细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）

细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

Transwell实验-超详细

Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1.Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

Transwell 使用介绍

1. Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（perme able supports）。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

小室培养实验报告

一、实验目的本研究旨在通过Transwell小室共培养技术，观察细胞间的相互作用及其对细胞迁移能力的影响，为进一步研究细胞间的信号传导和肿瘤转移机制提供实验依据。

二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞系L022. Transwell小室：Corning公司产品，孔径为8.0 μm3. 培养基：DMEM培养基，含10%胎牛血清，青霉素和链霉素各100 U/mL4. 其他试剂：胰蛋白酶、EDTA、无菌水、细胞计数板、酶标仪等三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和L02细胞分别接种于6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后进行实验。

2. Transwell小室共培养：将Transwell小室置于6孔板中，在上室中加入1 mL 含10%胎牛血清的DMEM培养基，下室中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基。

将HepG2细胞接种于上室，L02细胞接种于下室，共培养24小时。

3. 细胞迁移实验：将Transwell小室取出，用棉签轻轻刮去上室中的细胞，用1 mL PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛固定30分钟。

将固定后的Transwell小室放入显微镜下观察，计算上室中迁移至下室的细胞数量。

4. 数据分析：采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，实验数据以均值±标准差表示，采用t检验进行组间比较。

四、实验结果1. HepG2细胞在Transwell小室共培养条件下，迁移至下室的细胞数量明显多于L02细胞，表明HepG2细胞具有较强的迁移能力。

2. 与单独培养的HepG2细胞相比，共培养后的HepG2细胞迁移至下室的细胞数量显著增加，表明L02细胞对HepG2细胞的迁移具有促进作用。

3. 共培养后的HepG2细胞中，与L02细胞直接接触的细胞数量明显多于未接触的细胞，表明细胞间的直接接触对HepG2细胞的迁移具有促进作用。

五、讨论本研究通过Transwell小室共培养技术，观察了HepG2和L02细胞间的相互作用及其对细胞迁移能力的影响。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。

ﻫ２。

3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移实验技术之Transwell Assay

细胞迁移实验技术—Transwell AssayTranswell间接trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0 µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

Transwell小室结构示意图将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

Transwell Assay的应用：共培养体系：小于3.0 μm孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究的内容不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0 µm以下孔径。

常用0.4、3.0 µm。

在共培养过程中，将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

趋化性实验可用5.0、8.0、12.0 µm膜，具体选择哪种孔径根据细胞不同而定。

Transwell 说明书

聚碳酯Transwell嵌套提供从0.1um到12.0um多种孔径。所有的膜都经过处理，使得细胞更易贴附。
Transwell-COL嵌套湿润时透明的，胶原包被的PTFE膜，使得细胞更易贴附和伸展，同时在培养的过程中可以观察。Transwell-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III 型胶原。不同于传统包被技术会形成密封的膜层，康宁专利包被技术使具有生物稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维，从而保持了膜的多孔性。
HTS-96 系统是高通量药物转导研究的理想工具
HTS Transwell系统为机械操作而设计
05
如何使用Transwell® 通透性支持物
使用提示
1. 通透性支持物上的细胞形态和密度受滤膜孔径的影响。 2. 一些孔径大的膜可以容许细胞穿过。 3. 在通透性支持物上生长的细胞的贴附对于起始接种密度很敏感。初次使用应接种不同密
滤膜作为细胞培养介质来源于Grobstein (Nature, 172:860-872; 1953)关于后肾滤膜诱导的研究。经过长年对不同种类细胞的无数次应用，利用通透性支持物进行细胞培养被认为明显优于坚固的，不可透过的细胞生长界面。对于表皮细胞和其他种类的细胞，利用通透性支持物在体外培养使得细胞可以在更为自然的极性条件下生长和研究。同时提高了细胞的分化水平，使得体外生长的细胞在形态和功能上更为接近体内的细胞。还可以进行运输，吸收和分泌等细胞功能的研究，因为在通透性支持物上生长的细胞可以很方便且无干扰的接近其基底面和顶面的细胞膜结构。使用通透性支持物进行细胞培养对于实验细胞学研究是一个无可比拟的工具。
SnapwellTM嵌套
Snapwell嵌套 (U.S. Patent No. 5,272,083) 是经过改良的Transwell嵌套，包括12mm 的经组织培养处理的聚碳酯膜或透明的聚酯膜，以及一个分离环。这些嵌套主要用于运输和电生理研究。一旦细胞长满，分离环固定的膜可以拆卸，并垂直或水平放置，或置于Ussing培养室中。Ussing培养室可以通过哈佛仪器公司购买：

