不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测
菌种鉴定⽅法及⼿段真菌细菌检测菌种鉴定⽅法及⼿段真菌检测/细菌检测菌种鉴定⼀般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA⽚段，上GeneBank 或者Eztaxon对⽐即可。
⼀般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌。
常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和理化特性。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利⽤能⼒、各种代谢反应、酶反应和⾎清学反应等。
⾃动鉴定BIOLOG鉴定系统以微⽣物对不同碳源的利⽤情况为基础，检测微⽣物的特征指纹图谱，建⽴与微⽣物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微⽣物与数据库参⽐，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应⽤于⾷品和饮品企业、环保、海洋⽣物/⽔产品、制药、农业微⽣物、⽣物治理、化妆品、临床等领域的微⽣物鉴定试验中。
拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及⾰兰⽒阴性菌、⾰兰⽒阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微⽣物。
分⼦⽣物学鉴定应⽤分⼦⽣物学⽅法从遗传进化⾓度阐明微⽣物种群之间的分类学关系，是微⽣物分类学研究普遍采⽤的鉴定⽅法。
科标⽣物检测中⼼拥有微⽣物菌种分类鉴定的分⼦⽣物学实验室，配有PCR仪、⾼速冷冻离⼼机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
可采⽤核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。
API细菌鉴定API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种⽣化反应，已可鉴定超过600种的细菌。
鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的⽣理⽣化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参⽐，得出鉴定结果。
可应⽤API50CH系列、API20E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进⾏鉴定。
革兰氏染色法实验报告共5篇
革兰氏染色法实验报告篇一革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，可用于鉴定细菌的类型和形态。
以下是一份革兰氏染色法的实验报告范例，包含实验目的、实验原理、实验步骤、实验结果和结论等部分。
实验目的： 1.了解革兰氏染色法的原理和步骤； 2.掌握细菌的革兰氏染色方法； 3.观察细菌在革兰氏染色中的反应，并进行鉴定。
实验原理：革兰氏染色法是根据细菌细胞壁的特性而设计的一种染色方法。
细菌细胞在染色过程中会根据细胞壁的结构不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，含有较多的革兰氏染色阳性物质（如染色时用的紫檀碱），因此在染色后会呈现紫色。
革兰氏阴性菌细胞壁较薄，不含有革兰氏染色阳性物质，染色时使用的碘酒（革兰氏碘化酒）能使它产生复合革兰氏染色阳性物质（碘靛紫），再用酒精脱色，再用洋红着色，使其产生颜色变化，最终呈现红色。
实验步骤： 1.准备好菌液：选取需检测的菌株，用无菌盘收集少量菌落，用少量生理盐水悬浮，制备菌液。
2.片玻璃片：在清洁无菌玻璃片上滴上一滴菌液。
3.烘干：将玻璃片架起，自然风干。
4.固定：将玻璃片的细菌涂片在火焰上迅速烘烤，使其牢固地附着在玻璃片上。
5.染色：将烘烤后的玻璃片放入紫檀液中，染色1分钟。
6.脱色：用酒精脱色10-30秒。
7.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。
8.再染：将片浸入碘靛紫溶液中，染色1-2分钟。
9.脱色：用酒精脱色10-30秒。
10.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。
11.观察：利用显微镜观察和比较细菌的形态和染色情况。
12.记录：记录细菌的形态、颜色等观察结果。
实验结果：通过观察细菌的形态和颜色，我们可以得出以下结论：•革兰氏阳性菌在染色后呈现紫色；•革兰氏阴性菌在染色后呈现红色。
结论：革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，通过染色反应可以初步鉴定细菌的类型。
本次实验中，我们成功地使用革兰氏染色法对细菌进行了染色和鉴定，观察到了不同细菌的染色结果，并且将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
2024年高级卫生专业技术资格考试微生物检验技术(094)(正高级)试题及答案指导
2024年高级卫生专业技术资格考试微生物检验技术(094)(正高级)复习试题及答案指导一、多项选择题（本大题有30小题，每小题1分，共30分）1、以下哪些属于微生物检验技术中的分离纯化方法？A. 气体培养法B. 稀释平板法C. 分光光度法D. 纯化培养法答案：BD解析：微生物检验技术中的分离纯化方法主要包括稀释平板法、纯化培养法等。
气体培养法是针对某些需要特殊气体环境的微生物进行培养的方法，而分光光度法是一种用于定量分析微生物的方法，不属于分离纯化方法。
因此，选项B和D是正确的。
2、以下哪些是微生物检验技术中常用的鉴定方法？A. 形态学观察B. 生化试验C. 培养基试验D. 分子生物学技术答案：ABCD解析：微生物检验技术中常用的鉴定方法包括形态学观察、生化试验、培养基试验和分子生物学技术。
形态学观察通过显微镜观察微生物的形态结构；生化试验通过检测微生物的代谢产物来鉴定微生物；培养基试验通过使用选择性培养基来筛选和鉴定微生物；分子生物学技术如PCR、基因测序等，用于检测微生物的遗传信息。
因此，选项A、B、C和D都是微生物检验技术中常用的鉴定方法。
3、在微生物实验室中，对于培养基的选择至关重要，下列哪些因素需要考虑？A. 微生物的营养需求B. 培养基的成本效益C. 目标微生物的生长环境（如pH值）D. 是否含有抗生素作为生长抑制剂E. 所有选项都正确【答案】E 【解析】选择合适的培养基时，需要综合考虑微生物的营养需求、培养基的成本效益、目标微生物的生长环境以及是否含有抗生素等抑制剂来控制非目标微生物的生长。
因此，所有给出的选项都是正确的考虑因素。
4、关于细菌的革兰氏染色法，下列陈述哪些是正确的？A. 革兰阳性菌能够保持结晶紫的颜色B. 革兰阴性菌会被酒精脱色并接受番红染料的颜色C. 革兰氏染色的第一步是使用碘液固定细胞壁D. 所有的球菌都是革兰阳性菌E. 革兰氏染色可以用于区分大多数细菌，并提供有关其细胞壁结构的信息【答案】A、B、E 【解析】革兰氏染色是一种常用的细菌鉴别方法，其中革兰阳性菌能够保持初次使用的结晶紫染料的颜色，而革兰阴性菌会被酒精脱色，并接受第二次使用的番红染料的颜色。
细菌的革兰氏染色法实验报告
细菌的革兰氏染色法实验报告摘要：革兰氏染色法是一种常用的细菌分类和鉴定方法。
通过本实验，我们成功地利用革兰氏染色法对不同类型的细菌进行了染色，并观察到了细菌在显微镜下的形态特征。
