膜片钳实验技术(高级生理课程,201310)

膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜 电位的基础上改变膜电位，记 录离子通道电流的变化，记录 的是诸如通道电流；EPSC;IPSC 等电流信号。是膜片钳的基本 工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入 刺激电流，记录膜电位对刺激 电流的反应。记录的是诸如动 作电位，EPSP;IPSP等电压信号。
电压钳的原理： 用两根尖端直径0.5μm的电 极插入细胞内，一根电极用作 记录电极以记录跨膜电位，用 另一根电极作为电流注入电极， 以固定膜电位。从而实现固定 膜电位的同时记录膜电流。注 入电流的大小与跨膜离子流相 等，但方向相反。因而注入的 电流被认为是标本兴奋时的跨 膜电流值(通道电流)。
指令电位 （Vc)
机械系统:由于膜 片钳实验是一个 微电和微操作实 验，任何微小的 震动都会影响电 极和细胞的封接， 导致实验的失败， 因此一台高质量 的防震台是必须 的。
辅助系统：膜片钳实验系统是一个综合 性的集成系统，除了上面提到的几大系 统外，相关的辅助系统也是必不可少的， 辅助系统的设备好坏，很大程度上左右 着实验能否顺利开展，有的实验室主要 系统配臵十分主流，而辅助系统则凑合， 这将极大的影响实验，所谓细节决定成 败，用在膜片钳实验中是十分贴切的。
AXON200B
MultiClamp700B
EPC10
数据采集、分析系统
光学部件和光电接口：膜片钳实验是一 个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃 电极和细胞的封接，因此需要高质量的 显微镜和成像系统，如果所用的细胞是 培养的单个细胞，需要一台倒臵相差显 微镜，而如果所用的标本是脑片或其他 组织片，所用的光学系统必须是红外微 分干涉差成像系统，这样才能“看”到 组织中的单个的细胞，才能在可视条件 下进行组织膜片钳的操作。
膜片钳记录模式
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细胞吸附模式
Cell-attached mode; on-cell mode 细胞内环境保持正常条件下可对离子通道的活 动进行观察记录。 到达与电极接触的膜片外部，如果刺激浴液中 加入刺激物质不能有效，则说明刺激物质是经 过细胞内第二信使介导间接起作用。 不能人为直接控制细胞内环境条件，不能确切 判定细胞内电位，不清楚膜片上的实效电位。
核心部分是一场效应管运 算放大器构成的I-V转换器， 他的正负输入端子为等电 位。向正输入端子施加指 令电位（Vc）时，经过短 路负端子可使膜片等电位， 从而达到电位钳制的目的。 离子通道电流可作为I-V转 换器内的高阻抗反馈电阻 的电压降而被检测出。
Patch-clamp(膜片钳)技术
膜片钳放大器 探头
膜对离子的通透性可膜电导表示，通透
性高表示膜电导大，而膜电导与膜电阻 成反比。 根据欧姆定律：I=V/R=V*G G-膜电导
离子通道功能观察的两种技术 对离子通道功能的研究，主 要采用记录离子通道电流来间接 反映离子通道功能，目前有如下 两种技术 电压钳(Voltage clamp)技术 膜片钳(patch clamp)技术
1981年Hamill和Neher等对该技术进行
了改进，引进了膜片游离技术和全细胞 记录技术，从而使该技术更趋完善，具 有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨 率和10μs的时间分辨率。 1983年10月 《Single-Channel Recording》 一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。 Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和 突出贡献，荣获1991年诺贝尔奖。
mode)
Low Resistance Seal (50 M ) Suction Gigaohm Seal
KCl/Ca2+-Free Pulse of Suction or Voltage
Cell attached
Pull
Pull Pull Low Ca2+ Pull
Pull
Pull
Air Exposure
离子通道分类
电压门控离子通道: 钠通道 钙通道 电压门控钙通道：L,N,T,P,Q,R型； 配体调控性钙通道：IP3Rs,RyRs 钾通道 电压依赖性钾通道：Ikr,Iks, Ito, If等； 钙依赖性钾通道：BKCa,IKCa,SKCa等； 内向整流钾通道：KATP,KAch,IK1等； 氯通道 γ-氨基丁酸受体（GABA-R)
+
_
Vo
电位记录电极 （Vm)
电流注入电极 (I)
膜片钳技术是用微玻璃电极接触细胞膜，形成吉 欧姆（GΩ，109Ω ）以上的阻抗封接，使与电极尖端 开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电 学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子 通道的离子电流（pA级）进行检测记录的方法。 膜片钳是从Patch Clamp的翻译，Patch是小片， 小块的意思，这里指膜片，玻璃微电极与细胞膜紧密 封接的微区，这个膜片可大可小，大到整个细胞膜， 小到细胞膜上的一平方微米，Clamp是钳，夹的意思， 这里指固定，钳制的意思，指通过将patch上的膜电 位人为地控制在某一水平，或从一个水平瞬间跃迁到 另一水平，从而记录patch上的单个离子通道或整个 细胞膜上某一种类的离子通道的电流，从而通过记录 离子通道电流来反映离子通道的功能。
1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序 列；X光绕射方法确定其三维立体结构。 2. 功能研究：电生理测定通过离子通道的电 流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映 离子通道个体或群体的分子活动。 3.结构和功能相结合：利用基因突变技术在 一级结构的特定部位删除、添加或改变残基 的序列，然后检测突变后的功能改变。
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-） （德国细胞生理学家）
合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上 存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要， 可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病 的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。
膜片钳技术的常用记录形式
* 细胞贴附模式（Cell attached mode） * 膜外面向外模式（Outside-out mode）
* 膜内面向外模式（Inside-out mode）
* 全细胞模式（Whole-cell recording
mode）
常规全细胞模式（Conventional whole-cell

