4章 核酸序列分析

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核酸序列分析

核酸序列分析

第4章核酸序列分析了解:1.DNA携带的两类遗传信息。

2.DNA与RNA序列分析的常见内容及相关数据库和工具。

3.ORF与CDS的区别。

4.原核基因和真核基因启动子的结构。

5.原核和真核的基因结构。

6.lncRNA的研究现状。

熟悉:1.限制性核酸内切酶的命名规则,II型限制酶的特点。

2.重复序列依重复次数和组织形式的分类。

3.基因识别的三大类方法。

4.miRNA及其靶基因预测的方法和工具。

掌握:1.CpG岛的概念及其识别依据和判别标准。

2.mRNA选择性剪接的产生机制。

3.解决问题的思路。

4.查找数据库和分析工具的方法。

5.学习数据库与分析工具使用方法的策略。

4.1引言“龙生龙,凤生凤,老鼠的儿子会打洞!”1“种瓜得瓜,种豆得豆。

”“爹矬矬一个,娘矬矬一窝。

”“一母生九子,连母十个样。

”“龙生九子各不同。

”“天下乌鸦一般黑。

”这些都是大家耳熟能详的谚语。

不管是天上飞的、地上跑的、水里游的,还是能动的、不能动的,它们的后代都和它们非常相像,但却也会有少许的差异。

这些现象大家都已司空见惯,所以可能没有啥感觉。

但仔细想想,你就会发现大自然的奇妙所在。

当然,对于生物专业的人来说,这个就没什么奇怪的了,因为我们都知道分子生物学的中心法则(The central dogma of molecular biology):DNA转录成RNA,RNA翻译成蛋白质。

蛋白质执行特定的生物功能从而决定最终的表型,而DNA则携带着最原始的决定个体性状的遗传信息,RNA主要参与遗传信息的表达和调控。

在各种生物中,A、C、G、T/U都是构成DNA和RNA核酸序列的基本组分。

仅仅这么四种碱基怎么可能构建出缤纷多彩的大千世界呢?其秘诀就在于四种核苷酸的排列顺序。

就像搭积木一样,通过不同的排列组合我们可以构建出不同的形状。

类似于二进制中运用一连串的0和1以及英文字母表中运用26个不同的字母来表达信息,基因所包含的信息来自于4中不同核苷酸沿DNA 分子的排列顺序。

核酸与蛋白质序列分析

核酸与蛋白质序列分析
光学测序
光学测序技术利用光信号的变化来检测DNA或RNA序列, 具有高分辨率和高灵敏度等优点,是未来测序技术的重要 发展方向。
人工智能在序列分析中的应用
序列比对
人工智能算法能够快速准确地比对新序列与已知序列之间的相似 性和差异性,有助于发现新的基因和变异。
结构预测
人工智能可以预测蛋白质的三维结构,有助于理解蛋白质的功能和 相互作用机制Maxam-Gilbert和Sanger的DNA测序方法,以及 primer extension method等。这些方法可以提供核酸序列 的精确信息,但通量较低。
下一代测序(NGS)
随着技术的发展,出现了高通量的下一代测序技术,如 Illumina、SOLiD、Ion Torrent和PacBio等。这些技术可以 同时测定大量核酸序列,大大提高了测序速度和通量。
诊断标志物筛选
基于蛋白质序列分析,筛选与疾病相关的生物标志物,用于疾病的早期诊断和预后评估。
04
序列分析的挑战与未来发展
高通量测序技术的局限性
成本高昂
01
尽管高通量测序技术已经显著降低了测序成本,但仍相对昂贵,
限制了其在某些领域的应用。
数据解读难度大
02
高通量测序产生的数据量庞大,需要专业的生物信息学分析方
顺序。
酶降解法
利用特定的酶将蛋白质分解为肽段, 再测定各肽段的氨基酸序列。
自动测序法
利用特定的仪器自动进行蛋白质的 测序,如质谱仪和液相色谱仪等。
蛋白质的变异与修饰
基因突变
由于基因突变导致蛋白质合成过程中出现氨基酸 替换或缺失,从而影响蛋白质的功能。
磷酸化
蛋白质上的特定氨基酸残基被磷酸化,影响蛋白 质的活性、定位和稳定性。

核酸序列分析

核酸序列分析

思考题
1.第一代DNA测序技术的核心技术 A.Sanger的双脱氧链终止法 B.Maxam和Gilbert的化学降解法 C.荧光标记技术 D.PCR技术 E.DNA自动分析技术
2. Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物
A. NTP
B. dNTP
C. ddNTP
D. a-32P-dNTP E. a-35S-dNTP
• 反应体系中包含:模板 DNA,
Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测 序引物;
• 反应过程:
变性-复性-延伸-终止
双脱氧链终止法基本原理:
➢利用DNA聚合酶不能
够区分dNTP和ddNTP的
特性,使ddNTP参入到
寡核苷酸链的3’-末端。
因为ddNTP 3’不是-OH,
不能与下一个核苷酸聚
合延伸,从而终止DNA 链的增长。
目前,应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems ,ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管 电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。
如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管,4种双脱氧核 苷酸的碱基分别用不同的荧光标记,在通过毛细管时不同长 度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发,发出不同颜色 的荧光,被CCD检测系统识别,并直接翻译成DNA序列。
2011:5000美元测定一个人类基因组 2014:上万元测定一个人类基因组
未来目标:1000/100 美元测定一个人类基因组
1、第一代DNA测序技术
第一代DNA测序技术: 传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及在它们的基
础上发展来的各种DNA测序技术。
第一代DNA测序技术包括:双脱氧链终止法、化学降 解法、荧光自动测序技术。

