对虾细胞培养的研究现状_冯书营

第24卷第1期 海　洋　水　产　研　究　Vol.24,No.1 2003年3月 MARIN E FISHERIES RESEARCH Mar.,2003

文章编号:100027075(2003)0120064205

・综述・

对虾细胞培养的研究现状

冯书营2　黄 1　张士璀2

(1农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)

(2中国海洋大学海洋生命学院,青岛266003)

摘要 对虾的细胞培养,是研究对虾不同学科和领域的重要工具之一。至今,国内外已有不少关于对虾细胞培养的研究报道。本文综述了不同作者对不同对虾细胞原代培养的结果,比较了其培养方法和培养条件的异同;描述了研究者们尝试多种方法对原代细胞的传代培养,其中一些方法对对虾细胞系的建立起到了积极的作用;介绍了利用细胞培养技术在对虾不同领域的应用状况,尤其是对对虾病毒性疾病的研究方面应用较多。

关键词 细胞培养 对虾 研究现状

中图分类号:Q813.1+1;Q959.223+.63 文献识别码:A

Status quo of research on penaeid shrimp cell cultures

FEN G Shu2ying2　HUAN G Jie1　ZHAN G Shi2cui2

(1K ey Laboratory for Sustainable Utilization of Marine

Fisheries Resources,Ministry of Agriculture,Y ellow Sea Fisheries Institute,Qingdao266071)

(2College of Marine life Sciences,Ocean University of China,Qingdao266003)

ABSRACT Cell culture of penaeid shrimp is an important tool in the research on the different subjects and fields of penaeid shrimp.Up to now,many experts in the world have reported the stud2 ies on cell culture of penaeid shrimp.This paper summarized the progress of research on the penaeid shrimp cell culture,compared with the published culture methods and conditions,and described vari2 ous methods in the subculture of penaeid shrimp cell,of which some studies have great effects on es2 tablishment of shrimp cell line;This paper also introduced some applications of penaeid shrimp cell culture in the different research fields,especially in virological studies.

KEY WOR DS Cell culture Penaeid shrimp Research status quo

80年代以来,养虾业迅速发展,已成为海水养殖的重要支柱产业。但由于生态失控,环境恶化等诸多因素的影响,使养虾业大幅度滑坡,造成严重的经济损失(Lightner　1988;Nash et al.1988)。为了挽救虾病的危害,很多工作者进行了大量的科学研究。使用的技术方法有传统的形态学观察(光学显微镜观察,组织病理学的观察和电子显微镜的观察)(Lightner et al.1984、1987、1998)。到90年代后,又有了病原学,血清学的检测和基因检测技术等现代生物技术,有力促进了虾病的研究工作。组织培养作为一种实验方法,在不同的学科和

国家重点基础研究发展规划项目课题G1999012002资助

收稿日期:2002212210;接受日期:2003201203

领域中得到了应用,发挥着举足轻重的作用。利用其可以进行对对虾病害的发生,蔓延,防止和对虾的机体防御机制,细胞功能,评价环境对机体的影响,病毒的生产和分离,单克隆抗体的生产,特定条件下建立生物模型等方面的研究。所以,实验室的方法即对虾的细胞培养对于虾病的防治是非常必要的。

至今,脊椎动物组织细胞的培养技术已发展得相当成熟,建立了许许多多的细胞系。无脊椎动物组织培养工作起步较晚,早在1915年,G oldschmidt 成功的培养了鳞翅目昆虫组织。70年代后,昆虫的组织培养进入了旺盛的发展阶段。至今,已建立了100多种无脊椎动物的体外培养细胞系,其中大部分是昆虫细胞系。甲壳类动物的研究还处于初级阶段,由于对虾同属于无脊椎动物,很多工作者利用昆虫细胞培养和其他培养方法进行对虾的细胞培养。经过10年来的努力,该项工作取的了以下明显的进展。

