膜片钳实验技术(高级生理课程,201310)
膜片钳实验与技术
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单击输入目录标题 膜片钳实验原理 膜片钳实验操作流程 膜片钳实验数据分析 膜片钳实验的应用实例
膜片钳实验的未来发展与挑战
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膜片钳实验原理
膜片钳技术的基本原理
膜片钳实验原理：通过玻璃微电极接触细胞膜，记录单一离子通道活动的 电位变化，从而研究细胞膜离子通道的特性。
膜片钳实验操作步骤
准备实验器材：包括膜片钳 放大器、微操纵器、微电极、
细胞夹持器等
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细胞贴片稳定：等待细胞贴 片稳定后，进行下一步操作
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开启膜片钳放大器：开启放 大器，调节放大器参数，确 保记录到有效的膜电流信号
数据记录：记录膜电流信号， 进行分析和处理
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新型膜片钳技术的研发，提高实验效率和准确性 应用人工智能技术，实现自动化数据分析与处理 结合其他技术手段，拓展膜片钳技术的应用领域 持续优化膜片钳设备，降低实验成本，提高普及率
膜片钳实验在多学科交叉中的应用前景
神经科学领域：研究神经元电活动与行为之间的联系 生理学领域：研究生物体的生理功能和机制 药理学领域：研究药物对细胞膜通道的影响和作用机制 生物医学工程领域：开发新型膜片钳技术，提高实验的灵敏度和特异性
膜片钳技术的特点：高灵敏度、高分辨率和高时间分辨率，能够记录单个 离子通道的活动。
膜片钳技术的应用范围：研究细胞膜离子通道的生理功能、药理作用和药 物作用机制等。
膜片钳实验的影响因素：电极内液的成分、温度、细胞内外的离子浓度和 pH值等。
膜片钳实验的应用范围
神经科学：研究神经细胞的电生理特性 药理学：药物对膜通道的影响 生理学：研究生物膜的离子通道功能 病理学：研究疾病状态下膜通道的异常变化
宁波神经生物学膜片钳技术原理
宁波神经生物学膜片钳技术原理神经科学中，膜片钳技术是一种非常重要的实验方法，可以用于记录细胞内外的电位变化。
宁波神经生物学膜片钳技术是一种经典的膜片钳技术，它是由中国神经科学家于1976年发明并发表的。
宁波神经生物学膜片钳技术是一种完美结合电荷动力学和化学物理学原理的技术，能够非常精确地记录神经元膜内外的电位变化。
宁波神经生物学膜片钳技术使用的是一种特殊的仪器，称为电压钳扳平仪。
它能够通过光学系统将微小的电压变化转换成可视化的信号。
在这个仪器的帮助下，实验者可以观察到细胞内的微小电位变化。
通常，这种变化只有几毫伏甚至只有几微伏。
该技术主要是通过控制电压钳的外径，使之与神经细胞的细胞膜缩在一起。
一旦电压钳缩在神经细胞膜上，就能够记录该细胞内外的电位变化。
使用宁波神经生物学膜片钳技术进行记录时，需要将一小块玻璃切成一小片，并将其与电压钳结合。
之后，将整个电路与一片外部电极连接，从而能够读取到神经细胞内外的电位变化。
一旦成功固定上述组件，实验者就可以观察到神经细胞膜上的电压变化。
通过对电位变化进行分析，实验者可以非常准确地计算神经细胞离子通道的开放概率。
宁波神经生物学膜片钳技术是一种非常重要而且精确的实验方法，能够帮助神经生物学研究者更好地了解神经元的电学性质。
该技术能够以先进、精确的方式记录细胞内外的电压变化，并通过对这些变化进行分析，获得对离子通道开放概率的准确计算。
利用宁波神经生物学膜片钳技术可以更深入地了解神经元病理生理学，为探索神经系统的基本问题提供有力的工具。
除了记录神经元膜内外的电位变化，宁波神经生物学膜片钳技术还可以用于研究离子通道动力学和突触传递。
利用该技术可以研究离子通道的不同类型、大小及其开放概率等，以及神经元膜上不同离子通道的作用关系，这对于理解神经元的电气特性和调节机制非常重要。
宁波神经生物学膜片钳技术还可以研究神经元突触传递信号的方式。
通过记录神经元膜内外电位变化，可以观察到神经元突触释放的神经递质导致的膜电位变化，并对神经元突触传递功能进行研究。
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
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膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
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在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳
膜片钳技术及其应用21世纪被称为生物学世纪，近数十年来，生命科学与生物技术取得了迅猛发展。
任何一项新的生物技术的诞生，均意味着生命科学的某个或某些领域将获得新的生命，其内容和内涵将得到扩大和延伸。
膜片钳技术的创建也为生命科学的研究带来了一场革命性的变化。
简介细胞是动物和人体的基本组成单元。
细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系。
细胞间与细胞内的通信，主要依靠其膜上的离子通道来进行。
离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦即产生生物电现象的基础。
生物电信号通常是用电学或电子学方法进行测量，由此形成一门用以揭示细胞生理过程的细胞电生理学。
早期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，自40年代末细胞膜和离子学说建立以来，细胞电活动的研究逐渐深入。
在1976～1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术（patch clamp technique）为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，膜片钳实验技术是对细胞和分子水平的生理学研究方法的一次革命，因而两位科学家于1991年荣获诺贝尔生理学或医学奖。
