第13章 流式细胞分析技术
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术（Flow cytometry）是一种用于检测和分析细胞的高通
量技术，能够同时分析多种细胞参数。
其原理是通过将单个细胞悬浮液通
过一个细长管道，然后通过激光束照射细胞并记录细胞与激光的相互作用，最后用多个光学信号检测器来收集和分析这些信息。
细胞排序是流式细胞技术的第二步。
流式细胞仪可以根据不同的细胞
参数，如大小、形状和荧光强度等对细胞进行排序。
这种方法可以根据用
户的需求，选择性地分离和收集一些细胞亚群，进一步进行下一步的实验
分析。
数据分析是流式细胞技术的最后一步。
流式细胞仪会收集大量的数据，包括荧光信号的亮度和位置等信息。
这些数据通常以直方图的形式呈现，
可以通过专业的分析软件进行解析和统计分析。
数据分析可以帮助研究人
员确定细胞亚群的比例、亚群之间的差异和相似性等信息。
流式细胞技术在许多领域中被广泛应用。
在免疫学研究中，流式细胞
技术可以用来分析和鉴定免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，以及它们的功能状态和表达的分子。
在癌症研究中，流式细胞技术可以用
来检测肿瘤细胞和癌症干细胞，以便进行诊断和预后评估。
在生物医药研
究中，流式细胞技术可以用来评估各种药物对细胞表型、凋亡和增殖等影
响的研究。
综上所述，流式细胞技术是一种强大的细胞分析方法，能够同时检测
和分析多种细胞参数。
这种技术的原理和方法相对复杂，但其在生物医学
研究和应用中具有广泛的应用前景。
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
流式细胞分析技术
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流式细胞发展史
1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人， 他试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞。 （从固定式细胞 分析-流动式） 1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红 细胞光学自动计数器。 同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏形。 1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细 胞成分；二是结合测量值对细胞分类。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出 细胞分选的方法。
Laser
FSC
荧光
SSC
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细胞散色光信号
Forward Angle Light Scatter (FSC)
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
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90 Degree Light Scatter (SSC)
Laser
FALS Sensor
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流动室（Flow Chamber）
流动室由样品管、鞘液管 和喷嘴等组成，常用光学 玻璃、石英等透明、稳定 的材料制作，是液流系统 的心脏。 样品管贮放样品，单个细 胞悬液在液流压力作用下 从样品管射出；
鞘液由鞘液管从四周流向 喷孔，包围在样品外周后 从喷嘴射出。
Injector Tip
Laser
FALS Sensor
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流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代最先进的细胞 定量分析技术
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理流式细胞技术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的高效分析方法。
其原理基于光学技术和细胞自动排序系统，可以对大量细胞进行快速、高效的分析和分类。
以下是流式细胞技术的原理介绍。
首先，细胞需要经过处理步骤，使其适合流式细胞技术的操作。
这包括剥离细胞、制备单细胞悬浮液、染色等。
常用的染色方法包括细胞外标记和细胞内染色。