实验结果表明，革兰氏染色法能够有效地将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类，为细菌的鉴定提供了重要的依据。
引言：细菌是一类微生物，广泛存在于我们周围的环境中。
了解细菌的分类和鉴定对于研究细菌的生理特性、病原性以及药物敏感性具有重要意义。
革兰氏染色法是一种常用的细菌分类和鉴定方法，通过染色后细菌在显微镜下的形态特征，可以将其分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
材料与方法：1. 细菌培养物：本实验选择了两种细菌培养物，分别是革兰氏阳性菌A和革兰氏阴性菌B。
2. 革兰氏染色试剂：结晶紫、碘液、酒精、脱色剂、苏木精。
3. 显微镜：用于观察染色后的细菌样品。
实验步骤：1. 取两株细菌培养物，分别进行涂片制备。
2. 将制备好的涂片用结晶紫染色液浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。
3. 加入碘液浸泡1分钟，然后用蒸馏水冲洗。
4. 用酒精滴加在涂片上，使其脱色，然后用蒸馏水冲洗。
5. 加入脱色剂浸泡30秒至1分钟，然后用蒸馏水冲洗。
6. 将涂片用苏木精染色液浸泡1分钟，然后用蒸馏水冲洗。
7. 涂片晾干后，放入显微镜下观察。
结果与讨论：经过革兰氏染色法染色后，我们观察到了明显的差异。
革兰氏阳性菌A呈紫色，而革兰氏阴性菌B呈红色。
根据革兰氏染色法的原理，我们可以解释这种差异。
革兰氏染色法中，结晶紫染色液首先染色细菌细胞的细胞壁。
革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胞外多糖和胞外蛋白质，能够吸附结晶紫，形成紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，胞外多糖和胞外蛋白质含量较少，无法吸附结晶紫，因此在后续的染色步骤中无法保留紫色，最终呈现红色。
革兰氏染色法的原理是通过染色后细菌在显微镜下的形态特征来进行分类和鉴定。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，呈紫色，在显微镜下观察到细胞形态较大、圆润。
3种方法对1株临床疑难菌的鉴定及结果比较
㊃4221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n,M a y2024,V o l.21,N o.9㊃论著㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.09.0083种方法对1株临床疑难菌的鉴定及结果比较*许一丹1,谢成彬2,苏喆2,王频佳1ә1.成都医学院检验医学院临床微生物学教研室,四川成都610500;2.四川省妇幼保健院/成都医学院附属妇女儿童医院检验科,四川成都610045摘要:目的通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA L D I-T O F M S)㊁16S r R N A序列分析和全基因组测序(WG S)对从临床标本中分离的1株疑似盐单胞菌进行菌种鉴定,比较3种方法的鉴定结果㊂方法采用MA L D I-T O F M S对待测菌进行蛋白质图谱收集,通过比对图谱特征峰实现菌种鉴定;对菌株进行16S r R N A基因测序,将测序结果与数据库比对;待测菌WG S后进行序列比对分析,具体包括使用A N I m和A N I b2种方法计算平均核苷酸一致性(A N I)以及与基因组分类数据库(G T D B)进行比对;基于全基因组序列中的16S r R N A序列和看家基因序列构建系统进化树,以及基于C O G和K E G G功能对基因组进行聚类分析㊂结果 MA L D I-T O F M S对待测菌株的鉴定结果是H a l o m o n a s h a m i l t o n i i;经16S r R N A序列分析,发现待测菌株与3种盐单胞菌(H a l o m o n a s h a m i l t o n i i㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i和H a l o m o n a s j o h n s o n i a e)的相似度均> 99%,且相似度差异非常小,因此无法进行准确的菌种鉴定;基于WG S的基因序列比对㊁系统发育树㊁聚类分析均显示待测菌与H a l o m o n a s s t e v e n s i i的亲缘关系更为接近㊂结论3种方法对分离的1株疑难菌的菌种鉴定结果有差异,MA L D I-T O F M S的菌种鉴定操作更加方便㊁快速,非常适用于临床检验工作;基于WG S的细菌鉴定更适合用于遗传特征相似的菌种之间的鉴别㊂关键词:细菌鉴定;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;16S r R N A序列;全基因组测序中图法分类号:R446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)09-1224-06I d e n t i f i c a t i o n o f a c l i n i c a l l y d i f f i c u l t b a c t e r i a l s t r a i n b y t h r e em e t h o d s a n d c o m p a r i s o n o f r e s u l t s*X U Y i d a n1,X I E C h e n g b i n2,S U Z h e2,WA N G P i n j i a1ә1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y,S c h o o l o f M e d i c a l L a b o r a t o r y S c i e n c e,C h e n g d u M e d i c a lC o l l e g e,C h e n g d u,S i c h u a n610500,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e,S i c h u a nP r o v i n c i a l M a t e r n i t v a n d C h i l d H e a l t h C a r e H o s p i t a l,C h e n g d u,S i c h u a n610045,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e MA L D I-T O F M S,16S r R N A s e q u e n c e a n a l y s i s,a n d w h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g (WG S)w e r e a p p l i e d t o i d e n t i f y a s t r a i n o f s u s p e c t e d H a l o m o n a s i s o l a t e d f r o m a c l i n i c a l s p e c i m e n a n d t o c o m-p a r e t h e r e s u l t s o f t h e t h r e e m e t h o d s.M e t h o d s MA L D I-T O F M S w a