1　原代培养

早在1971年Peponnet 等报道了螯虾、龙虾的类淋巴、心脏、卵巢等组织的体外培养。随后Patterson 又报道了美洲龙虾(Hom arus americanus )血细胞的原代培养(1974)。Chen 等(1986)报道了斑节对虾的卵巢、心脏、肌肉、神经、肠道、肝胰腺、鳃的组织培养,发现只有卵巢和心脏能够生长。Chen et al.(1989)又报道斑节对虾淋巴器官的原代培养。Luedeman (1992)利用Grace 培养基对蓝对虾和凡纳对虾的卵巢上皮细胞进行了原代培养,证实最佳的培养条件是Grace 培养基+10%FBS (胎牛血清)+1%(青霉素104IU/ml ,链霉素104μg/ml ,脯氨酸2mg/ml ,碳酸氢钠40mg/ml ,氯化镁2mol/L ,氯化钠5mol/L ),渗透压为753mmol/kg ,28℃培养。在该条件下细胞培养2d 后有80%的形成单层,每3d 更新1次培养基,细胞能维持10d 。刘　凯(1998)利用L 215培养基,添加10%的FBS ,在p H 值710,温度28℃条件下对斑节对虾的淋巴器官、造血组织、血细胞、心脏、甲壳下表皮和肌肉等组织进行了原代培养,结果显示前3种组织生长较好。Huang (1999)对中国对虾血淋巴的无机组成成分和渗透压进行分析测定,利用肝胰腺细胞的原代培养得到了体外培养的最佳p H 值和渗透压,最终实验得到了完善的PPB (对虾生理缓冲液)配方。Kasornchandra 等(1999)也作了类似的实验,证实了只有淋巴器官能形成单层并且能传至3代,在培养基中添加0101%的胆固醇能增强淋巴器官的生长。Toullec (1999)在甲壳类动物(对虾、螯虾和龙虾等)细胞培养技术指南中描述了不同器官组织的原代培养方法,并对细胞的增殖和存活性进行了报道。Fraser and Hall (1999)通过改良的Grace 培养基和L 215培养基对斑节对虾的卵巢组织作了原代培养,比较了添加不同的生长因子对卵巢4种类型细胞的影响。结果显示了上皮样细胞在Grace 培养基上生长最好,但存活时间不超过两个月。纤维样细胞在2×L 215培养基中能形成单层并能传至3代,存活17个月,同时观察到圆形细胞从组织中的迁出,能存活10个月,巨核的上皮细胞容易形成单层,但不易传代。较为有趣的是发现后两种细胞有合成卵黄蛋白原的功能。Itami (1999)利用日本对虾的淋巴组织和血细胞进行原代培养,结果显示上皮样细胞和成纤维样细胞能生存54d ,但细胞经胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶等消化后,细胞不能存活。同时指出胰岛素和细胞分裂素不能增强细胞的增殖。West et al 1(1999)也报道了斑节对虾淋巴细胞和卵巢细胞的原代培养,其结果与Chen 和Fraser 的结果一致。Mulford et al .(2000)对螯虾Nephrops norvegicus 的造血组织进行了初代培养。在该报告中偶尔看到细胞的有丝分裂,并证明了成纤维生长因子和胰岛素生长因子对细胞的生长没有增强作用,这与Itami 的研究结果一致。本病害室自1990年以来,采用修改的Grace 培养基对中国对虾(P.chi nensis )、凡纳对虾(P.vannamei )等的多种组织进行了大量的原代培养研究,观察到了淋巴器官、血淋巴细胞、造血组织细胞、受精卵胚胎细胞等的贴壁生长过程(宋晓玲　1997未发表资料),此外,还对克氏原螯虾(Procam barus clarkii )的血淋巴细胞进行了原代培养(魏　静等　1999),采用L 215培养基,添加15%的犊牛血清及100IU/ml 青霉素,100μg/ml 链霉素,细胞能维持15d 以上。另外,梁　艳①采用中国对虾、南美白对虾的原代培养进行了WSSV 的结合分析研究①。

在进行组织原代培养的同时,进行了培养条件和培养基的优化筛选。对虾细胞系的建立未成功的重要原因之一是没有合适的培养基,所以可以利用组织培养进行筛选不同种类,不同器官的最优培养基。Chen et al .(1986)、Rosental (1990)、Luedeman et al .(1992)和Nadalal et al .(1993)等利用不同种类的虾进行细胞培养选

①梁　艳,宋晓玲,黄 ,徐怀恕.2002.地高辛标记WSSV 病毒及其与宿主细胞间结合现象观察.病毒学报(待发表)

　第1期 冯书营等:对虾细胞培养的研究现状　65