细胞外标记是将特定的抗体或荧光标记结合于细胞表面的分子上；而细胞内染色则是将特定的抗体或荧光染料引入细胞内。
接下来，染色后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，由涡旋泵将细胞悬浮液排列成单个细胞在流体中依次通过的单个小流液管，即样品管。
激光束经过透镜系统被聚焦至小流液管中，而小流液管的流体流速由电子流变计控制。
当细胞通过激光束时，光在细胞上发生散射。
根据细胞对激光光线的散射特性，可以将散射光信号分为前向散射光（Forward Scatter，FSC）、侧向散射光（Side Scatter，SSC）和反向散射光（Back Scatter）。
前向散射光与细胞大小和形态有关；侧向散射光与细胞内质量和颗粒数量相关；反向散射光较少用于细胞分析。
此外，染色后的细胞还能发射荧光信号。
流式细胞仪通过不同波长的激光器来激发染料或抗体标记的荧光信号。
细胞上标记的荧光分子在激发光照射下发出特定波长的荧光信号，这些信号被探测器收集。
常用的荧光染料有FITC、PE、APC等。
激发信号和荧光信号会被流式细胞仪上的多个探测器收集，并转化为电信号。
将电信号转化为数字信号后，可以得到散射图和荧光直方图。
散射图通过前向散射光和侧向散射光来反映细胞的大小、形态和复杂性。
荧光直方图则反映了细胞上特定荧光分子的存在和表达程度。
最后，通过流式细胞仪的计算机软件进行数据分析。
该软件可以根据荧光信号的大小和形状，对细胞进行分类和定量分析。
同时，流式细胞仪还可以使用特定门控技术（Gating）来筛选掉不感兴趣的细胞亚群，提高检测的准确性。
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种用于分析和分选细胞的高效、快速的技术手段。
它能够对
细胞进行高通量的单细胞分析，广泛应用于免疫学、肿瘤学、干细胞研究等领域。
流式细胞技术的原理主要基于细胞在流式细胞仪中的流动、激发和发射荧光信号的检测，下面将详细介绍流式细胞技术的原理。
首先，流式细胞技术的原理基于细胞在流式细胞仪中的流动。
流式细胞仪通过
细胞悬浮液在流动系统中的输送，使得细胞以单个细胞的方式依次通过激光束的照射区域。
这样就保证了每个细胞都能够被准确地检测和分析。
其次，流式细胞技术的原理基于对细胞的激发和发射荧光信号的检测。
在流式
细胞仪中，激光器会对细胞进行激发，激发后的细胞会发出荧光信号。
这些荧光信号会被光电倍增管接收并转换成电信号，然后经过放大、数字化和分析，最终得到细胞的荧光信号图谱。
最后，流式细胞技术的原理还包括对细胞的多参数分析和分选。
流式细胞仪可
以同时检测多种不同荧光标记的细胞，从而实现对细胞的多参数分析。
在此基础上，流式细胞仪还可以通过设定门控条件，实现对特定类型细胞的高效分选和分离。
总的来说，流式细胞技术的原理是基于对细胞在流式细胞仪中的流动、激发和
发射荧光信号的检测，通过对细胞的多参数分析和分选，实现对细胞的高通量、高效率的分析和分离。
这种技术在生命科学研究中具有重要的应用价值，为细胞学、免疫学、肿瘤学等领域的研究提供了强大的工具支持。
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种高效的细胞分析方法，它可以对单个细胞进行快速、准确的分析。
该技术主要基于细胞在流动状态下通过激光束时所
产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，可以获得有
关细胞形态、大小、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
流式细胞技术基本原理如下：
1. 细胞样品制备：将待检测的细胞样品进行处理，如离心、洗涤等操作，使其达到单个细胞状态，并加入荧光染料或抗体等标记物，以便
在流式仪中进行检测。
2. 细胞在流式仪中流动：将制备好的样品注入到流式仪中，在高速液
体流动中被逐个单独地通过激光束。
3. 激光束照射：当细胞通过激光束时，会发生散射和荧光现象。
散射
现象包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者与细胞大小相关，后者与细胞复杂程度和内部结构相关。
荧光现象则是标记物受激发后
发出的荧光信号，可以用于检测细胞表面标记物或内部结构。
4. 信号检测：流式仪会收集细胞产生的散射和荧光信号，并将其转化
为电信号，通过光电倍增管等装置进行放大和转换。
同时，流式仪还
会记录细胞通过激光束的时间和位置信息。
5. 数据分析：通过对上述收集到的信息进行分析，可以得到有关样品
中细胞数量、大小、形态、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
这些数据可以用于研究细胞生理学、病理学、药理学等领域。