膜片钳实验技术为生理学、神经科学、细胞生物学等生命科学专业的研究和发展带来了新的生命。
膜片钳技术的发展历史膜片钳技术的发展历史也是一个科学的发展历程，回顾此过程或许对我们现在的研究和对问题的看法有所启示。
膜片钳技术的创立是建立在前人发明的电压钳(V oltage-clamp)和电流钳（Current-clamp）以及玻璃微电极(Glass micro-pipettee)的基础之上。
电压钳首先是由George Marmont和美国学者Kenneth S. Cole等提出，随后英国学者Alan L. Hodgkin、Andrew F. Huxley和Bernard Katz等最先应用的。
早在19世纪末20世纪初，Julius Bernstein就神经的电脉冲提出了“细胞膜假说”（membrane hypothesis）（1902和1912年），推测神经细胞的静息电位（resting potential）是由细胞膜对K＋离子的选择性通透所形成，而神经元的兴奋（即动作电位，action potential）是由于细胞膜对K＋离子的选择性通透性丧失所造成。
膜片钳技术原理及相关基本知识
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
感谢观看
膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。
该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解，而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新，同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。
本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。
1膜片钳技术基本原理与特点膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。
电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。
因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。
目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。
该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳重点技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道旳离子电流来反映细胞膜上单一旳或多数旳离子通道分子活动旳技术。
1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验措施和电子线路进行了改善，形成了当今广泛应用旳膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系旳研究，也是目前唯一可记录一种蛋白分子电活动旳措施，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大旳迈进动力，这一伟大旳奉献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术旳基本原理用一种尖端直径在1.5~3.0μm 旳玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上旳阻抗封接，此时电极尖端下旳细胞膜社区域（膜片，patch）与其周边在电学上分隔，在此基本上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上旳离子通道旳离子电流进行监测及记录。
基本旳仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录旳核心设备，具有高敏捷度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制旳同步记录离子流经通道所产生旳电流。
膜片钳放大器旳核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成旳电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定旳水平上。
二、操作环节1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管旳选择：有二种玻璃类型，一是软质旳苏打玻璃，另一是硬质旳硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可减少电极旳串联电阻，对膜片钳旳全细胞记录模式很有利；硬质玻璃旳噪声低，在单通道记录时多选用。
玻璃毛细管旳直径应符合电极支架旳规格，一般外部直径在1.1~1.2mm。
膜片钳记录和分析技术
膜片钳记录和分析技术2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：232186关键词：膜片钳细胞信号分享到：・收藏夹・腾讯微博* 新浪微博« 开心网习夏细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信，是依靠其膜上的离子通道进行的, 离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。
由此形成了一门细胞学科-电生理学(electrophysiology )，即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。
早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。