s u s e d t o c o l l e c t p r o t e i n p r o f i l e s o f t h e b a c t e r i a t o b e t e s t e d,a n d t h e i d e n t i f i c a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s w a s a c h i e v e d b y c o m p a r i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c p e a k s o f t h e p r o f i l e s.T h e16S r R N A g e n e s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d o n t h e b a c t e r i a t o b e t e s t e d,a n d t h e s e-q u e n c i n g r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h d a t a b a s e.B a s e d o n t h e g e n o m i c s e q u e n c e s o b t a i n e d f r o m WG S,a c o m-p a r a t i v e a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d,i n c l u d i n g t h e c a l c u l a t i o n o f A v e r a g e N u c l e o t i d e I d e n t i t y(A N I)b y A N I m a n d A N I b,a n d t h e c o m p a 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a t e s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n c o u l d n o t b e p e r f o r m e d.T h e g e n e s e q u e n c i n g c o m p a r i s o n b a s e d o n WG S, p h y l o g e n e t i c t r e e a n d c l u s t e r a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e b a c t e r i u m w a s m o r e c l o s e l y r e l a t e d t o H a l o m o n a s s t e v e n s i i.C o n c l u s i o n T h e r e s u l t s o f t h e t h r e e m e t h o d s o n t h e s t r a i n i d e n t i f i c a t i o n o f t h e i s o l a t e a r e d i f f e r e n t.*基金项目:四川省大学生创新创业训练计划项目(S202013705085);成都医学院研究生创新基金项目(Y C X2022-03-17);成都医学院检验医学院自然科学基金(J Y Z K202206);四川省妇幼保健院菁英人才科研启动项目(Z C6.16)㊂作者简介:许一丹,女,在读研究生,主要从事细菌致病性的研究㊂ә通信作者,E-m a i l:p i n j i a w o n g@f o x m a i l.c o m㊂MA L D I-T O F M S i s m o r e c o n v e n i e n t a n d f a s t f o r s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n,w h i c h i s v e r y s u i t a b l e f o r c l i n i c a l t e s-t i n g;WG S-b a s e d b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n i s p a r t i c u l a r l y u s e f u l f o r d i s t i n g u i s h i n g g e n e t i c a l l y v e r y s i m i l a r s p e-c i e s.K e y w o r d s:b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n; MA L D I-T O F M S;16S r R N A s e q u e n c e; w h o l e-g e n o m e s e q u e n-c i n g细菌的准确鉴定是细菌学中最重要㊁最具挑战性的问题之一,也是抗感染治疗的基础㊂细菌鉴定的方法有很多种,常用的包括形态学鉴定㊁生化鉴定和分子生物学鉴定等㊂由于基于生化鉴定原理的自动微生物鉴定仪早在1985年就进入我国临床实验室,并从20世纪90年代至今广泛用于临床标本的检测,因此细菌生化鉴定是目前临床最常用的细菌鉴定方法[1-3]㊂但由于细菌的种类繁多,存在多样性和复杂性,选择的生化鉴定特征可能难以代表全部被鉴定菌株,特别是临床少见菌㊁罕见菌和未明确分类的细菌,生化鉴定往往难以发挥作用㊂本课题组前期从临床标本中分离出1株细菌,经生化鉴定疑似为盐单胞菌(H a l o m o n a s),但无法准确鉴定其菌种㊂针对这株疑难菌,本研究将利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(M A L D I-T O F M S)㊁16S r R N A序列分析和基于全基因组测序(W G S)的基因组序列比对3种方法进行菌种鉴定,并对鉴定结果进行比较㊂现将结果报道如下㊂1材料与方法1.1菌株来源2018年7月从四川省妇保健院新生儿重症监护室的1例患儿血液标本中分离出1株革兰阴性菌,生化鉴定结果显示该菌疑似为盐单胞菌属的细菌,菌株编号为18071143㊂1.2主要试剂和仪器哥伦比亚血琼脂平板(郑州博赛生物技术股份有限公司),A u t o f m s1000全自动微生物质谱检测系统(郑州安图生物工程股份有限公司)㊂1.3方法1.3.1菌株培养将受试菌株18071143接种于哥伦比亚血琼脂平板,35ħ培养24~48h,再次转种于哥伦比亚血琼脂平板,35ħ培养18~24h,挑取纯菌,按照实验要求进行后续的MA L D I-T O F M S检测㊁16S r R N A测序分析以及基因序列比对㊂1.3.2 MA L D I-T O F M S检测按照仪器说明书操作[4]步骤进行操作㊂1.3.316S r R N A序列分析16S r R N A基因测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成㊂将测序所得的16S r R N A序列输入E Z B i o C l o u d细菌16S鉴定数据库(h t t p s://w w w.e z b i o c l o u d.n e t/i d e n t i f y)[5-6],进行序列相似性分析㊂物种水平鉴定以99%核苷酸相似度为标准[7]㊂1.3.4基于WG S的基因组序列比对 WG