总之，流式细胞技术利用了细胞在流动状态下产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，实现了对单个细胞的快速、准确分析。
该技术在生命科学研究中有着广泛应用，在临床诊断、药物筛选等方
面也有着重要作用。
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
12
液流系统形成单 个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理介绍流式细胞技术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学、医学和临床研究的分析技术。
它通过激光和光学系统对细胞进行高通量、高灵敏度的单细胞分析，能够实时监测并分析细胞的生理状态、表型特征、功能及亚细胞水平的分子表达。
流式细胞技术不仅可以用于细胞表面标记物的鉴定、表型分析等，还可以对细胞内蛋白质、DNA、RNA等进行定量测量，为科学家提供了大量有关细胞的宝贵信息。
流式细胞技术原理光学系统流式细胞技术的关键是其光学系统。
它由激光光源、光学镜头、光学滤光片、探测器等组成。
1.激光光源：常用的激光包括氩离子激光器、氦氖激光器等。
激光的主要作用是提供高强度、单色、聚焦的光源。
2.光学镜头：流式细胞仪使用透镜或反射镜将激光束聚焦在样品上，使得细胞能够接受到足够强度的光。
3.光学滤光片：为了区分不同荧光信号，流式细胞仪通常使用多个滤光片。
这些滤光片根据特定的波长和波长范围选择通过或阻挡光信号。
4.探测器：流式细胞仪通常配备多个探测器，以收集经滤光片过滤后的光信号。
常见的探测器包括光电倍增管和光电二极管。
流式细胞仪工作原理流式细胞仪将细胞悬浮液通过微细管道引导经过激光束。
细胞依次通过激光束，激发细胞中的荧光分子，产生荧光信号。
这些荧光信号由探测器收集并转换为电信号，最终生成细胞数据。
流式细胞仪的工作原理可分为三个步骤：步骤一：细胞进样将细胞悬浮液加入流式细胞仪装置，通过压力或重力等力作用下，细胞在微细管道中流动。
在流动过程中，细胞保持单个或少数细胞同时通过激光束。
步骤二：激发和荧光收集细胞在激光束下通过时，激光光源激发细胞中的荧光分子。
这些荧光分子发出一定波长的荧光信号。
探测器收集这些荧光信号并转换为电信号。
步骤三：数据分析流式细胞仪获取的电信号被送入计算机进行数据分析。
通过电子学、光学系统和计算机系统的协同工作，可以得到关于细胞表型、免疫细胞亚群等信息。
流式细胞技术的应用细胞表型分析流式细胞技术可以用于细胞表型的研究。
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种用于研究和分析单个细胞的技术。
它通过将细胞悬浮在缓冲液中，并通过微细孔的流式细胞仪以高速连续地将细胞流过激光束，测量细胞在激光束中散射的光信号和特定标记物的荧光信号，以获得关于细胞的生物学特征的信息。
流式细胞技术的原理基于光学散射和荧光信号的检测。
当细胞经过激光束时，细胞与激光相互作用，导致光的散射。
流式细胞仪利用多个探测器测量不同散射角度的光信号，可以获得散射光的前向散射、侧向散射和散射角分布等信息，从而了解细胞的形态、大小和内部结构。
除了散射光信号，流式细胞技术还可以使用荧光标记物来检测特定分子或细胞成分。
在实验前，通过染色、标记或转染等方法，可将细胞表面或内部的特定分子标记为荧光物质。
流式细胞仪通过选择性的激发和检测荧光发射，可以分析标记物的存在和数量，以识别不同类型的细胞和进行更深入的功能研究。
整个流式细胞技术的过程还包括样本准备、数据采集和数据分析等步骤。
样本准备通常包括细胞的收集、处理和染色等，以确保流式细胞仪能够准确地检测和分析细胞。
数据采集则是将细胞的散射和荧光信号转化为电信号，并记录下来以供后续分析。
数据分析则是根据所需的细胞参数和荧光标记物的特征，利用计算机软件对数据进行处理、解释和可视化等操作。
总结起来，流式细胞技术通过测量细胞的散射和荧光信号，可以获得关于细胞形态、大小、内部结构、功能和标记物等信息。
它广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域，为研究细胞和发现新的治疗方法提供了有力的工具。
流式细胞技术的操作方法
流式细胞技术的操作方法
流式细胞技术是一种用于分析和分类细胞的方法，通常包括以下步骤：
1. 细胞准备：从组织样本或培养细胞中收集细胞。
可以使用细胞培养、离心、切片等方法获取细胞。
2. 细胞处理：对收集到的细胞进行处理，包括洗涤、消化、染色等步骤。
洗涤可以去除细胞外的杂质，消化可以使细胞变成单细胞悬浮状态，染色可以标记特定细胞结构或分子。
3. 细胞悬浮：将处理后的细胞悬浮在缓冲液中，确保细胞以单个细胞为单位悬浮。
4. 流式细胞仪设置：根据实验需要，对流式细胞仪进行设置，包括调整流速、选择相应的激发波长和检测滤光片等。
