流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理

FL-2(-)
FITC 单标
FL2 - %FL1
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
PE 单标
FL-2(PE)
FL1 - %FL2
FL-2(PE)
After Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(-)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
4、 流式图和流式结果
流式数据的存储：列表模式（list mode），记录了每个细 胞的所有参数的信息。
Event #
1 2 3 4 ……
FSC
100 110 90 95
SSC
500 505 480 490
FL1 FITC 10 700 720 15
FL2 PE 650 700 670 720
设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异 性荧光，避免假阳性的结果。
001
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002来自百度文库
流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电
倍增管电压越大，电子信号越强；电压越
小，信号越弱。 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度 处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相
对对照组。
B、同型对照 Isotype Control
多色实验中，弱表达抗原必须设置FMO作为gating control。
双标试验中，单染管相当于FMO对照。 Treg检测中CD4/CD25/IgG即为FMO对照。
粘连 细胞 死细胞
死细胞 或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
阈值：Threshold/Trigger
阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。 FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。
非特异性染色
抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。
同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同 种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非 特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。
实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体; 同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。
– FlowJo – WinMDI
伪彩图(Pseudo-color Plot)
等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
– FCS Express
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。
―FSC前向散射光：反映细胞的体积大小和活力； ―SSC侧向散射光：反映细胞的颗粒度。
CD4 APC-Cy7
CD8a Alexa Fluor 700
SSC-A
FSC-A
双参数散点图比直方图更“可靠”
有的抗原荧光太弱，或背景荧光太强，双参数散点图更能反 映真实情况。
设门技巧：多用矩形门
粘连细胞的去除
Uncompensated
PE-Medianneg < PE-Medianpos
Compensated
PE-Medianneg= PE-Medianpos
Overcompensated
PE-Medianneg > PE-Medianpos
FL2-no stain
FL1-FITC stain
FL1-FITC stain
C、 单标对照 Single Staining Control
由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。 多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。
FL1 530/30 FL2 585/42
FITC 发射谱
PE 发射谱
Wavelength
补偿调节方法：
FL-2(PE)
荧光素分子 FITC PE 激发光波长 （nm） 490 488 发射光波长 （nm） 520 575 中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白
PerCP
APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
490
650 496/546 496/546 495 650
侧向散射光SSC
SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
荧光信号
自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； 特异荧光：荧光素分子发出的的荧
光比自发荧光强很多倍。
前向散射光FSC
激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，FSC强度是d/λ的函数( λ表示波长，d指细胞大小)， 所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。
FL1-FITC stain
D、 FMO对照
多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照， FMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。
Fluorescence Minus One 荧光减一对照
(-) PE
FITC
PE
补偿调节引起背景荧光增强。 颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
Event # 1 2 3 4
FL1 FITC
10 700 720 15
……
Counts
0…………10…………100…………1000
FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
675
660 670 767 519 665
多甲藻叶绿素蛋白
别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不 能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上 的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA 定量染料。
5%
32%
默认阈值
升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
激发波长 Excitation wavelength
＜
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）； 500-549nm：绿色荧光（Green）； 550-584nm：黄色荧光（Yellow）； 585-615nm：橙色荧光（Orange）； 616-700nm：红色荧光（Red）； ≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。 标记抗体的荧光素
FL2
FL1
散点图和伪彩图
等高图和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里 面的曲线代表细胞数目越多。
密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。
假三维图和三维图
Counts
SSC →
流式结果
十字门 线性门
流式分析常见问题
FSC和SSC很重要
FL3 APC 4 6 10 15
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
– MACSQuantify – CellQuest
• 单参数直方图(Histogram)
• 双参数数据显示：
散点图(Dot Plot)
– Diva
流式分析的是单细胞，粘连细胞影响实验结果。
―周期分析时，双联体细胞的去除； ―流式分选时，粘连细胞的去除。
G0/ G1双联体细胞
G2/M细胞
FL2-H
FL2-H
FL2-A
FL2-W
FL2-W
FL2-W
电脉冲信号的面积A、高度H和宽度W
Width = Area/Height
Pulse Height
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
Volts
Pulse Area
0 Pulse Width
Time
Creation of a Voltage Pulse
Quantification of a Voltage Pulse
A、H和W的组合去粘连细胞
5、流式对照的设置
A、空白对照 Negative Control
细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染色的 细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。