Transwell 说明书

06
如何使用Transwell® 通透性支持物
6．如果必须将细胞从Transwell嵌套中移走，我们建议同时冲洗和培养板。分离试剂要同时加在Transwell嵌套中和孔中，直到细胞脱落。如何从嵌套中移走细胞的Transwell的胰酶消化步骤的实验操作程序，可以在康宁生命科学网站上的技术部分找到。
7．康宁推荐使用8道的微量移液器来从HTS-96系统中转移培养液。这种移液器的设计可以从孔的上部取走培养液和溶液而不伤害细胞层。
8．聚酯和聚碳酯膜上的细胞在固定和染色后，可以使用解剖刀将膜割下做长期保存。 9．胶原包被的PTFE膜易碎，在操作此膜时应格外注意。可以将预先浸湿的纤维膜放置在
胶原膜下，然后使用解剖刀将膜割下。这层纤维膜可对胶原膜起到支持作用。
HTS Transwell-24 培养系统可以提供处理过的0.4um孔径及3.0um孔径的聚碳酯膜，或0.4um 孔径的聚酯膜，具有对细胞贴附，生长和分化极佳的界面。一个一体化的储液板可以减少在培养过程中的液体处理操作（培养液可以一次性快速换掉）。一旦细胞层长满，HTS Transwell-24 嵌套可以转移到一个普通的康宁®24孔培养板上进行实验。
推荐孔径 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 5.0, 8.0, 12.0um 3.0, 5.0, 8.0um 0.4, 1.0, 3.0um
0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um 0.4, 1.0, 3.0um
SnapwellTM嵌套
Snapwell嵌套 (U.S. Patent No. 5,272,083) 是经过改良的Transwell嵌套，包括12mm 的经组织培养处理的聚碳酯膜或透明的聚酯膜，以及一个分离环。这些嵌套主要用于运输和电生理研究。一旦细胞长满，分离环固定的膜可以拆卸，并垂直或水平放置，或置于Ussing培养室中。Ussing培养室可以通过哈佛仪器公司购买：

transwell实验(整理版)

第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

Fig1但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

Fig3应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

transwell小室的孔径

transwell小室的孔径[Transwell小室的孔径] –一步一步回答Transwell小室是一种常用的细胞培养器皿，具有半透膜底部，可以在上下两个室之间进行细胞迁移和穿透分析。