5. 细胞分析：将悬浮的细胞通过流式细胞仪进行分析。
细胞会依次通过激光束，激光照射到细胞上时，细胞中的荧光标记物会被激发，发出特定的荧光信号。
根据细胞在不同参数上的荧光信号的强弱和分布情况，可以得到细胞的特征信息。
6. 数据分析：根据流式细胞仪得到的荧光信号，可以利用相关的软件进行数据分析，包括细胞计数、细胞分类、细胞亚群分析等。
7. 结果解读：根据数据分析的结果，解读实验结果，得出相应的结论。
需要注意的是，流式细胞技术的操作方法可能会因具体实验目的和流式细胞仪型号的不同而有所变化。
在进行实验前，最好参考操作手册或相关文献，了解具体的操作步骤和注意事项。
细胞生物学流式细胞仪分析技术研究
细胞生物学流式细胞仪分析技术研究细胞生物学是生物学的一个分支，主要研究细胞的结构、功能和活动。
随着科学技术的进步，越来越多的细胞生物学研究利用流式细胞仪分析技术，这项技术已成为现代细胞生物学研究的重要手段之一。
一、什么是流式细胞仪？流式细胞仪是一种现代化的细胞生物学技术，通过细胞的物理特性分离和分析细胞，使得细胞间的差异得以更加细致地研究。
通俗来说，流式细胞术就是将需要研究的细胞通过某种方式变成单个细胞，然后运用指定的设备将这些单个细胞分类。
二、流式细胞仪有什么特点？流式细胞仪在细胞分析中的作用主要体现在如下几个方面：1、高速度：流式细胞仪一般能够分析数百个或者数千个细胞，但是也有少量最高能够同时分析几十万个细胞的超大型仪器，分析速度极快。
速度快意味着样本优选几次，可以在非常短的时间内分析出大量的样本，从而追踪细胞分析对结果的影响。
2、高精度：流式细胞仪分析的样本极具目测性，同时将数据处理相当精确，因此流式细胞仪可以准确地分析不同的细胞质、核形态及染色体。
3、多参数同时分析：流式细胞仪可以对许多参数获得同时数据。
不仅能够分解及分析荧光染料的强度及频率，这项技术还可以同时测量多个分子。
三、流式细胞仪常用于哪些领域？流式细胞仪分析技术被广泛应用于不同的研究领域和实践环境中。
其中一些领域有：1、生物医学研究：流式细胞仪在生物医学研究领域中，是一种非常有用的手段，用于分析细胞的数量和特征。
2、病毒学研究：流式细胞仪也可以应用于抗病毒抵抗性和治疗策略的研究。
3、肿瘤学研究：利用流式细胞仪可以分析癌细胞繁殖性、凋亡率、侵袭性等细胞特性，为癌症的预后及治疗方案提供有用的信息。
四、流式细胞仪实验该如何进行？流式细胞仪实验一般需要分为以下几个步骤：1、准备细胞悬液：通常使用生长良好的单细胞悬液作为分析样品。
样品为新鲜的活细胞，一般从培养物、外周血或组织雾化制得。
2、细胞净化：细胞悬液需要通过漂浮中和负离子小珠、葡聚糖或其他分离方式，使其具有悬浮性，然后进行进一步处理。
流式细胞仪分析技术
流式细胞仪分析技术流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于细胞学和免疫学研究的分析技术。
它结合了光学、生物技术和数字技术，可以迅速、准确地分析单个细胞的形态特征、生理状态、分子表达和细胞功能等。
流式细胞仪分析技术与传统的显微镜观察方法相比，具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高准确性和自动化等优势。
流式细胞仪分析技术的原理是基于细胞在流体中的特性和细胞与激发光交互作用时所产生的光信号。
具体而言，流式细胞仪通过光源产生一束激发光，并经过一系列的光路元件，将光束聚焦在细胞悬液中的细胞上。
细胞在激发光的作用下，会发出散射光和荧光光，然后通过一系列的光学滤波器和光学器件，将光信号转化为电信号，并通过光敏器件转化为数字信号。
最终，这些数字信号可以被计算机采集和分析，从而得到细胞的相关参数和信息。
1.细胞计数和细胞大小测量：流式细胞仪可以通过细胞的散射光信号，计算细胞的浓度和大小。
这对于确定细胞的增殖状态、细胞密度和细胞生长速度等具有重要意义。
2.细胞凋亡分析：流式细胞仪可以通过荧光标记技术，检测细胞凋亡相关的标志物，如细胞膜外磷脂翻转和DNA断裂等。
这对于研究细胞凋亡的发生和调控机制非常重要。
3.细胞表面标记物检测：流式细胞仪可以利用荧光标记的抗体，检测细胞表面的特定抗原或受体，从而研究细胞的分型、功能和相互作用等。
这对于免疫细胞的表型分析和免疫细胞亚群的鉴定非常有价值。
4.荧光蛋白标记检测：流式细胞仪可以利用荧光蛋白标记，检测细胞内特定蛋白的表达水平和分布情况。
这对于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等具有重要意义。
总之，流式细胞仪分析技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
它可以为研究人员提供关于细胞数量、大小、形态、生理状态、分子表达和细胞功能等多样化信息，为细胞学和免疫学的基础研究、新药研发和临床诊断等方向提供有力的支持。