S由北京百迈客生物科技有限公司完成㊂将与菌株18071143的16S r R N A基因序列相似性>99%的模式菌株作为平均核苷酸一致性(A N I)分析的对比菌株㊂利用美吉生物云工具(h t t p s://c l o u d.m a j o r b i o.c o m/ p a g e/t o o l s/)进行A N I分析,使用A N I m和A N I b2种方法计算A N I值㊂此外,将菌株18071143的基因组序列与基因组分类数据库(G T D B)[8]进行比对,以获得菌种信息㊂1.3.5系统发育分析基于WG S中的16S r R N A 序列和看家基因(d n a G,f r r,i n f C,n u s A,p g k,p y r G, r p l A,r p l B,r p l C,r p l D,r p l E,r p l F,r p l K,r p l L,r p l M, r p l N,r p l P,r p l S,r p l T,r p m A,r p o B,r p s B,r p s C,r p s E, r p s I,r p s J,r p s K,r p s M,r p s S,s m p B,t s f),选择在G T-D B中种属水平上与菌株18071143最接近的20株菌,通过M E G A7.0软件采用近邻相接法构建系统进化树㊂1.3.6基因组聚类分析通过S p e a r m a n相关性分析,在C O G和K E G G功能上对基因组进行聚类分析,评估菌株18071143和与其在16S r R N A基因序列相似性>99%的模式菌株之间基因组水平上的亲缘关系㊂相关系数越接近于1,表明样本间相关性越好㊂2结果2.1 MA L D I-T O F M S检测MA L D I-T O F M S对菌株18071143的鉴定未出现低分辨和无法鉴定的情况,鉴定结果为H a l o m o n a s h a m i l t o n i i㊂2.216S r R N A序列分析菌株18071143的16S r R N A 基因序列的G e n B a n k登录号是M Z097522.1㊂该菌株的16S r R N A序列经与细菌16S鉴定数据库比对后,得到相似度较高的细菌,相似性排名前5的细菌见表1,其中菌株18071143与H a l o m o n a s h a m i l t o n i i㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i㊁H a l o m o n a s j o h n s o n i a e的相似度均>99%㊂表1菌株18071143的16S r R N A序列比对结果排名细菌名称菌株G e n B a n k登录号相似性(%) 1H a l o m o n a s h a m i l t o n i i W1025AM94139699.93 2H a l o m o n a s s t e v e n s i i S18214A J T S010*******.86㊃5221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n,M a y2024,V o l.21,N o.9续表1 菌株18071143的16S r R N A 序列比对结果排名细菌名称菌株G e n B a n k 登录号相似性(%)3H a l o m o n a s jo h n s o n i a e T 68687AM 94139999.574H a l o m o n a s m a g a d i e n s i s 21M 1X 9215098.855H a l o m o n a s a qu a m a r i n a D S M 30161A J 30688898.352.3 基因组序列比对 菌株18071143的全基因组序列的G e n B a n k 登录号是C P 078120.1㊂通过A N I m 和A N I b 2方法分别计算菌株18071143与H a l o m o n a s h a m i l t o n i i ㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i 和H a l o m o n a s jo h n s o n i a e 3种盐单胞菌的A N I 值㊂2种算法均显示菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的亲缘关系最近(A N I b =0.9751,A N I m=0.9786)㊂将菌株18071143与G T D B 数据库进行比对后发现,与菌株18071143最为相似的细菌是H a l o m o n a ss t e v e n s i i ,见表2㊂故基于WG S 的序列比对分析,菌株18071143被鉴定为H a l o m o n a s s t e v e n s i i㊂2.4 系统发育分析 菌株18071143基因组中预测到6个16S r R N A 和31个看家基因㊂基于16S r R N A 和看家基因分别构建系统进化树,见图1和图2㊂16S r R N A 和看家基因的进化树均显示,菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的亲缘关系最为接近㊂图1 菌株18071143与20株盐单胞菌的16S r R N A系统的进化树图2 菌株18071143与20株盐单胞菌的看家基因系统的进化树㊃6221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .9表2 菌株18071143与G T D B 数据库对比结果排名参考基因组I DG T D B 物种分类1G C F _000275725.1H a l o m o n a s s t e v e n s i i2G C F _002442575.1H a l o m o n a s h y d r o t h e r m a l i s 3G C F _900129255.1H a l o m o n a s m e r i d i a n a2.5 基因组聚类分析 基于的C O G 和K E G G 功能对基因组进行聚类分析,菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的相关系数分别是0.9935和0.7037,相关性最高,因此菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的亲缘关系最为接近㊂见图3㊂注:A 是基于C O G 功能分类的结果;B 是基于K E G G 功能注释的结果㊂图3 菌株18071143与H a l o m o n a s h a m i l t o n i i ㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i ㊁H a l o m o n a s jo h n s o n i a e 的聚类分析3 讨 论作为常规细菌鉴定方法的生化试验虽操作简单,但需要一定的培养时间,且对于一些细菌只能达到区分菌属的程度㊂MA L D I -T O F M S 技术是近年来快速发展的一种用于鉴定多肽㊁蛋白质的新型软电离质谱技术,由于其具有快速㊁准确㊁高通量㊁易于操作和重复性好等优点,该技术越来越广泛地取代常规方法成为细菌鉴定的一线工具[9-11]㊂16S r R N A 基因测序被认为是一种成熟的分类学研究方法[12],特别适用于MA L D I -T O F M S 数据库中无数据细菌的鉴定[12-15]㊂另外,需要进行生物信息学分析,且成本较高的基于WG