基因工程第七章 重组子选择筛选与分析
重组子的筛选和鉴定
重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR 产物。
1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml 含适当抗生素的LB 培养基中，37℃摇床培养过夜。
2. 次日取菌液0.2-0.5ml，12,000rpm×3min 离心，弃上清，加入20μl ddH2O 和20μl 酚/ 氯仿，震荡混匀，12,000rpm×5min 离心。
3. 取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA 作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl 体系。
酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。
7. 若用PCR 法鉴定，则在第 2 步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl ，PCR 产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
基因工程重组体克隆筛选和鉴定
插入片段探针杂交结果
酶切前
酶切后
载体含 插入片段
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插入片段
Southern blot 筛选
结果
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（1）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
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（2）R-环检测法
1）R-环：
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第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片段互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
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二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。 只有带有插入片段的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
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（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性 基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。也可以用 含青霉素的培养基直接筛选。青霉素分子不消耗碘， 其降解产物青霉酮酸消耗碘，因此可根据碘的显色 反应确定氨苄青霉素抗性基因是否失活。
蓝色
碘没有消耗 青霉素没降解
第7页/共89页阳性克隆抗药性标记选择应 Nhomakorabea意的问题
抗药性标记选择如果用药物直接筛选，观察和确定 转化子菌落的培养时间不宜过长，以12－16小时为 宜，否则会出现假阳性转化子菌落。因为转化子菌 落会降解选择药物，导致非阳性转化子菌落周围选 择药物浓度降低。
重组子的筛选与鉴定
1.2 -半乳糖苷酶显色反应选择法
1.2.1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体 菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补 形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无 色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴 -4-氯靛蓝。
2.1 Southern blotting
Southern印迹杂交是由E Southern于1975年首先 建立并使用的，故名之。它是根据毛细管作用的 原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链 DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛A 选A过程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
3、PCR扩增检测法
3.1 原理 PCR能在模（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
④漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放 射自显影后，便可鉴定出与探针的核昔酸序列同 源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA片段 的重组子筛选出来。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
2.2菌落印迹原位杂交
是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上， 不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作， 而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位 结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入 序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落 或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上， 然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落 杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交 为例，操作步骤如下:
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组子筛选
37℃培养
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋白既 不能测定生物活性，又无现成的抗 体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行粗略的筛选
遗传学直接筛选法
抗药性 显色反应 营养缺陷型 噬菌斑形成能力等
此法简便快速，可以在大量群 体中进行筛选。但由于目的基 因插入重组分子的方向，多聚 体假阳性等原因，可靠性较差
酶切载体
蓝色菌落（自连）
白色菌落（重组子）
DNA片段
未转化的受体菌 （AmpS）
连接液 E.coli 感受态细胞
显标记主要区分 重组子 与 非重组子
LB + Amp + X-gal + IPTG 抗药性标记主要区分
转化子 与 非转化子
Amp lzcZ’
自连质粒转化子 （AmpR ， lzcZ’ ）
重组质粒1 重组质粒2 载体对照
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图 谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法 不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。
但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验 成本也高。
lacZ△M15
AmpR
lacI lacP ,O lacZ´
NH2–
a-互补
–COOH
lacI lacP ,O lacZ△M15
X-gal → 半乳糖+ 5-溴-4-氯-靛蓝
a-互补（lacZ’ ）筛选原理
带有 lacZ’ 基因的质粒转入宿主菌后，在诱导物 IPTG（异丙基-b-D-
硫代半乳糖苷，isopropylthio-b-D-galactoside）诱导下，lacZ’ 基因合 成半乳糖苷酶 N-端片段，宿主菌染色体上的 lacZ△M15 基因合成半乳 糖苷酶 C-端片段。质粒编码的半乳糖苷酶 N-端片段可与宿主菌编码的 半乳糖苷酶 C-端片段结合，形成有酶学活性的 b-半乳糖苷酶。在呈色 底物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷，5-bromo-4-chloro-3indolyl-b-D-galactoside）存在时，形成蓝色菌落。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
重组子的筛选的原理
重组子的筛选的原理
重组子的筛选是指通过某种方法，从混合的DNA或RNA片段中分离出特定长度的重组子（或称为合成子、片段），以进一步进行研究或应用。
其原理主要基于两个关键步骤：构建DNA文库和筛选。
构建DNA文库：首先，通过随机切割或酶切等方法将目标DNA或RNA分子切碎成片段，然后将这些片段与载体DNA或RNA连接，创建所谓的“文库”。
这样一来，文库中就包含了大量不同长度的DNA或RNA重组子。
筛选：筛选是指从文库中筛选出特定长度（或特定的序列）的重组子。
这通常通过以下几个步骤完成：
1. 选择适当的筛选方法：根据实验目的，选择适当的筛选方法。
常见的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、蛋白质互作筛选等等。
2. 筛选条件设定：根据筛选方法的要求，设置适当的筛选条件，如适当的温度、条件和试剂浓度等，以实现特定重组子的富集。
3. 筛选步骤：根据筛选方法，进行适当的筛选步骤，如杂交、PCR扩增、亲和性层析等操作。