随着技术的不断发展和改进，流式细胞仪分析技术将在未来发展得更加成熟和广泛应用。
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法流式细胞技术是一种用于分析和计数单个细胞的方法，它通过将细胞悬浮液通过流动细胞仪进行检测和分析。
本文将详细介绍流式细胞技术的原理和方法。
一、原理流式细胞技术基于光学原理，利用激光束和细胞的荧光特性来获得细胞的信息。
其主要原理包括：细胞悬浮液通过细管注入流动细胞仪，细胞经过一个个单元的检测区域，被激光束照射后，激发细胞内染料的荧光发射。
荧光信号经由光学系统收集、分离、过滤和检测，最终转化为电信号。
根据细胞的荧光信号强度和荧光标记的特异性，可以对细胞进行分类和计数。
二、方法1. 细胞样品的准备需要获得待检测的细胞样品。
样品可以是细胞悬液、细胞培养物或者组织样品。
样品准备过程中需要注意细胞的浓度和纯度，以确保后续分析的准确性和可靠性。
2. 细胞染色为了检测细胞的特定标记物，需要对细胞进行染色。
常用的细胞染色方法包括直接染色和间接染色。
直接染色是将荧光标记的抗体或染料直接与细胞反应，间接染色则是先与细胞结合的初级抗体，再结合荧光标记的二抗。
3. 流式细胞仪的设置在进行实验之前，需要对流式细胞仪进行适当的设置和校准。
包括调整流速、激光功率、荧光探测器的设置等。
这些参数的设置会影响到后续实验的结果准确性和可靠性。
4. 细胞检测和分析样品准备完成后，将细胞悬液注入流动细胞仪中。
流式细胞仪会逐个检测细胞并记录其荧光信号。
通过对细胞荧光信号的分析，可以获得细胞的数量、大小、形态以及荧光标记的强度等信息。
5. 数据分析与结果解读流式细胞仪会输出原始数据，包括细胞的荧光信号和强度。
对于大规模的数据分析，可以使用专门的流式细胞仪数据分析软件。
通过对数据的统计和图表分析，可以对细胞进行分类、计数和比较。
三、应用流式细胞技术在生命科学研究中有广泛的应用。
它可以用于细胞免疫学、细胞周期分析、细胞分选、细胞凋亡检测等方面的研究。
通过流式细胞技术，可以更加精确和快速地获得细胞的信息，为研究生物学、医学和药物研发等领域提供了重要的工具。
第13章流式细胞分析技术
三、基于免疫微球技术的应用
CBA 技术
荧光微球 捕获抗体 捕获荧光微球
+
不同荧光
+
强度微球
抗原（细胞因子） 荧光标记抗体
CBA流式检测结果和标准曲线
第四节 流式细胞分析的临床应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于基础研究、临床诊断和研 究应用各方面，特别是在免疫细胞的表型、功能分析和免疫 相关性疾病的诊断、治疗和预后判断中具有重要的意义。
散射光
单细胞液滴
选定细胞群体
荧光信号
加载电荷
偏转高压静电场
液滴偏转
进入分选收集管，完成细胞分选
数据储存，分析。
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求：
- 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 - 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 - 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的
（二）双参数图 二维散点图、密度图和等高图
（三）多维参数的显示 假三维图和三参数点图
三参数以上的显示 主要要依据设门技术进行分析
（四）设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群 分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参 数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
流式细胞仪特点：
①速度快，每秒可测量数万个微粒；②精度高；③准确性好； ④多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特 性的多参数测量。
二、经典流式细胞仪
（一）基本结构
流式细胞分析技术-南京大学
流式细胞分析技术-南京大学
介绍
流式细胞分析技术是一种广泛应用于生物医学领域的分析技术，南京大学在该领域取得了显著的研究成果。
研究内容
南京大学的流式细胞分析技术研究主要涵盖以下方面：
- 流式细胞术及其基本原理
- 信号检测及数据分析方法
- 流式细胞仪的开发与改进
研究成果
南京大学在流式细胞分析技术方面取得了以下研究成果：
- 开发了高灵敏度的流式细胞仪，能够实时监测细胞的运动和
形态变化；
- 建立了精确的数据分析方法，能够对流式细胞数据进行准确
的定量分析；
- 在肿瘤免疫治疗方面取得突破，通过流式细胞分析技术提高