S 的菌种鉴定因其方法的高分辨率,使之成为传染病诊断和感染源追踪的一项非常有前景的技术[16]㊂在基因组水平上,A N I 分析被认为是菌种鉴定的神器㊂普遍认为亲缘关系较近的种群间A N I 值应为70%~75%,而定义一个种的A N I 值需要达到95%~96%[17-18]㊂A N I 值一般可以通过2种运算方法得出:一种是以B L A S T n 方法为基础(A N I b),另一种以MUMm e r 运算法则为基础(A N I m )㊂A N I 具有方便㊁快速㊁分辨率高的优点,近年来被广泛用于细菌鉴定㊂Z HO U 等[19]通过高通量测序技术和A N I 识别一个名为A V 208的革兰阳性球菌菌株㊂J I N 等[20]利用A N I b 和全基因组测序的系统发育分析,纠正奈瑟菌属中错误的菌种分类,并指出G e n B a n k 中的N e i s s e r i a m u c o s a (n =13)和N e i s s e r i a s i c c a (n =16)应使用A N I b 和高分辨率系统发育分析重新进行分类㊂本研究结果发现,MA L D I -T O F M S ㊁16S r R N A基因测序和WG S 对菌株18071143在菌属层面的鉴定一致性达到100%,但在菌种水平的鉴定上却存在差异㊂MA L D I -T O F M S 的鉴定结果为H a l o m o n a sh a m i l t o n i i ㊂16S r R N A 基因序列分析最为相似的细菌也是H a l o m o n a s h a m i l t o n i i ,但菌株18071143与3种盐单胞菌的序列相似度均>99%,且不同种之间的分辨率低于0.8%㊂根据美国临床和实验室标准协会(C L S I )指南[21]要求,本次16S r R N A 基因序列分析无法在菌种水平上鉴定细菌㊂基于WG S 的A N I 分析发现,菌株18071143更倾向于是H a l o m o n a ss t e v e n s i i ,这一点也从该菌的基因组序列与G T D B 数据库的比对结果㊁与相似菌的系统发育以及基因组的聚类分析得到证实㊂以往有学者指出,16S r R N A 序列分析的主要问题是无法准确确定物种[22-23]㊂尽管16S r R N A 基因序列被广泛用于分类学和系统发育学的研究,但在区分密切相关的菌株和物种时有一定的局限性,尤其是没有基于与公共数据库中序列的相似性来明确识别物种的普遍认可的阈值[24]㊂MA L D I -T O F M S 也存在同样的问题㊂MA L D I -T O F M S 方法操作简便,非常适用于临床工作,但仪器数据库的完备性也会影响到结果的可靠性[25]㊂细菌基因组包含其全部的遗传信息,确定基因组序列成为了解细菌生物学特性与功能特征的基础和前提㊂细菌全基因组序列信息能够对细菌的鉴定提供最高的分辨率㊂㊃7221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .9本研究利用3种方法对临床常规方法无法鉴定到种的盐单胞菌进行了菌种鉴定,结果显示基于WG S的鉴定结果更加准确㊂MA L D I-T O F M S方法简单㊁快速,适用于临床常规工作;16S r R N A序列分析分辨率较差,对于某些疑难菌难以准确鉴定;WG S 分辨率高,适用于具有相似遗传学特征的菌种之间的鉴别㊂因此,在临床工作中若分离到罕见菌株和疑难菌株,建议使用WG S技术获取细菌全基因组序列信息,以全面了解该菌的生物学特性与功能特征㊂参考文献[1]翁秀清.全自动血培养仪与微生物鉴定仪在临床血液检验中的应用效果以及敏感性㊁准确性差异研究[J].中国医疗器械信息,2023,29(7):53-55.[2]蒲玉熙,次仁央金,嘎松卓嘎,等.高原地区两种微生物鉴定系统对临床常见病原菌鉴定的一致性分析[J].中国实用医药,2023,18(7):97-99.[3]宋玲玲.微生物鉴定仪在检测妊娠晚期孕妇阴道B族链球菌感染率中的应用价值[J].医疗装备,2023,36(11): 65-67.[4]沈玲,白欢,李丽,等.A U T O F M S1000质谱鉴定系统对临床实验室常见菌株鉴定能力的评估[J].现代检验医学杂志,2020,35(3):100-102.[5]S H I N S Y,P A R K S,MO O N J M,e t a l.C o m p o s i t i o n a lc h a n g e s i n t h e g u t m i c r o b i o t a o f r e s p o nde r s a n d n o n-r e-s p o n d e r s t o p r o b i o t i c t r e a t m e n t a m o n g p a t i e n t s w i t h d i a r-r h e a-p r e d o m i n a n t i r r i t a b l e b o w e l s y n d r o m e:a p o s t H o c a-n a l y s i s of a r a n d o m i z e d c l i n i c a l t r i a l[J].J N e u r og a s t r o e n-t e r o l M o t i l,2022,28(4):642-654.[6]R A I A,U P P A D A J,G U P T A D,e t a l.N e o r o 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m o n g v a g i n a l m i c r o b i o t a i n h e a l t h y a n d af f e c t-e d s o w s w i t h e n d o m e t r i t i s[J].R e s V e t S c i,2022,143:33-40.[13]A L N A K I P M E A,R HO UMA N R,A B D-E L F A T A H EN,e t a l.D i s c r i m i n a t i o n o f m a j o r a n d m i n o r s t r e p t o c o c c i i n c r i m i n a t e d i n b o v i n e m a s t i t i s b y MA L D I-T O F M S f i n-g e r p r i n t i n g a n d16S r R N A g e n e s e q u e n c i n g[J].R e s V e tS c i,2020,132:426-438.[14]S U L A I MA N I M,M I R A N D A N,S I M P S O N S.MA L D I-T O F m a s s s p e c t r o m e t r y a n d16S r R N A g e n e s e q u e n c e a-n a l y s i s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f f o o d b o r n e c l o s t r i d i u m S p p [J].J A O A C I n t,2021,104(5):1381-1388.[15]C HU R C H D L,C E R U T T I L,GÜR T L E R A,e t a l.P e r-f o r m a n c e a n d a p p l i c a t i o n o f16S r R N Ag e n e c y c l e s e q u e n-c i n g f o r r o u t i n e ide n t if i c a t i o n o f b a c 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革兰氏阴性菌检测