膜片钳记录模式
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பைடு நூலகம்
膜内面向外模式
Inside-out mode Open cell-attached inside-out mode 可直接自由经浴液调控细胞内液条件，可在和细胞 活动无关的形式下观察单一离子通道的活动。 细胞质出现渗漏，可能丢失细胞内某种离子通道的 调控因子。 Run down（Run up）现象：在细胞吸附模式，清 楚观察导离子通道的活动在膜片脱离细胞后逐渐消 失（或更活跃）的现象。

离子通道分类



配体门控离子通道: 嘌呤2X(P2X)非选择性阳离子通道：P2X1-7受体。 乙酰胆碱门控离子通道 钠离子内流。 γ-氨基丁酸受体（GABA-R)通道 GABAA：CI-内流； GABAB：CI-内流； 谷氨酸门控通道:阳离子内流 NMDA受体(N-methyl-D-Aspartic acid receptor) AMPA受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4isoxazoepionate receptor) KA受体(lainic acid receptor)
电子学部件：由于膜片钳检测的是pA级的微 电流信号，因此需要特殊的放大器及模数转换 器，目前国内使用的主流放大器主要是美国 AXON公司的200B和Multiclamp700B放大器 及德国HEKA公司的EPC10放大器。 200B是 电容反馈式放大器，噪声低，适合做单通道膜 片钳，Multiclamp700B和EPC10可通过软件 进行操作，自动化程度高。
Sutter公司微电极拉制器
P-97
P-2000
日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪
软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master 软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处 理软件，如Origin等软件。
MDC公司Pclamp采集和分析软件
EPC10全细胞记录Na＋电流
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Na＋电流
EPC10全细胞记录Na＋电流
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Na＋电流
（三）膜片钳实验基础
前面两部分介绍了膜片钳技术的原理及膜片钳 的系统组成，在此基础上本部分简要介绍： 膜片钳放大器的工作模式
膜片钳的记录方式
膜片钳实验基本过程
膜片钳记录的信息
膜片钳实验技术
南昌大学医学院生理学 教研室 梁尚栋
一、膜片钳技术发展的历史


1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜 电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电 流，从而产生了膜片钳（patch clamp）技术。 1980 年 Sigworth 等 在 记 录 电 极 内 施 加 5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封 接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声， 实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道 电流的突破。
模数转换
单细胞
样品池 计算机
（二）膜片钳实验系统组成
根据实验要求，可组建 不同的实验系统。但也 有一些共同的基本组成 部件，其中包括 电子学部件:放大器；计 算机接口，数据采集、 分析系统。 光学部件和光电接口： 显微镜；监视器等。 机械系统:防震台等。 辅助系统：电极拉制器； 切片机；孵育槽；灌流 系统等
内尔在实验室进行膜片箝研究工作
1983年10月第一版 《Single-Channel Recording》 封面
二、膜片钳实验技术
膜片钳技术基础及原理
膜片钳实验系统组成
膜片钳实验基础
膜片钳技术的应用
（一） 膜片钳技术基础及原理
细胞膜的结构和 离子通道：细胞 膜由脂质双分子 层和蛋白质组成， 蛋白质又包括整 合蛋白和表面蛋 白。

膜片钳记录模式
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膜外面向外模式
Outside-out
mode perforated vesicle outside-out mode 可自由改变细胞外液，记录单一离子通道的 电流 Run up (run down)
膜片钳记录模式
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全细胞模式
Conventional whole-cell mode (whole cell mode); Whole cell recording (WCR) Perforated patch mode (slow whole-cell mode) 可用电极腔内液对细胞进行透析，从而控制细胞内 环境。 细胞内可动小分子可从细胞内渗透到膜片电极腔内 液中。 可在电流钳制（current clamp）下测定细胞内电 位
离子通道是一种特殊的膜蛋 白，它横跨整个膜结构，是细胞 内部与部外联系的桥梁和细胞内 外物质交换的孔道。无机离子通 过离子通道的进出所产生的电活 动是生命活动的基础，只有在此 基础上才可能有腺体分泌、肌肉 收缩、基因表达、新陈代谢等生 命活动。离子通道结构和功能障 碍决定了许多疾病的发生和发展。
离子通道研究 对离子通道的研究主要从结构、功能以 及结构与功能的关系三方面进行研究
Whole cell recording
Outside-out patch
inside-out patch
膜片钳的几种记录模式极其形成：
Good and Bad Seals
In a patch recording, currents through the seal also flow through the measuring circuit, increasing the noise on the measured current.