了免疫细胞浸润和抗肿瘤效果。
应用前景
流式细胞分析技术在生物医学研究中具有广阔的应用前景，包括：
- 癌症研究：通过流式细胞分析技术可以分析肿瘤细胞的特征
和行为，为癌症的诊断和治疗提供依据。
- 免疫学研究：流式细胞分析技术可以用于免疫细胞的特征分
析和功能研究，有助于理解免疫系统的调控机制。
- 干细胞研究：利用流式细胞分析技术可以对干细胞进行分离、鉴定和纯化，为干细胞治疗提供支持。
结论
南京大学在流式细胞分析技术研究方面具有独特的优势，通过
不断创新和改进，为该领域的发展做出了重要贡献。
未来，流式细
胞分析技术将继续在生物医学研究中发挥重要作用，为人类健康做
出更大的贡献。
流式细胞分析技术
流式细胞仪分析技术及应用第一节概述一、工作原理二、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节流式细胞仪技术要求一、检测样品制备二、常用的荧光染料与标记染色三、胶乳颗粒的应用四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应用第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用一、细胞周期和DNA 倍体分析二、染色体分析三、细胞表面标志的检测1、淋巴细胞及其亚群的分析2、淋巴细胞功能分析3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS 病检测中的应用六、自身免疫性疾病相关HLA 抗原分析七、移植免疫中的应用流式细胞术(flow cytometry, FCM )亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。
是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。
流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术流式细胞术发展史:? 1930年Casperssor和Thorell开始致力于细胞计数的研究? 1934 年Moldaven 最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞? 1940年Coo ns提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白? 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利? 1950 年Caspersson用显微UV-VIS 检测细胞? 1953年Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器? 1969 年Van Dilla 及其同事在Los Alamos, NM 发明第一台荧光检测细胞计? 1972年Herzenberg研制出细胞分选器? 1975 年Kohler 等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂? 大量厂家不断生产流式细胞仪? 目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER 公司流式细胞术的特点：流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量主要特点：单个细胞水平分析；多参数分析(同时多种荧光素标记)水平分析；高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细第一节概述流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。
流式分析原理
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
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别藻青蛋 白 能量传递 复合染料
APC
633
易 红 670 红 670 易
不敏感
具较多发光基团， 消光系数和量子产 额高 减少交叉，成本高
PEcy5
488
不敏感
（二）免疫荧光标记
荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直接标记：干扰少，但需购买多种单抗 ，在流式分析中大量使用。 间接标记：步骤多，干扰多，不需标记 多种抗体组合标记。在流式标记中很少使用 。
R1=为粒细胞 R2 =单核细胞 R3 =淋巴细胞
M1为线性门，为是 R3中的T淋巴细胞
R3=Q1+Q2+Q3+Q4 Q1 =CD4+/CD3Q2 =CD4+/CD3+ Q3 =CD4-/CD3Q4= CD4-/CD3+