选择培养基(selective medium)选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。
根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。
一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物；利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。
另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，例如，在培养基中加入数滴10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而由混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铵，可以抑制革兰氏阳性细菌和绝大多数革兰氏阴性细菌的生长，而革兰氏阴性的伤寒沙门氏菌(Salmomnella typhi)可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿(brilliant green)或结晶紫(crystal vio1et)，可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，从而达到分离革兰氏阴性细菌的目的；在培养基中加人青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生长，而将酵母菌和霉菌分离出来。
现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种(些)抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。
粪大肠菌群标准检验方法及注解GB 7918.3-87化妆品微生物标准检验方法粪大肠菌群及注解中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法粪大肠菌群UDC 668：576 .85.07(GB7918.3－87)Standard methods of microbiological examination for cosmeticsFecal coliforms粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。
不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法
1．革兰阴性双球菌
2．氧化酶阳性
3．触酶阳性
4．BAP上不溶血，整个菌落可推动
1．丁酸盐阳性
2．吲哚酚醋酸盐阳性
脑膜炎奈瑟菌
1．革兰阴性双球菌
2．氧化酶阳性
3．BAP上呈透亮不溶血菌落
γ-谷氨酰氨Байду номын сангаас酶阳性
强传染性，必须在生物安全柜中处理
乳糖奈瑟菌
1．革兰阴性双球菌
2．氧化酶阳性
3．BAP上呈浅灰色不溶血菌落
不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法
细菌名称
鉴定方法附加
确证试验
备注
布氏杆菌属
1．细小革兰阴性球杆菌
2．氧化酶阳性
3．触酶阳性
4．麦康凯琼脂上不生长
1．尿素阳性
2．吲哚阴性
3．BAP上不溶血
强传染性，必须在生物安全柜中处理；
通常分离自无菌组织和体液；
需送往LRN参考实验室
空肠弯曲菌
1．革兰阴性杆菌，似海鸥翅膀状排列
2．CO2环境下在BAP或巧克力琼脂上菌落呈凹陷生长
3．氧化酶阳性
4．触酶阴性
5．麦康凯琼脂上不生长
1．吲哚阴性
2．不溶血
3．特殊的漂白剂气味
如果菌落不典型，需用鸟氨酸阳性确认
土拉热弗朗西斯氏菌
1．细小革兰阴性杆菌或球杆菌
2．氧化酶阴性
3．触酶阴性或弱阳性
4．巧克力琼脂上缓慢生长，BAP上不生长
β-内酰胺酶阳性
2．氧化酶阳性
3．触酶阳性
4．镜下穿梭样运动
1．马尿酸盐阳性
2．吲哚酚醋酸盐阳性
分离自粪便标本有意义，42℃下在
弯曲杆菌选择培养基上生长
人心杆菌
革兰氏染色法的原理和步骤
革兰氏染色法的原理和步骤革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
这种染色方法是由丹麦微生物学家Christian Gram于1884年首次提出的。
革兰氏染色法的原理是利用细菌细胞壁的特性来区分不同类型的细菌。
细菌细胞壁的主要成分是多聚糖和肽聚糖，革兰氏氏染色法通过不同的处理步骤，使得细菌细胞壁的特性在染色过程中显现出来。
革兰氏染色法的步骤如下：1. 准备细菌涂片：首先，从培养基中取一小块细菌培养物，涂抹在玻璃片上，形成细菌涂片。
2. 固定：将细菌涂片在空气中晾干，然后用火焰快速烘烤，使细菌固定在玻璃片上。
3. 染色：将固定的细菌涂片放入革兰染色液中浸泡几分钟。
革兰染色液主要由紫晶染料和碘酒组成。
紫晶染料可以渗透进入细菌细胞壁，而碘酒可以固定染色物质。
浸泡时间过长会导致革兰氏阳性菌染色过度。
4. 洗涤：用蒸馏水冲洗细菌涂片，以去除多余的染色剂。
5. 差染：将细菌涂片放入酒精-醋酸溶液中浸泡几秒钟，然后用蒸馏水冲洗。
这一步是为了除去革兰氏阴性菌表面的染色剂。
6. 洗涤：再次用蒸馏水冲洗细菌涂片。
7. 对比染色：将细菌涂片放入苏木精染色液中浸泡几分钟。
苏木精染色液会将革兰氏阴性菌染成红色。
8. 洗涤：用蒸馏水冲洗细菌涂片。
9. 干燥：将细菌涂片放入通风处晾干。
通过上述步骤，革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，而革兰氏阴性菌在染色后呈红色。
革兰氏染色法的原理基于细菌细胞壁的差异。
细菌细胞壁是由多聚糖和肽聚糖组成的。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，含有大量的多聚糖和肽聚糖，而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有较少的多聚糖和肽聚糖。
在染色过程中，革兰染色液中的紫晶染料可以渗透进入细菌细胞壁，并与细菌细胞内的多聚糖和肽聚糖结合，使革兰氏阳性菌呈紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，紫晶染料不能渗透进去，因此在差染过程中被苏木精染色液染成红色。
革兰氏染色实验报告
革兰氏染色实验报告实验目的：通过革兰氏染色方法，对细菌进行染色，观察染色后细菌的形态及染色结果，判断细菌的革兰氏阴性或阳性。
实验原理：革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，通过改变细菌胞壁结构的颜色，使得细菌可以在显微镜下通过染色观察。
该方法通过染色剂的作用，区分细菌的革兰氏阴性和阳性特征：- 革兰氏阳性细菌：由于细菌细胞壁富含的脂多糖层和多肽聚糖层的作用，革兰氏阳性细菌可以在染色过程中保留紫色的结晶紫染色剂，因此染色后呈紫色。
- 革兰氏阴性细菌：由于细菌细胞壁含有较多的脂脂多糖层，革兰氏阴性细菌在染色过程中难以保留紫色的结晶紫染色剂，而在除色过程中被洗去染色，再与著色剂（如蔗糖胺粉红色）发生反应，呈红色。