现代膜片钳技术是在电压钳技术的基，上发展起来的1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术(patch clamp recording technique )。
这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术)。
以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。
这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术( gene cloning )并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖、膜片钳技术发展历史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH20的负压吸引，得到10-100GW10-100G? 的高阻封接（Giga-seal ），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1g m的空间分辨率和10g s的时间分辨率1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
膜片钳实验技术应用
9.1膜片钳实验技术应用1背景知识细胞膜上的离子通道与膜内外不同类型离子构成细胞兴奋的基础，离子进出细胞产生了生物电信号，这通常用电学或电子学方法进行测量，进而逐渐形成一门细胞研究学科—电生理学（Electrophysiology），它是采用电生理方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。
早期的电生理方法多使用双电极电压钳技术来记录细胞内的电活动。
1976年德国马普生物物理化学研究所生物Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，于1991年荣获诺贝尔医学和生理学奖。
膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一具有重大意义的变革。
这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个）的离子通道分子活动的技术。
正如1991年诺贝尔颁奖词所述，膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来一场革命性的变化，它和基因克隆技术（gene cloning）并驾齐驱，给生命科学研究带来巨大的前进动力。
膜片钳(patch clamp)按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳(current clamp)。
膜片钳技术及其应用实例
2、CdCl2和NiCl2对小鼠生精细胞Ca2+电流的作用比较
激活曲线： 分析细胞膜电位的 变化引起激活离子 通道数的变化。半 数激活电压 (-49.430.62)mV， 斜率因子 (6.050.55)mV， 在-65mV到-10mV 通道开放。
Normalizedcurentamplitude/conductane
小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征
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二、膜片钳技术
1976年 德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann 在青蛙肌细胞上记录记录到ACh激活的单通道离子电流 1980年 Sigworth等用负压吸引，得到10-100GΩ的高 阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声 1981年 Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细 胞记录技术 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问 世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
4、硝苯地平(nifedepine)对小鼠生精细胞T型钙电流的作用
不同浓度硝苯地平对小鼠 粗线期精母细胞T型Ca2+电 流的作用
在本试验条件下，我们记录到的小鼠生精细胞内向 电流经过通道电生理学特性和药理学特性两个角度 鉴定，证实记录到的为T型Ca2+电流，无L型Ca2+通道 电流成分。并结合精子发生特点，提示精子顶体反 应时Ca2+的内流主要由胞膜T型Ca2+通道完成。
膜片钳实验技术入门---基本原理与操作
膜片钳实验技术入门------基本原理与操作关兵才 李国华 刘理望按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。
因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。
【实验目的】1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。
2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。
【实验原理】一、膜片钳技术原理简介膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。
电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。
若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。
另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。
下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。
（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。