第三节
流式细胞仪免疫分析的技术要求
一、实验基本原则
FCM试验中实验设计、对照设置、荧光抗体的选择、 标本处理、染色过程和质量控制都对实验结果又重要影响 。 标本处理实验室环境 临床标本处理的实验室环境以 及废弃物的处理要严格按照实验室安全要求进行，对于传 染病标本应该按照传染病的等级，按照《病原微生物实验 室生物安全管理条例》规定在不同等级的实验室中进行。 工作人员按要求穿戴相关的防护服，仪器消毒、排放 的气体、废水和实验废弃物也应按照要求进行处理。 活细胞分选应该在万级层流室中进行。
第四节 流式细胞分析的临床应用 一、机体免疫状态的检测 二、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 三、肿瘤耐药相关蛋白分析 四、艾滋病检测中的应用 五、自身免疫病中的应用 六、移植免疫中的应用
目 录
第五节 影响流式细胞分析的主要因素 一、标本采集和单细胞悬液制备的质量控制 二、荧光染色过程中的质量控制 三、仪器的质量控制 四、数据采集和分析过程中的质量控制 重点提示
细胞悬液形成液流柱
压电晶体 产生机械振动
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴 不充电 弃去
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
分选的技术要求： 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细 胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分 率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总 量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成 反比。
测器检测到的光能量是真正的某一荧光素产生的光能量。
四、数据显示方式
（一）单参数数据的显示
单维参数（荧光或散射光）与细胞数量（count）构成
，用于FSC、SSC和荧光（FL1～FLn）等单参数的数据显示。
（二）双参数图
二维散点图、密度图和等高图源自三）多维参数的显示假三维图和三参数点图
三参数以上的显示 主要要依据设门技术进行分析
二、散射光的测定
（二）侧向散射光或垂直散射光（side scattered light，SSC） 激光照射到细胞内容物时，可以产生方向不同和强弱 不等的散射光，垂直方向散射光对细胞膜、胞质、核膜的 折射率更为敏感，可反映被检测细胞内精细结构和颗粒信 息。
三、荧光测量
（一）荧光信号测量与放大器 荧光信号由被检细胞上标记的荧光抗体上的荧光素受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。散射光和荧
三、基于免疫微球技术的应用
CBA 技术
荧光微球 捕获抗体 捕获荧光微球
+
不同荧光 强度微球
+
抗原（细胞因子） 荧光标记抗体
CBA流式检测结果和标准曲线
二、常用的荧光染料与标记染色
（一）常用的荧光染料和荧光蛋白
细 胞 悬 液
FITC PE PE-cy5 Pre-Cp APC
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4
激光
能量传递复合染料用化学法将两种不同激发波长的染料 结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激 发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从 而检测到该特定荧光信号。
、405和375 nm），可检测20个参数（18种荧光），而定
制型可配置11个激光器，30个检测器，可测定 32个参数 。大型分选型流式细胞仪最高可配置7个激光器，检测24 个参数（22种荧光），可6路分选。
二、散射光的测定
（一）前向散射光（forward scattered light，FSC ） 是与细胞切线方向小角度散射光，其能反映细胞形状 和体积大小。
3．标本的保存 新采集标本保存于室温，分离的单个核细胞标本保存于
2℃～8℃。肝素抗凝外周血标本于室温保存48小时，EDTA抗
凝的血标本保存24小时，骨髓标本室温保存＜18小时。 最理想的保存方法，既要保持细胞原有的特性，又要不 影响检测结果。常用保存方法：深低温保存法，乙醇或甲醇 保存法，甲醛或多聚甲醛保存法。
光的强度决定了峰值脉冲信号的高度，荧光的分布则决定了
脉冲信号的宽度。这些光谱通过滤光片，不同波长的散射光 和荧光信号被分开，经PMT和PD检测后，信号经放大、转换 ，最后通过计算机分析获取流式结果。
流式检测示意图