实验步骤：1. 取一片洁净的载玻片，用酒精灯或培养基灶烧热消毒。
2. 取一株已培养好的细菌涂抹于玻片上，并用酒精灯烘烤进行固定。
3. 将玻片放入蒸馏水中冲洗，以去除多余的细菌。
4. 滴加结晶紫染色液，静置1分钟，然后用蒸馏水冲洗。
5. 滴加碘酒，静置1分钟，然后用蒸馏水冲洗。
6. 滴加脱色剂（乙醇或乙醚），直到滴下的溶液不再有紫色为止，然后用蒸馏水冲洗。
7. 快速滴加蔗糖胺粉红色著色剂，静置1分钟。
8. 用蒸馏水冲洗玻片，使其不再出现颜色溢出。
9. 化干净后，将载玻片放在显微镜下，使用100倍至1000倍的放大倍数进行观察。
实验结果：经过革兰氏染色处理后，染色后的细菌呈现不同的颜色和形态，根据染色结果可以判断细菌的革兰氏阴性或阳性。
革兰氏阳性细菌染色后呈紫色，常见的如链球菌和葡萄球菌；革兰氏阴性细菌染色后呈红色，常见的如大肠杆菌和沙门氏菌。
实验结论：通过革兰氏染色方法，我们可以对细菌进行染色，观察细菌的形态及染色结果，并根据染色结果判断细菌的革兰氏阴性或阳性。
这对于细菌的鉴定及临床诊断具有重要意义。
实验结果表明，染色后的细菌呈现明显的颜色差异，根据形态及染色结果可以准确判断细菌的革兰氏染色特性。
革兰氏阴阳性菌鉴别方法
革兰氏染色基本原理：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G--表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏阳性菌（G+）革兰氏阴性菌（G-）革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G--两大类群，常用的复染液是番红。
溶液配制：1.结晶紫染色液：(1)甲液：结晶紫2g，95%乙醇20ml。
简速格兰阳性球和革兰阴性杆菌鉴定的流程
简速格兰阳性球和革兰阴性杆菌鉴定的流程格兰阳性球菌和革兰阴性杆菌鉴定是微生物学实验室中常见的实验项目，用于确定细菌的分类和鉴定。
The identification of Gram-positive cocci and Gram-negative rods is a common experiment in microbiology laboratories, used to determine the classification and identification of bacteria.首先，从含有细菌的培养物中取一小部分放在玻璃片上做涂片。
First, take a small portion of the bacterial culture and make a smear on a glass slide.然后将涂片用优雅氏染色或其他合适的染色方法染色，以使细菌在显微镜下可见并能被鉴定。
Then, stain the smear using the Gram stain or other suitable staining methods to make the bacteria visible and identifiable under the microscope.观察涂片下的细菌形态、颜色和结构，并根据它们的特征来确定它们属于格兰阳性球菌还是革兰阴性杆菌。
Observe the morphology, color, and structure of the bacteria on the smear, and determine whether they belong to Gram-positive cocci or Gram-negative rods based on their characteristics.格兰阳性球菌的特征通常包括球形的形态、紫色或蓝色的颜色，以及厚壁细胞的结构。
临床检验中的微生物快速鉴定技术考核试卷
15.以下哪些技术常用于细菌耐药性检测？（）
A. PCR
B. MALDI-TOF MS
C.色谱法
D.纸片扩散法
16.以下关于微生物快速鉴定技术的说法，哪些是正确的？（）
A.仅限于鉴定细菌
B.在鉴定前不需要进行样本的前处理
C.通常需要结合多种技术进行综合判断
D.比传统方法更耗时
17.以下哪些方法适用于真菌的快速鉴定？（）
D.细菌培养
8.微生物快速鉴定技术不包括以下哪项？（）
A.色谱技术
B.免疫学技术
C.生物传感器技术
D.电子显微镜下的细胞计数
9.以下哪个不是临床检验中微生物鉴定的目的？（）
A.确定病原体
B.指导抗生素治疗
C.研究微生物的生长特性
D.监测感染流行趋势
10. API系统在微生物鉴定中的主要优点是什么？（）
四、判断题（本题共10小题，每题1分，共10分，正确的请在答题括号中画√，错误的画×）
1.微生物快速鉴定技术可以完全取代传统的培养方法。（）
2.PCR技术只能检测DNA。（）
3.MALDI-TOF MS在鉴定微生物时，不需要进行细菌的培养。（）
4.16S rRNA基因序列分析可用于所有微生物的鉴定。（）
五、主观题（本题共4小题，每题5分，共20分）
1.请简述MALDI-TOF MS技术在临床微生物鉴定中的应用原理及其主要优势。
2.描述16S rRNA基因序列分析在微生物鉴定中的作用，并讨论其在临床检验中的应用限制。
3.结合临床实践，说明微生物快速鉴定技术对于抗生素合理使用的重要性。
4.请列举三种常用的微生物耐药性检测方法，并分析它们各自的优缺点。
革兰氏阴阳性菌鉴别方法
革兰氏染色基本原理：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G--表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏阳性菌（G+）革兰氏阴性菌（G-）革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G--两大类群，常用的复染液是番红。
溶液配制：1.结晶紫染色液：(1)甲液：结晶紫2g，95%乙醇20ml。
革兰染色的应用和原理
革兰染色的应用和原理1. 介绍革兰染色是一种常用的细菌染色技术，广泛应用于细菌分类和鉴定中。
它通过染色方法将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类，有助于快速鉴定和确定细菌的形态、结构和代谢特性。
2. 应用革兰染色方法在医学、食品卫生、环境监测等领域有着广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：•医学诊断：革兰染色是常见的临床微生物检查方法之一，用于检测分离出的不同类型的细菌。
通过染色，医生可以快速确定细菌的类型，有助于选择合适的治疗方法。
•食品安全：在食品卫生领域，革兰染色也被广泛应用。
通过对食品和环境中的细菌进行染色，可以迅速鉴定食品是否受到细菌污染，从而采取相应的措施来保障食品安全。
•环境监测：在环境科学研究中，革兰染色是常用的细菌检测方法之一。
通过染色可快速判断环境样品中是否存在细菌，为环境治理和监测提供重要参考。
3. 原理革兰染色的原理基于细菌细胞壁的不同结构。
革兰阳性细菌：革兰阳性细菌细胞壁主要由厚而致密的胞壁层和细胞膜组成。
胞壁层由脂多糖和多聚糖组成，能吸附革兰染色剂的酮胺基，形成革兰染色的复合物。
革兰阴性细菌：革兰阴性细菌细胞壁较薄，由脂多糖和少量的多聚糖组成。
它们没有吸附革兰染色剂的酮胺基，因此无法形成革兰染色的复合物。
基于上述原理，进行革兰染色时需要以下步骤：1.将待染菌涂抹到玻片上。
2.用碘酒固定细菌，使其不易溶解。
3.涂抹革兰染色剂，染色剂呈碱性，可以附着在革兰阳性细菌胞壁上。
4.进行洗涤，将多余的染色剂洗去。
5.涂抹洗净后的脱色剂，脱色剂为酒精或醚类物质，用于去除革兰染色剂。
6.再次洗涤，去除脱色剂。