通过这些步骤，特定长度或序列的重组子会得到放大或富集，从而分离出来。
4. 验证与鉴定：对筛选出的重组子进行验证和鉴定，例如使用测序技术验证其序列是否与预期一致，或进行功能分析等。
总的来说，重组子的筛选原理是通过构建DNA文库，并在条件和方法设定下，利用适当的筛选方法和步骤，从文库中选择和富集特定长度或特定序列的重组子。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。
随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。
本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。
二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。
其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。
当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。
这种方法操作简便，适用于大量筛选。
2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。
例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。
当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。
这种方法成本低廉，适用于实验室条件。
3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。
该方法灵敏度高，可实现自动化操作。
然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。
4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。
该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。
然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。
三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。
蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。
抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。
荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。
测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。
因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。
第七章重组子的筛选与鉴定
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
“选择”（selection）和“筛选” （screening）的基本含义
▪ 选择，是指通过某种外来附加压力（或因素） 的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克 隆类型的一种方法。包括根据克隆载体提供的 表型特征的简单选择，和根据突变的互补作用 对克隆基因的直接选择。
▪ 筛选则是指通过某特定克隆的过程。
2. 转化率
▪ 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 ▪ 重组子中存在非目的重组子。
转化子
重组子
目的重组子
▪ 由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转 化子与非转化子、重组子与非重组子、目 的重组子与非目的重组子。
《基因工程原理》
重组子的筛选与鉴定
山东理工大学生命科学学院 张建勇
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互 补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止 密码（不破坏肽）。
《基因工程原理》
基因工程原理
Principles of Genetic Engineering
山东理工大学生命科学学院
分
总
目的基因 基因载体
体
切
技
术
路
线
接
重组子
转 筛
表
1.重组率
▪ 重组子（目的重组子） ▪ 自我连接载体（非重组
重组子筛选
三．筛选在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA 形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。
因此转化后须在不同层次、不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
（一）根据重组子的遗传学特性筛选（平板筛选）1.抗生素平板筛选克隆载体具有抗生素抗性基因，如：Amp、Ter、Kan等。
外源基因插在抗性基因之外，这个重组子转化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素的培养基中，只有阳性重组子才能生长。
但有些单酶切的情况下，连接时有可能出现反向连接或自身环化，所以还需要进行酶切鉴定。
2．插入失活pBR322含有Tetr及Ampr，插入Tet后变成Tets及Ampr。
3．插入表达如质粒pTR262带有负调控Tetr基因的cI基因，cI基因表达产物可抑制Tetr 表达。
当目的基因插入cI基因后，使后者失活，Tetr表达，因此重组子在含有Tet的平板上可生长，自身环化的载体转化细胞则不能生长。
4．营养素依赖表型把亮氨酸自养型载体转入亮氨酸异养型菌株即可在无亮氨酸的培养基中生长。
5．蓝白筛选蓝白筛选是通过插入失活lacZ基因，破坏重组子与宿主之间的ɑ-互补作用来鉴别重组子与非重组子的筛选方法，是携带lacZ基因的许多载体的筛选优势。
这些载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等。
它们的共同特点是载体上携带一段细菌lacZ基因的α肽编码序列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。
当无外源DNA插入时，质粒表达α肽。
突变型Lac-E.Coli可表达该酶的ω肽。
单独存在的α及ω肽均无β-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal(5-溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷)的诱导剂IPTG（异丙基硫代－β－D－半乳糖苷）条件下，菌落呈蓝色，这就是α-互补。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法包括以下几种：
1. PCR筛选法：利用PCR扩增方法，在重组子序列两端设计引物，扩增出目标重组子序列。
该方法可快速、简便地筛选出重组子，但存在引物设计不当、PCR 扩增条件不适等问题。
2. Southern blotting法：利用重组子DNA序列特异性探针进行筛选，这种方法需要对目标重组子进行限制性酶切，分离重组子DNA片段，然后进行Southern blotting，根据特异的探针与重组子DNA序列的杂交情况，确定有无目标重组子，这种方法相对复杂，但有高准确性。
3. 包装体筛选法：将目标重组子所在的DNA片段插入载体中，建立重组子文库。
然后采用包装体技术将文库中的重组子片段插入病毒包装体中，再通过病毒感染将重组子片段转染到宿主细胞，筛选出含有目标重组子的克隆。
4. 负筛选法：利用重组子DNA序列中含有的特异性标记，通过筛选方法去除不含该标记的过渡物，从而筛选出含有目标重组子的样品。
以上是常见的几种重组子筛选方法，不同方法适用于不同的实验需求和实验条件。
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第二节 核酸分子杂交检测法
利用碱基配对原理进行的分子杂交是鉴定基因重 组体的常用方法。杂交的双方是待测的受体细胞基因 片段与由插入片段基因制备的DNA或RNA探针。
常用的筛选重组体的杂交方法有 1、菌落和噬菌斑原位杂交 2、斑点印迹杂交 3、R-环检测 4、Southern印迹杂交 5、Northern印迹杂交
1、原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。
2、斑点印迹杂交
3、R-环检测法
（1）原理： DNA-RNA杂交。
（2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的 时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链 更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
二抗上连着一种酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、过氧化物酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应 转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结 果。
3、ELISA的局限性 有效，但敏感性、特异性稍差（主要取决于 一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
退火温度由 58℃ 提高到62℃ 是由于原来引物 中的酶切位点和保护碱基与待扩增的基因是不配对 的，现在配对的数量增多，退火温度越高,特异性越 强。
循环次数减少是因为25～30个循环的扩增量 足够进行检测，如果量太大跑出的电泳条带呈现︼ 型，不易确定分子量。
菌落PCR出现假阳性 样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
