Wnt10b在毛囊周期调控中的作用及机制研究

Wnt10b在毛囊周期调控中的作用及机制研究第三军医大学博士学位论文Wnt10b在毛囊周期调控中的作用及机制研究姓名:李玉红申请学位级别:博士专业:细胞生物学指导教师:杨恬 2011-05 第三军医大学博士学位论文 Wnt10b 在毛囊周期调控中的作用及机制研究摘要背景毛囊是具有周期性生长特性的一个特殊器官，毛囊周期分为生长期、退化期和静止期。在静止期，毛囊细胞受到某些因素的刺激，会再次进入生长期，如此周而复始在哺乳动物的整个生命期间循环往复。毛囊经历生长期、退化期、静止期循环后再次进入生长期的过程称为毛囊周期性再生。由于毛囊具有周期性生长的特性，为组织再生研究提供了一个非常好的模型。如果毛囊各周期转换中的任何一个环节出现问题，就可能会影响毛囊的生长，进而出现毛囊相关疾病，例如脱发、斑秃等。而斑秃等的治疗在机制研究和临床研究上还存在诸多问题，如容易复发等。因此，毛囊周期的调控就显得至关重要，毛囊周期由毛囊干细胞介导发生。毛囊干细胞的激活和静息受到多种信号通路的调控，包括 Wnt 信号通路、BMP 信号通路、FGF 信号通路、Shh 信号通路等。Wnt 信号通路广受关注，它分为经典 Wnt 信号通路和非经典 Wnt 信号通路，在毛囊的发育和周期性再生中发挥着重要的调控作用。经典Wnt 信号通路研究较多，在经典 Wnt 信号通路的各个重要环节进行阻断，均会严重影响毛囊的生成。激活 Wnt 信号通路的 Wnt 蛋白有 19 种，但在毛囊周期性再生中，哪种或哪几种发挥关键作用，还不得而知。作者通过文献筛选，发现Wnt10b 在皮肤附件发育时具有最明显的限制性表达，即特异性地表达于毛囊发育早期的基板。而毛囊的周期性再生过程与毛囊发育具有相似性，因此，作者推测Wnt10b 在毛囊周期调控中发挥着重要作用。目的与意义本课题拟研究Wnt10b在毛囊周期调控中发挥的具体作用，并探讨其作用机制。为研究基于Wnt蛋白的治疗毛囊周期性再生障碍相关疾病的药物提供基础。材料与方法 1. Wnt10b在毛囊周

期中的表达观察 ?用免疫组化的方法观察Wnt10b蛋白在小鼠生后正常周期毛囊中的表达特性，并采用免疫印迹方法对小鼠各周期中皮肤全层Wnt10b的表达进行半定量分析; ?制备地高辛标记的Wnt10b RNA探针，观察Wnt10bmRNA在小鼠生后正常周期毛 7 第三军医大学博士学位论文囊中的表达状况，并采用逆转录PCR的方法对小鼠各周期中皮肤全层Wnt10b的mRNA表达进行半定量分析。 2. Wnt10b 对毛囊的作用研究 ?利用 HEK-293 细胞扩增，CsCl 超速离心纯化 AdWnt10b，验证腺病毒介导目的基因的生物学活性; ?解剖显微镜分离触须毛囊，建立器官培养模型，并通过荧光染色对模型进行评价，然后用 AdWnt10b 处理培养毛囊，离体观察Wnt10b 对毛囊的影响; ?在小鼠背部皮内注射腺病毒，并通过直接观察荧光、X-gal 染色等方法对动物模型进行评价，然后在不同时相点注射 AdWnt10b，在体观察 Wnt10b 对毛囊的影响。 3. Wnt10b 的信号通路研究 ?用免疫组化检测正常毛囊周期中经典 Wnt 信号通路中的关键分子 Frizzled、Lef1、TCF3 的蛋白表达，并分别通过原位杂交和免疫组化对β-catenin 的原位 mRNA和蛋白表达进行检测，与 Wnt10b 的表达情况进行对比，进一步利用 PCR array 技术，检测毛囊不同周期 Wnt 信号分子间的表达差异; ?在毛囊器官培养模型上，利用腺病毒载体从细胞膜受体水平、细胞浆水平和细胞核转录水平分别阻断经典 Wnt 信号通路的关键分子后，观察其对 AdWnt10b 诱导毛干生长作用的影响; ?静止期小鼠拔毛诱导毛囊生长，然后利用腺病毒载体从细胞膜受体水平、细胞浆水平和细胞核转录水平分别阻断经典 Wnt 信号通路的关键分子，观察毛囊生长情况;在以上各在体动物注射模型上，利用腺

病毒介导的β-catenin 干扰序列干扰经典 Wnt信号通路后，观察其对

Wnt10b 诱导

毛囊周期性再生作用的影响。 4.Wnt10b 在毛囊周期中的作用机制研究 ?通过

BrdU 标记检测 Wnt10b 诱导后不同时相点皮肤及毛囊细胞的增殖情况; ?通过免

疫荧光和免疫印迹研究 Wnt10b 在 JB6 细胞系中过表达后对细胞分化的影响。结

果与讨论 1. Wnt10b表达与毛囊周期具有时空相关性 Wnt10b蛋白和mRNA在静止

期无表达，在退化期的近心端(靠近真皮一端)内外根鞘有弱表达，在生长期的毛

母质强表达，生长期的内外根鞘及前体细胞也有表达。说明Wnt10b与毛囊周期密切

相关，可能在毛囊的周期性再生中发挥重要的调控作用。 2. Wnt10b 能够诱导毛囊

周期性再生 8 第三军医大学博士学位论文本实验所扩增的腺病毒具有生物学活

性;研究发现经 AdWnt10b 处理的器官培养毛囊，其毛干生长的速度明显比对照组

快，此离体说明 Wnt10b 对毛囊生长有促进作用;用 AdWnt10b 注射小鼠背皮后，

能够在注射部位观察到绿色荧光，说明该腺病毒能够用于在体皮内注射;注射AdWnt10b 后，生长期和退化期的毛囊无变化，而静止期毛囊提前进入生长期，此

在体说明 Wnt10b 能诱导毛囊周期性再生。 3. Wnt10b 经由经典 Wnt 信号通路发

挥诱导毛囊周期性再生作用检测正常毛囊周期中经典 Wnt 信号通路中关键分子

Frizzled、Lef1、TCF3 的蛋白表达，并对β-catenin 的原位 mRNA 和蛋白表达进

行检测，发现它们与 Wnt10b 的表达相关联。进一步通过 PCR array 分析也发现，

生长期的经典 Wnt 信号分子显著高于静止期和退化期;在毛囊器官培养模型上，

阻断经典 Wnt 信号通路关键分子后，能够阻断 AdWnt10b 诱导毛干生长的作用，

此离体研究说明 Wnt10b 经由经典 Wnt 信号通路促进毛干生长;在体动物注射模

型上，干扰经典 Wnt 信号通路关键分子β-catenin 后，能够阻断 AdWnt10b 诱导

毛囊周期性再生的作用，此在体研究说明 Wnt10b 经由经典Wnt 信号通路诱导毛囊

的周期性再生。 4. Wnt10b 可能通过诱导表皮基底层细胞增殖、分化而启动毛囊周

期性再生 BrdU 标记检测增殖发现 Wnt10b 诱导后 24h，表皮基底层细胞最先发生

增殖，然后全层皮肤和毛囊细胞发生增殖。提示 Wnt10b 可能通过直接或间接作用

于表皮基底层细胞，来发挥诱导毛囊周期性再生的作用; Wnt10b 诱导表皮基底层