）根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。
(一)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。
图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。
膜片钳技术
配体门控性离子通道（ligand-gated ion channel）
电压门控性离子通道（voltage-gated ion channel）
离子通道开关要经过三种以上状态转换：
（二）两个重要的方程：
HUST
Ohm’s law：
I=gE or E=IR or I=E/R
Nernst equation：
HUST
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不 损害细胞膜的完整性;
用于单通道记录（single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
内面向外式：
HUST
Inside-out configuration
Vh=-80mv Vt=-40mv Unitary
current=2.2pA
2. K+通道电流记录：全细胞记录HUST
K+通道电流记录：单通道记录HUST
Cell-attached
1 pA
Inside-out
0
50
100
150 0
50
100
150
Time (ms)
Time (ms)
3. Ca2+通道电流记录：全细胞记录HUST
电压门控（依赖性）离子通道
3. 膜片钳技术 HUST
Patch-clamp techniques
1980年前后，Neher and Sakmann实验室发明 膜片钳技术，引发电生理 技术一次革命性的突破:
封接阻抗: Giga-seal GΩ级 （109 Ω)
记录电流：pA级（10-12A)
Neher and Sakmann 获1991年诺贝尔生理学或医
徐州细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤
徐州细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤
徐州细胞生物学膜片钳电生理技术是一种研究细胞膜离子通道的有效方法，其原理基于细胞膜上存在离子通道，可以使用微型电极记录离子通道的开放和关闭过程。
该技术以下列步骤进行：
1.制备微型电极：将细的玻璃管拉制成具有微小开口的电极，称为玻璃微针电极。
2.制备膜片：从细胞培养皿中取出细胞，并在适当的缓冲液中制成膜片，通常使用人工贴附法或机械剪切法制备薄膜。
3.在膜片上形成电极：将玻璃微针电极与膜片接触，通过微小的吸引力将玻璃微针电极吸附在膜片上。
4.形成紧密接触：通过微小的压力和真空吸附使玻璃微针电极与膜片紧密连接。
5.记录电流：使用电极记录器测量微小电流变化，记录离子通道的活动。
通过这些步骤，可以实现对单个离子通道的记录和分析，从而研究离子通道的特性和功能。
膜片钳实验技术
脑片膜片钳实验方法文献综述一1966年，Yamamoto和McIlwain首次在脑片上记录了电生理活动(1966a, b)，证实了脑组织在体外也能存活，并保持很好的活性状态。
此后，该方法在生理学研究中的应用越来越广泛，并为中枢神经系统生理和药理学领域突飞猛进的发展奠定了基础。
1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来，建立了脑片膜片钳记录技术，这为在细胞水平研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药理学作用及其机制提供了可能性。
在脑片电生理记录中，实验者可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等；另外，实验者还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极，同时，可借助一些特殊的加药装置，将一定浓度的药物加到整个脑片或是脑片上的特定区域上，研究电信号沿神经环路的传递规律。
在电生理学实验结束后，活性较好的脑片还可用于生物化学或解剖学的分析。
这些优点使实验者能获得准确的神经生理学的研究结果，也是其应用较在位大脑广泛的原因所在。
海马脑片是中枢神经系统研究中应用最为广泛标本之一。
其原因有以下几点：1、海马与脑的其它部位相对隔离，较易剥离，且剥离后受到的损伤较小；2、海马具有高度分化的片层结构，一方面，海马神经环路在片层中的分布有一定的空间规律，如锥体细胞胞体分布在锥体细胞层，而雪氏侧支突触分布于辐射层，且海马中存在一个三突触联系的回路，即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏侧支-CA1区锥体细胞层等，因此，在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应；另一方面，这种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。
这些都使海马成为电生理学研究的理想标本。
本文对海马脑片膜片钳的操作规程及注意事项总结如下。
一、海马脑片的制备脑片制备中，海马分离应在断头后10分钟内完成，5~6分钟为宜。
6、膜片钳实验流程
膜片钳记录系统仪器简介：膜片钳技术是细胞电生理方面的高端技术，是研究细胞膜离子通道的重要工具。
目前细胞膜离子通道的研究已经应用到了药物作用、环境对细胞膜离子通道的影响、神经网络研究以及疾病的诊断和治疗等多个领域。
膜片钳技术是神经科学、心血管、药物学和药效学、功能基因组学和许多遗传病深入研究的有力手段。
仪器名称：膜片钳记录分析系统主要设备：PC-2B放大器、AXON200B放大器、正置显微镜、倒置显微镜、NIR-DIC 成像系统、水镜头、微操纵器、微电极拉制仪、抛光仪、振动切片机等。
仪器功能及应用范围：单细胞膜片钳记录（急性分离细胞、培养细胞）、脑片膜片钳记录（盲法、可视法）收费标准：培训费：1个月以内—500元；1~3个月—1000元。
指导操作：院内20元/小时，院外40元/小时。