Transwell小室的孔径是指底部的过滤膜孔洞大小，通常用来控制细胞迁移和穿透的分析实验。

本文将一步一步回答关于Transwell小室孔径的问题。

第一步：了解Transwell小室的基本结构和功能Transwell小室是由上下两个室组成的，底部有一层过滤膜，可以用于细胞迁移和穿透实验。

上室通常用于放置待测试的细胞，下室可以放置培养基或其它需要的液体。

细胞通过孔洞在两个室之间进行迁移和穿透，这可以用于研究细胞的侵袭能力以及其他细胞迁移现象。

第二步：认识Transwell小室的孔径控制细胞迁移和穿透Transwell小室的过滤膜底部有许多孔洞，这些孔洞的大小可以根据实验需要进行调节。

孔洞的大小对于控制细胞的迁移和穿透非常重要。

通常，较大的孔洞可以容许细胞更容易地通过，而较小的孔洞则会限制细胞通过。

第三步：了解孔洞大小对细胞迁移和穿透实验的影响孔洞的大小对于细胞迁移和穿透实验有着重要的影响。

较大的孔洞可以模拟细胞在体内更自由地迁移的情况，适用于研究细胞的迁移能力。

较小的孔洞则可以限制细胞的迁移和穿透，适用于研究抑制细胞迁移和穿透的方法。

第四步：选择合适的孔洞大小进行细胞迁移和穿透实验选择合适的孔洞大小取决于研究目的和所需的结果。

如果要研究细胞侵袭能力或者细胞迁移到其他组织的能力，可以选择较大的孔洞。

如果要研究如何抑制细胞迁移或者细胞穿透的能力，可以选择较小的孔洞。

第五步：了解不同孔洞大小的应用领域不同孔洞大小的Transwell小室可以应用于不同的研究领域。

较大孔洞可以用于模拟肿瘤细胞的侵袭和转移。

较小孔洞可以应用于研究抗肿瘤药物的抑制作用，或者研究细胞迁移途径的作用等。

第六步：探讨孔洞大小与细胞迁移和穿透实验的深层联系孔洞大小对于细胞迁移和穿透实验的深层联系与多种因素有关。

transwell小室的孔径

transwell小室的孔径1. 什么是transwell小室？Transwell小室是一种用于细胞迁移和侵袭研究的实验装置。

它由上下两个隔离的腔室组成，通过一个特定孔径的半透膜分隔。

这个孔径的大小对于细胞迁移和侵袭的研究非常重要。

2. Transwell小室的孔径对细胞迁移和侵袭有什么影响？Transwell小室的孔径决定了通过孔隙的细胞尺寸。

通常，较大的孔径会限制较大尺寸细胞通过，而较小尺寸细胞则可以更容易地通过。

在细胞迁移研究中，Transwell小室可以模拟生物体内不同组织间的细胞迁移过程。

通过调整Transwell小室的孔径，可以筛选出具有不同迁移能力和侵袭能力的细胞亚群。

在侵袭研究中，Transwell小室可以模拟肿瘤细胞穿过基底膜进入周围组织的过程。

通过调整Transwell小室的孔径，可以模拟不同程度的肿瘤细胞侵袭能力。

3. 如何选择合适的Transwell小室孔径？选择合适的Transwell小室孔径需要考虑实验目的和研究对象。

以下几点是选择合适孔径的参考因素：3.1 细胞类型不同类型的细胞具有不同的大小和形态特征。

一般来说，细胞直径在10-20μm之间，所以选择一个稍大于细胞直径的孔径可以确保细胞能够通过。

3.2 实验目的如果想要筛选迁移能力较强或侵袭能力较高的细胞亚群，可以选择较小孔径。

较小孔径会限制大部分细胞通过，只有那些具有较高迁移或侵袭能力的细胞才能成功通过。

如果只是想要观察一般迁移或侵袭现象，可以选择稍大一些的孔径。

这样更多类型和尺寸的细胞都可以通过。

3.3 孔隙密度除了孔径大小外，Transwell小室中半透膜上的孔隙密度也会影响细胞迁移和侵袭。

孔隙密度越高，细胞迁移和侵袭的通量就越大。

因此，根据实验需求选择合适的孔隙密度也很重要。

3.4 前期实验结果如果之前已经进行了一些相关实验，可以根据前期实验结果来选择合适的孔径。

比如，如果发现细胞迁移或侵袭较弱，则可以尝试使用较大孔径来促进更多细胞通过。

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell 实验原理与操作步骤实验原理与操作步骤Trans-Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，这个词根有转移、转运、穿过等意思，这个词根有转移、转运、穿过等意思，well well 有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning 公司的Transwell 说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（为这是一种膜滤器（Membrane filters Membrane filters ），也可认为是一种有通透性的支架（），也可认为是一种有通透性的支架（），也可认为是一种有通透性的支架（permeable permeable supports supports））。

更准确地说，Transwell 应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（小室（Transwell Transwell chamber chamber，，Transwell insert insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell 会有不同的命名，会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，而不同型号也可有不同形状，而不同型号也可有不同形状，不同大小，不同大小，根据实验需要，需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，这层膜带有微孔，孔径大小有0.10.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate polycarbonate membrane membrane）。

corning Transwell 孔径大小选择指南

transwell实验(整理版)

第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

Fig1但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

Fig3应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

transwell不得不注意的几点

transwell不得不注意的几点这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。

transwell细胞迁移

迁移实验（cell migration assay）实验材料（1）Transwell小室，孔径8μm (Corning) ,细胞培养板24孔板 ,培养板应当与购买的Transwell 小室相配套（2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养,PBS，2.5%FBS（3）固定液：4%多聚甲醛固定液或者甲醇（4）染色液：Giemsa染液或结晶紫染色（5）其他：小镊子，棉棒1材料准备：无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.2接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；②24孔板下室一般加入600µl含2.5%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了。

③种板，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

④培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。

24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.3染色计数①取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无菌的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。

② 0.1%结晶紫染色20 min，或Giemsa染色（5－10min，室温0.5h），用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。

③400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

不同实验中transwell小室的选择和使用

不同实验中transwell 小室的选择和使用Transwell 小室在细胞实验中很常用,共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同.根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为 6 孔板小室、12 孔板小室和24 孔板小室以及和transwell 皿配套的75 mm 直径的小室；根据孔径的不同,从小孔径到大孔径又分为0。

4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。

小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,应该选择3μm 以下的孔径。

例如共培养实验和caco —2 细胞转运模型实验。

共培养实验：常用0。

4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响.caco—2 细胞转运模型:选用0。

44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10 个/mL,每孔0.5 mL 的密度接种在Transwell 内培养21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液.在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求.涉及到细胞迁移的实验：要用5。

0、8。

0、12。

0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。

趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室,可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用,将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

细胞迁移实验：常用8。

0、12。

0μm 膜，上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子,细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。

corning Transwell 孔径大小 选择指南

Transwell实验 超详细

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小室培养实验报告

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