7.最后用孔雀绿等染色剂染色，使革兰阴性细菌呈现绿色。
8.最后将玻片晾干，使用显微镜进行观察。
4. 优点和局限性4.1 优点•快速鉴定：革兰染色方法操作简单，几步操作就能快速鉴定细菌类型，节省时间。
•可视化结果：通过显微镜观察染色后的细菌形态及结构，有助于对细菌进行直观的判断和描述。
4.2 局限性•良性和阴性分类：革兰染色只能将细菌分为革兰阳性和革兰阴性两类，对于一些变异菌和特殊菌株的鉴定有一定限制。
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不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法
病原学检测对于感染性疾病的诊断和治疗非常重要，因此，临床微生物实验室在医院感染治疗和控制中起到关键作用。
目前，大部分临床微生物实验室采用商品化的鉴定系统鉴定临床分离的细菌，但是对于一些临床不常见的细菌，传统的鉴定方法(如革兰染色、生化反应等)更加实用有效。
因此，本文参照CLSI M32-A2文件列举了一些临床不常见细菌的特征和鉴定方法，希望对临床微生物实验室的常规工作有所帮助。
一. 不常见革兰阴性菌
1. 布氏杆菌属
布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染。
人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。
布氏杆菌病广泛分布世界各地，我国部分地区曾有流行。
布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6
个种，20个生物型。
中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。
布氏杆菌属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状(见图1)。
血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。
此细菌不在麦康凯琼脂上生长。
布氏杆菌属细菌尿素阳性，触酶、氧化酶阳性，而吲哚阴性。
由于该菌属细菌具有强的传染性，因此一旦怀疑应送往LRN B级参考实验室进行确认。
2. 空肠弯曲菌
空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。
其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。
空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。
空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年发现了不少耐药菌株及多重耐药性菌株。
空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状。
菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。
有荚膜，不形成芽胞。
微需氧菌，在含2.5～5% 氧和10% CO2的环境中生长最好，在正常大气或无氧环境中均不能生长，最适温度为37～42℃。
本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36 小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。
空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素。
可还原硝酸盐，氧化酶和触酶为阳性。
能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和v-p试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。
3.“HACEK”群细菌
HACEK是指一组革兰阴性杆菌：嗜血杆菌属(H)、放线杆菌属(A)、人心杆菌属(C)、艾肯菌属(E)、金氏杆菌属(K)。
这组微生物的共同特征是易导致心内膜感染，约占全部感染性心内膜炎的5-10%，它们是导致正常人群(非静脉药物滥用者)心
内膜炎的常见原因之一。
所有这些微生物都是口咽部正常菌群的一部分，生长缓慢、喜好富二氧化碳环境。
除心脏瓣膜感染，HACEK菌还导致其他感染：菌血症、各类脓肿、腹膜炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、化脓性关节炎、骨髓炎、尿路感染、伤口感染、脑脓肿、牙周感染。
嗜血杆菌属因在生长过程中需含有生长因子X(氯化高铁血红素)和(或)V(辅酶Ⅰ)的血液琼脂而得名。
本属细菌为革兰阴性小杆菌，无动力，具有明显的多型性，不形成芽胞，需氧或兼性厌氧。
流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属最重要的病原菌，镜下呈球杆状、长杆状、少数为丝状。
粘液型菌株有荚膜，毒力较强。
菌落一般为光滑型，若与金黄色葡萄球菌在BAP上共同孵育，则在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，这叫做“卫星现象”。
原因是金黄色葡萄球菌能合成较多的V因子，促进流感嗜血杆菌的生长。
放线杆菌属为革兰阴性杆菌，有时呈球形、椭圆形(见图3)。
兼性厌氧菌，无动力，无荚膜，在含血清或血液的培养基上生长良好，37℃培养2～3天后形成直径约1mm的菌落。
在肉汤培养液中生长呈颗粒状。
对人或动物致病的有伴放线放线杆菌、林氏放线杆菌和马驹放线杆菌。
伴放线放线杆菌因常见于人类的某些放线菌病的病灶中而得名。
但也可单独致病，如一些亚急性细菌性心内膜炎是由本菌引起的。
本属细菌能还原硝酸盐，不产生吲哚，尿素阳性。
人心杆菌是心杆菌属内唯一的种，是人的鼻腔和咽喉部的正常菌群，可引起心内膜炎、尿路感染、脑脓肿和牙周炎等疾病。
大部分菌株可从血液中分离而来，有的菌株也可从脑脊液中分离而来。
人心杆菌为无鞭毛、无荚膜、无芽孢，并具有多形性的革兰阴性杆菌(见图4)。
革兰染色不易被脱色，单个存在或成对排列，有时形成短链或呈葡萄状排列。
该菌为兼性厌氧菌，某些菌株在初代分离时需要CO2，在生长过程中要有一定湿度，在干燥环境中不生长；在35～37 ℃均可生长，但在22 ℃或42 ℃均不生长。
该菌在BAP上不溶血，经24h 培养后菌落很小，48h 后可达1mm，菌落为圆形、凸起、光滑、有光泽而边缘整齐，某些菌株的菌落可长入培养基中，使培养基表面琼脂凹陷。
麦康凯琼脂上不生长。
人心杆菌氧化酶阳性，触酶阴性，吲哚阳性，不还原硝酸盐。
啮蚀艾肯菌是革兰阴性多形性球杆菌(见图5)，有一种漂白剂的气味，兼性厌氧，是口腔和许多其他粘膜表面的正常菌群。
啮蚀艾肯菌是人咬伤后发生的蜂窝织炎的病原体，它也是已发现静脉药物滥用者软组织感染和心内膜炎主要病原体。
它也能导致各种各样的肺部感染(如脓胸、肺炎、败血症栓子)，类似严格偏性厌气菌。
大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎患者有潜在的生物瓣膜病变。
与其他HACEK菌不同，大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎与静脉药物滥用有关。
啮蚀艾肯菌在培养基上凹陷生长，吲哚阴性，鸟氨酸阳性。
金氏杆菌属是革兰阴性球杆菌，有3个种：
金氏金氏杆菌、产吲哚金氏杆菌、去硝化金氏杆菌，只有金氏金氏杆菌引起心内膜炎。
与其他HACEK菌不同，金氏杆菌感染进展相当迅速。
金氏金氏杆菌在。