（二）荧光补偿 荧光补偿是指不同的荧光素由于发射光谱重叠，因此
在检测的时候有串色现象，通过减去重叠部分的光，使检
（二）分析工作原理
细胞悬液
注射泵
流动室
系统鞘液 极限层流 抑制细胞搏动、翻转 明视野细胞形态 固态激光 TDI CCD捕获信号 散射光和荧光信号 计算机分析系统 细胞明视野、荧光图像和流式分析图
液流聚焦 LED照射
量化成像分析流式细胞仪结构、原理
A.量化成像分析流式细胞仪结构图
B.量化成像分析流式细胞仪结果分析图
经典流式细胞仪的结构
（二）分析工作原理 荧光染色待测单细胞悬液 细胞流 驱动系统 单细胞流 荧光素 PMT/PD检测器 信号放大 鞘 液 检测区域 激光 流动室 激发细胞 进样器系统 液流
FSC/SSC 计算机
信号转换、储存和分析。
液流系统和液流聚焦示意图
液流系统和光学系统
喷嘴 鞘液
荧光信号 样品流 激光束聚焦
名称
异硫氰酸 荧光素 藻红蛋白
染料
激发 波长
488
荧光颜 色
绿 525 橙 575
溶解性
对PH敏 感性
敏感
特点
易溶于水，与抗体结 合不影响特异性
FITC
易
PE
488
别藻青蛋 白
能量传递 复合染料
APC
633
红 670
红 670
易
不敏感
具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
PE-cy5
488
易
不敏感
二、单细胞免疫标本的制备
（一）标本采集、运输、保存和操作 1．标本来源 主要来源于外周血、骨髓和淋巴器官或 组织等。 2．抗凝剂的选择
采用肝素钠和EDTA-Na2抗凝。
EDTA的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁造成的细胞损失
，具有较强的抗血小板聚集能力。缺点是由于EDTA具有一定
的消化能力，导致细胞表面的一些分子丢失。 枸橼酸钠和肝素锂不宜使用。
本章小结
概 述
流式细胞术（flow cytometry，FCM）：
是基于流式细胞仪的一项快速、精确、高通量针对微
粒（细胞）的特征或功能进行多参数定性、定量分析和分 选的新型技术。 流式细胞术的特点： 快速、高通量、准确、灵敏、定性或定量地对完整细 胞群体分析反映出细胞群体的生物学特征或功能，或根据 微粒（细胞）的特征进行分选，进而研究其生物学特征和
二、经典流式细胞仪
（一）基本结构 经典分析型的流式细胞仪的结构组成 液流系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 信号检测：光源、光束形成器（流动室前光学系统） 、流动室后光学系统 转换及放大系统：光电转换器、放大器和信号处理电 路 计算机分析系统 分选型流式细胞仪 分选系统：荧光激活细胞分选系统（FACS）
功能。
第一节
流式细胞仪的分析及分选原理
一、概 述
流式细胞仪（flow cytometer）： 是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学 、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物 化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新 型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分 析仪器。 流式细胞仪特点： ①速度快，每秒可测量数万个微粒；②精度高；③准 确性好；④多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、 化学和生物特性的多参数测量。
抗体和标记方式的选择 首选直接标记抗体 荧光分子： PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，荧光较弱，适用于强表达抗原 间接标记：不提倡用 实验对照的设计原则 空白对照：所有试验必须设置 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正） 阳性对照：检测阴性时
质谱流式细胞仪工作原理
质谱流式常用标记元素
常用外周血抗CD分子抗体标记元素
质谱流式细胞仪结果分析
第二节
数据的显示与分析
一、参数
流式细胞仪的主要参数有两大类： 散射光信号：前向散射光和垂直散射光 荧光信号：各种不同的流式细胞仪可检测的荧光信号 数量不同，随着配置的激光器越多，可检测的荧光信号越 多。 分析型流式细胞仪最高标配4个激光器（ 488、633
细胞核转位检测
三、质谱流式细胞仪
（一）基本结构 质谱流式细胞仪（mass cytometer）的组成 质谱流式细胞仪是经典的流式技术和质谱技术的结
合体。
进样雾化系统 离子源：热气化室和电感耦合等离子体焰炬 离子传递和过滤系统 ICP-TOF检测系统 计算机及其分析系统
质谱流式细胞仪结构简图