独立操作：院内60元/天，院外120元/天（由两位指导老师认可培训合格，方可进行独立操作）。
开放时间：周一至周五管理规定：⑴膜片钳记录分析系统属于高端精密仪器，因此任何进入本室进行膜片钳实验的人员，必须经过本室专门人员培训合格认可后，经允许方可进行膜片钳放大器、微操纵器、拉制仪、切片机、显微镜等仪器的操作。
⑵在实验过程中，必须严格按照实验流程进行操作，不得擅自更改操作步骤，不许自行调改仪器设置，以免造成仪器毁损。
⑶仪器损坏赔偿事宜按照我室赔偿制度进行处理。
⑷统一安排实验时间，使用仪器后作登记。
⑸实验人员负责当天的水电安全和室内卫生。
脑片膜片钳实验流程(PC-2B)一、脑片制作1.配制新鲜蔗糖溶液（4°C）和NaCl孵育液（室温，20~25°C）各1L。
2.用丙酮浸泡刀片30 min。
3.麻醉动物：爪蟾—MS-222，大鼠—乌拉坦。
4.解剖动物，取脑组织。
5.切片：根据不同的动物和组织选择不同的方案。
方案一：低熔点琼脂包埋组织后进行切片。
方案二：普通琼脂作托进行切片。
6.处理脑片：蔗糖溶液中40～60min（4°C或32°C）。
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Sutter公司微电极拉制器
P-97
P-2000
日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪
软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master 软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处 理软件，如Origin等软件。
MDC公司Pclamp采集和分析软件
膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜 电位的基础上改变膜电位，记 录离子通道电流的变化，记录 的是诸如通道电流；EPSC;IPSC 等电流信号。是膜片钳的基本 工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入 刺激电流，记录膜电位对刺激 电流的反应。记录的是诸如动 作电位，EPSP;IPSP等电压信号。
AXON200B
MultiClamp700B
EPC10
数据采集、分析系统
光学部件和光电接口：膜片钳实验是一 个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃 电极和细胞的封接，因此需要高质量的 显微镜和成像系统，如果所用的细胞是 培养的单个细胞，需要一台倒臵相差显 微镜，而如果所用的标本是脑片或其他 组织片，所用的光学系统必须是红外微 分干涉差成像系统，这样才能“看”到 组织中的单个的细胞，才能在可视条件 下进行组织膜片钳的操作。
膜片钳记录模式
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细胞吸附模式
Cell-attached mode; on-cell mode 细胞内环境保持正常条件下可对离子通道的活 动进行观察记录。 到达与电极接触的膜片外部，如果刺激浴液中 加入刺激物质不能有效，则说明刺激物质是经 过细胞内第二信使介导间接起作用。 不能人为直接控制细胞内环境条件，不能确切 判定细胞内电位，不清楚膜片上的实效电位。
+
_
Vo
电位记录电极 （Vm)
电流注入电极 (I)
膜片钳技术是用微玻璃电极接触细胞膜，形成吉 欧姆（GΩ，109Ω ）以上的阻抗封接，使与电极尖端 开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电 学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子 通道的离子电流（pA级）进行检测记录的方法。 膜片钳是从Patch Clamp的翻译，Patch是小片， 小块的意思，这里指膜片，玻璃微电极与细胞膜紧密 封接的微区，这个膜片可大可小，大到整个细胞膜， 小到细胞膜上的一平方微米，Clamp是钳，夹的意思， 这里指固定，钳制的意思，指通过将patch上的膜电 位人为地控制在某一水平，或从一个水平瞬间跃迁到 另一水平，从而记录patch上的单个离子通道或整个 细胞膜上某一种类的离子通道的电流，从而通过记录 离子通道电流来反映离子通道的功能。
EPC10全细胞记录Na＋电流
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Na＋电流
EPC10全细胞记录Na＋电流
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Na＋电流
（三）膜片钳实验基础
前面两部分介绍了膜片钳技术的原理及膜片钳 的系统组成，在此基础上本部分简要介绍： 膜片钳放大器的工作模式
膜片钳的记录方式
膜片钳实验基本过程
膜片钳记录的信息
膜片钳记录模式
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膜外面向外模式
Outside-out
mode perforated vesicle outside-out mode 可自由改变细胞外液，记录单一离子通道的 电流 Run up (run down)
膜片钳记录模式
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全细胞模式
Conventional whole-cell mode (whole cell mode); Whole cell recording (WCR) Perforated patch mode (slow whole-cell mode) 可用电极腔内液对细胞进行透析，从而控制细胞内 环境。 细胞内可动小分子可从细胞内渗透到膜片电极腔内 液中。 可在电流钳制（current clamp）下测定细胞内电 位
膜对离子的通透性可膜电导表示，通透
性高表示膜电导大，而膜电导与膜电阻 成反比。 根据欧姆定律：I=V/R=V*G G-膜电导
离子通道功能观察的两种技术 对离子通道功能的研究，主 要采用记录离子通道电流来间接 反映离子通道功能，目前有如下 两种技术 电压钳(Voltage clamp)技术 膜片钳(patch clamp)技术
