PCR引物设计原理
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• 反向引物 （Reverse primer）：处于目的DNA双链下游的引
物。如用于测序，则读出 DNA负链从下游到上游的反向序列。
Primer Premier 5.0 软件设计引物
• 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的 软件
• 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、 primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif
PCR引物设计原理
➢ PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的 延伸
Fra Baidu bibliotek
变性
在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性 温度在94-95℃下进行，这也是Taq DNA聚 合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不 受到过多损失时能耐受的最高温度。
Search criteria 窗口：多种参数可以调整。
Search stringency应选High。 GC含量一般是40－60％。
其它参数默认就可以。
Manual→Search parameters →人工搜索参数设置窗
Search progress 窗口中显示Search Completed→OK键
➢ 正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented） 及反向互补（reverse complemented ）。
➢正向（As is）
➢反向（reversed）
➢互补（complemented）
Enzyme
• 软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq 或 Map，分别 以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存 结果。
• 计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差 不能大于10 ℃；引物的 Tm 值一般为5070℃。
• 这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环 可有效变性。
（6）3’末端
➢ 3’末端的性质非常关键。
➢ 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最 好不要A，或AA等多聚A；
（3）重复或自身互补序列：
• 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复 性。
（4）上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任 何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二 聚体。
• 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端 都不能和 其他任何引物互补。
（5）解链温度（Tm 值）：
➢ 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的 引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。
• 当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大 降低；
• 当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成， 所以一般 PCR 反应中，引物3’末端的碱基最好选 T、C、G，而不选A。
• 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的 差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下， 也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引 发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′端最好选择T。？？
• 哺乳动物 DNA 为模板时，至少进行25个循 环才能得到足够量的扩增产物。一般为3033个循环。
引物设计要点
（1）碱基组成： • GC含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之
间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚 嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有 二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度： • 引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸 长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如 上游引物为19bp，下游引物为24bp等。
有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模 板 DNA 彻底变性的概率。
对于 GC 含量为 55% 或更低的线性 DNA 模 板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95℃ 变性 45s。
引物和模板DNA 的复性
• 复性温度（退火温度）至关重要！！！ • 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，
扩增效率会非常低； • 退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从
Motif
Primer
点击 Search，进行引物搜索
Primer Length常设置在18－30bp, 短了特异性不好，长了没有必要。 当然有特殊要求的除外，如加个酶 切位点什么的。
PCR Product size最好是100－ 500bp之间，小于100bp的PCR产 物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模 糊，不好看。至于上限倒也不必要 求苛刻。
而导致非特异性DNA片段的扩增； • 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的
Tm值低 3-5 ℃下进行。 • 最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-
10 ℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条 件的优化。
引物的延伸与循环数目
• 对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-
78 ℃，时间约为1min。
搜索出来的引物，按Rating排序， 逐个送Oligo软件里评估。 当然，搜索出的引物，其扩增产 物很短，你可以不选择它。
引物3端≥2个A或T,或引物内部 连续的G或C太多，或引物3端 ≥2个G或C，这样的引物应作 为次选，没得选了就选它。 对于上述引物，如果其它各项指 标还可以，可在引物末端去掉一 个不满意的或加上一个碱基，看 看引物的评估参数有没有变好点。 结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。 引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主 窗口显示结果。
（7）5’端序列添加限制性酶切位点：
一些概念
• 有意链（Sense strand），正义链（positive strand），编码链（coding strand）；无意链 （anti-sense strand），负义链（negative strand），模板链（template strand）
• 正向引物 （forward primer）：处于DNA双链上游的引物。 如用于测序，则从5’→3’方向读出 DNA正链的序列。
物。如用于测序，则读出 DNA负链从下游到上游的反向序列。
Primer Premier 5.0 软件设计引物
• 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的 软件
• 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、 primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif
PCR引物设计原理
➢ PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的 延伸
Fra Baidu bibliotek
变性
在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性 温度在94-95℃下进行，这也是Taq DNA聚 合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不 受到过多损失时能耐受的最高温度。
Search criteria 窗口：多种参数可以调整。
Search stringency应选High。 GC含量一般是40－60％。
其它参数默认就可以。
Manual→Search parameters →人工搜索参数设置窗
Search progress 窗口中显示Search Completed→OK键
➢ 正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented） 及反向互补（reverse complemented ）。
➢正向（As is）
➢反向（reversed）
➢互补（complemented）
Enzyme
• 软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq 或 Map，分别 以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存 结果。
• 计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差 不能大于10 ℃；引物的 Tm 值一般为5070℃。
• 这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环 可有效变性。
（6）3’末端
➢ 3’末端的性质非常关键。
➢ 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最 好不要A，或AA等多聚A；
（3）重复或自身互补序列：
• 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复 性。
（4）上下引物的互补性：
• 一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任 何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二 聚体。
• 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端 都不能和 其他任何引物互补。
（5）解链温度（Tm 值）：
➢ 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的 引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。
• 当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大 降低；
• 当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成， 所以一般 PCR 反应中，引物3’末端的碱基最好选 T、C、G，而不选A。
• 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的 差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下， 也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引 发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′端最好选择T。？？
• 哺乳动物 DNA 为模板时，至少进行25个循 环才能得到足够量的扩增产物。一般为3033个循环。
引物设计要点
（1）碱基组成： • GC含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之
间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚 嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有 二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度： • 引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸 长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如 上游引物为19bp，下游引物为24bp等。
有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模 板 DNA 彻底变性的概率。
对于 GC 含量为 55% 或更低的线性 DNA 模 板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95℃ 变性 45s。
引物和模板DNA 的复性
• 复性温度（退火温度）至关重要！！！ • 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，
扩增效率会非常低； • 退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从
Motif
Primer
点击 Search，进行引物搜索
Primer Length常设置在18－30bp, 短了特异性不好，长了没有必要。 当然有特殊要求的除外，如加个酶 切位点什么的。
PCR Product size最好是100－ 500bp之间，小于100bp的PCR产 物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模 糊，不好看。至于上限倒也不必要 求苛刻。
而导致非特异性DNA片段的扩增； • 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的
Tm值低 3-5 ℃下进行。 • 最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-
10 ℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条 件的优化。
引物的延伸与循环数目
• 对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-
78 ℃，时间约为1min。
搜索出来的引物，按Rating排序， 逐个送Oligo软件里评估。 当然，搜索出的引物，其扩增产 物很短，你可以不选择它。
引物3端≥2个A或T,或引物内部 连续的G或C太多，或引物3端 ≥2个G或C，这样的引物应作 为次选，没得选了就选它。 对于上述引物，如果其它各项指 标还可以，可在引物末端去掉一 个不满意的或加上一个碱基，看 看引物的评估参数有没有变好点。 结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。 引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主 窗口显示结果。
（7）5’端序列添加限制性酶切位点：
一些概念
• 有意链（Sense strand），正义链（positive strand），编码链（coding strand）；无意链 （anti-sense strand），负义链（negative strand），模板链（template strand）
• 正向引物 （forward primer）：处于DNA双链上游的引物。 如用于测序，则从5’→3’方向读出 DNA正链的序列。