重组质粒的构建、转化与重组子筛选
重组质粒的构建、转化与重组子筛选【实验目的】1、学习掌握限制性内切酶的分类、特性和作用原理；2、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术；3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子的技术，了解并掌握几种常见的连接方法；4、掌握利用 CaCl制备感受态细胞的方法；25、学习和掌握热激法转化E.coli的原理和方法；6、掌握α-互补筛选法的原理；7、学习用试剂盒提取质粒DNA的方法；8、学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒；9、学习掌握重组子DNA分子鉴定的基本方法。
【实验原理】1、体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
2、单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。
选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。
单酶切法简单易行，但后期筛选工作比较复杂。
本实验采用单酶切法。
3、酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。
另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的酶量。
一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μL，DNA的量增大，反应体积可按比例适当放大。
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2．利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因(reportor gene)，常用的报告基因有 抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 ① 新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II, NPTII）基因 新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和 G418 等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核 细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成， 进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上- 磷酸基团转 移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶 位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选 择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细 胞才能存活下来。
（1）抗药性筛选
这是利用载体DNA分子上的抗药性筛选标记进行筛选的方法。主要用 于重组质粒DNA分子的转化子筛选。重组质粒DNA分子携带特定的抗 药性选择标记基因，在含有相应选择药物的选择培养基上正常生长。 ① 氨苄青霉素（ampicillin，Ap 或Amp）: 含bla基因的菌体能转译 丙酰胺酶(-lactarnase)，可降解Ap。 ② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯 霉素乙酰转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化 而失效。 ③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能 修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。 四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变细 菌膜的蛋白，防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 ⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能 修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
（2）插入失活筛选法 外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点，导致载体Tcr基因 失活，重组子具有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr， 重组子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生长；非重组子 却在两种平板上都能生长。
β-galactosidase X-gal IPTG blue-coloured
1
第一节 转基因筛选和选择的方法 转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细 胞称为转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子被称为重组子 阳性克隆子：如果重组子中含有外源目的基因则又称 为阳性克隆子或期望重组子。 克隆子的筛选或选择：经过各种方法将外源DNA分子 导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克 隆子的筛选或选择。
（3）插入表达筛选法 插入表达法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛 选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。例如pTR262质 粒载体，其Tcr基因的上含有一段噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编 码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因 的表达。当外源DNA片断插入CI基因的 HindIII 或 Bgl I 位点上 时，CI基因失活，Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组 子为Tcr表型，含有外源DNA插入片断的阳性重组子的转化菌才 能生长成菌落。
（2）利用生化报告基因筛选植物转化细胞
① -葡萄糖酸苷酶（-Glucuronidase, GUS）基因 作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的-葡萄糖酸苷酶能够催化某些特殊反应的 进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测即可确定 Gus报告基因的表达情况，以此区分转化子和非转化子。
பைடு நூலகம்
② 潮酶素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase, HPT)基因 某些植物细胞株系（如水稻）对卡那霉素具有一定的抗性，利 用卡那霉素筛选NptII基因转化体时假阳性率高，这时可采用 Hpt报告基因进行筛选。潮霉素原是一种链霉菌的产物，通过 与70S和50S核糖体的结合来抑制许多原核生物与真核生物的 生长。HPT酶能催化ATP上的- 磷酸基团转移至潮霉素分子上 而使之失活。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③ 氯霉素乙酰转移酶（chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因 氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰 基转移酶的活性，从而阻断肽键的形成并最终抑制细胞生长。 CAT基因催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素失活。
1．根据载体选择标记初步筛选转化子 载体DNA分子上通常携带了一定的选择遗传标记基因，可 进行转化子或重组子初步筛选。做法是将转化处理后的菌液 （包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度 条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。 对于受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB 培养基中加入 适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分 子上携带的选择标记基因所决定。 （1）抗药性筛选法 （2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法
第七章 重组子选择、筛选和分析
（ The Selection, screening and analysis of recombinants）
教学目的与要求： 1 ) Genetic selection and screening methods 2) Screening clone banks by nucleic acid hybridization （Southern blotting，Northern blotting） 3) Immunological screening for expressed genes (Western blotting) 4) Analysis of cloned genes (Restriction mapping, DNA sequencing)