1981年Hamill和Neher等对该技术进行
了改进，引进了膜片游离技术和全细胞 记录技术，从而使该技术更趋完善，具 有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨 率和10μs的时间分辨率。 1983年10月 《Single-Channel Recording》 一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。 Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和 突出贡献，荣获1991年诺贝尔奖。
电压钳的原理： 用两根尖端直径0.5μm的电 极插入细胞内，一根电极用作 记录电极以记录跨膜电位，用 另一根电极作为电流注入电极， 以固定膜电位。从而实现固定 膜电位的同时记录膜电流。注 入电流的大小与跨膜离子流相 等，但方向相反。因而注入的 电流被认为是标本兴奋时的跨 膜电流值(通道电流)。
指令电位 （Vc)
膜片钳技术的常用记录形式
* 细胞贴附模式（Cell attached mode） * 膜外面向外模式（Outside-out mode）
* 膜内面向外模式（Inside-out mode）
* 全细胞模式（Whole-cell recording
mode）
常规全细胞模式（Conventional whole-cell
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-） （德国细胞生理学家）
合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上 存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要， 可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病 的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。
内尔在实验室进行膜片箝研究工作
1983年10Βιβλιοθήκη 第一版 《Single-Channel Recording》 封面
二、膜片钳实验技术
膜片钳技术基础及原理
膜片钳实验系统组成
膜片钳实验基础
膜片钳技术的应用
（一） 膜片钳技术基础及原理
细胞膜的结构和 离子通道：细胞 膜由脂质双分子 层和蛋白质组成， 蛋白质又包括整 合蛋白和表面蛋 白。
离子通道是一种特殊的膜蛋 白，它横跨整个膜结构，是细胞 内部与部外联系的桥梁和细胞内 外物质交换的孔道。无机离子通 过离子通道的进出所产生的电活 动是生命活动的基础，只有在此 基础上才可能有腺体分泌、肌肉 收缩、基因表达、新陈代谢等生 命活动。离子通道结构和功能障 碍决定了许多疾病的发生和发展。
离子通道研究 对离子通道的研究主要从结构、功能以 及结构与功能的关系三方面进行研究
mode)
Low Resistance Seal (50 M ) Suction Gigaohm Seal
KCl/Ca2+-Free Pulse of Suction or Voltage
Cell attached
Pull
Pull Pull Low Ca2+ Pull
Pull
Pull
Air Exposure
1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序 列；X光绕射方法确定其三维立体结构。 2. 功能研究：电生理测定通过离子通道的电 流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映 离子通道个体或群体的分子活动。 3.结构和功能相结合：利用基因突变技术在 一级结构的特定部位删除、添加或改变残基 的序列，然后检测突变后的功能改变。
离子通道分类
电压门控离子通道: 钠通道 钙通道 电压门控钙通道：L,N,T,P,Q,R型； 配体调控性钙通道：IP3Rs,RyRs 钾通道 电压依赖性钾通道：Ikr,Iks, Ito, If等； 钙依赖性钾通道：BKCa,IKCa,SKCa等； 内向整流钾通道：KATP,KAch,IK1等； 氯通道 γ-氨基丁酸受体（GABA-R)
Whole cell recording
Outside-out patch
inside-out patch
膜片钳的几种记录模式极其形成：
Good and Bad Seals
In a patch recording, currents through the seal also flow through the measuring circuit, increasing the noise on the measured current.
离子通道分类
配体门控离子通道: 嘌呤2X(P2X)非选择性阳离子通道：P2X1-7受体。 乙酰胆碱门控离子通道 钠离子内流。 γ-氨基丁酸受体（GABA-R)通道 GABAA：CI-内流； GABAB：CI-内流； 谷氨酸门控通道:阳离子内流 NMDA受体(N-methyl-D-Aspartic acid receptor) AMPA受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4isoxazoepionate receptor) KA受体(lainic acid receptor)
核心部分是一场效应管运 算放大器构成的I-V转换器， 他的正负输入端子为等电 位。向正输入端子施加指 令电位（Vc）时，经过短 路负端子可使膜片等电位， 从而达到电位钳制的目的。 离子通道电流可作为I-V转 换器内的高阻抗反馈电阻 的电压降而被检测出。
Patch-clamp(膜片钳)技术
膜片钳放大器 探头
模数转换
单细胞
样品池 计算机
（二）膜片钳实验系统组成
根据实验要求，可组建 不同的实验系统。但也 有一些共同的基本组成 部件，其中包括 电子学部件:放大器；计 算机接口，数据采集、 分析系统。 光学部件和光电接口： 显微镜；监视器等。 机械系统:防震台等。 辅助系统：电极拉制器； 切片机；孵育槽；灌流 系统等