核酸序列分析

核酸序列分析
概念: 概念: 电泳 electrophoresis 带电的物质在电场中的趋向运动。 带电的物质在电场中的趋向运动。 凝胶电泳 Gel electrophoresis 以琼脂糖和聚丙酰胺为支持介质 的电泳技术。 的电泳技术。
琼脂糖凝胶电泳
在PH3.5时,碱基上的氨基基团解离, PH3.5时 碱基上的氨基基团解离, 而三个磷酸基团只有一个解离, 而三个磷酸基团只有一个解离,整个核 酸分子带正电荷。 酸分子带正电荷。 PH值为8.0-8.3时 碱基几乎不解离, 值为8.0 在PH值为8.0-8.3时,碱基几乎不解离, 磷酸全部解离,核酸分子带负电荷。 磷酸全部解离,核酸分子带负电荷。若 将由PH8.0 PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 将由PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 场中, 场中,核酸分子由于带负电会向正极泳 动。
Maxam-Gibert

化学修饰法测定 DNA序列的原理

5 -GATCACTACTG-3

5 -GATCACTACTG-3

G
G+A
C+T
C
G
G+A
T+C
C
DNA测序自动化和大规模测序
双脱氧法和化学修饰法的缺点: 双脱氧法和化学修饰法的缺点: 放射性 操作步骤烦琐 效率低 读片过程慢
激光测序法 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA DNA的互 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA的互 补链。 补链。 引物标记系统: 引物标记系统: 四种不同的荧光染料标 记引物。 记引物。 终止标记系统: 终止标记系统:4种不同的荧光染料标记 四种双脱氧核糖核酸

大片段DNA 大片段DNA 序列测定的策略
鸟枪法 互套式缺失法 引物延伸法

核酸序列分析

核酸序列分析

核酸序列分析在生物学领域中,核酸序列分析是一项重要的研究工具,它可以帮助科学家们理解生物体内的基因组结构和功能。

通过分析核酸序列,我们可以揭示基因的组合方式、基因在不同物种之间的演化关系以及基因与疾病之间的关联。

本文将介绍核酸序列分析的基本步骤和常用方法,并探讨它在生物研究中的应用。

一、核酸序列分析的基本步骤1. 数据收集与清洗:首先,我们需要获取相关的核酸序列数据。

这些数据可以来自于公共数据库(如GenBank、ENSEMBL等)或实验室内部的测序项目。

收集到的数据可能存在噪声或错误,所以我们需要对数据进行清洗和筛选,以保证分析的准确性。

2. 序列比对:接下来,我们需要将不同样本的核酸序列进行比对。

序列比对是核酸序列分析的核心步骤之一,它可以帮助我们发现序列之间的相似性和差异性。

常用的序列比对算法包括Smith-Waterman算法和Needleman-Wunsch算法等。

3. 序列注释:在比对完成后,我们可以根据已知的功能注释信息来对序列进行注释。

注释可以告诉我们该序列可能的编码蛋白质的功能、寻找潜在的基因等。

4. 比对结果分析:通过分析比对结果,我们可以了解到序列的保守区域和变异区域。

保守区域可能是功能区域,例如编码蛋白质的区域,变异区域可能涉及到物种之间的进化差异或突变相关的功能。

5. 结果可视化:最后,我们需要将分析的结果进行可视化呈现。

通过可视化,我们可以更直观地理解数据,并对进一步实验设计或研究方向提出建议。

二、核酸序列分析的常用方法1. 比对工具:常用的核酸序列比对工具包括BLAST、ClustalW和MAFFT等。

BLAST(基本局部比对序列工具)是一种快速的局部比对算法,它能够快速地找到序列之间的相似性。

ClustalW和MAFFT则更适用于多序列比对,它们可以比较多个序列之间的相似性和差异性。

2. 注释工具:常用的核酸序列注释工具包括NCBI的Entrez、ENSEMBL和UniProt等。

生物化学中的核酸序列分析

生物化学中的核酸序列分析

生物化学中的核酸序列分析生物化学是研究生命现象与生理功能的科学,而核酸是构成生命的分子之一,它们在生物体内扮演着重要的角色。

核酸是由核苷酸单元组成的长链,其中DNA是一个双螺旋分子,可以储存生物遗传信息,而RNA则可以转录DNA的信息并参与蛋白质合成。

在生物研究中,对核酸序列的分析非常重要。

通过对DNA序列的分析,可以推测出蛋白质编码信息并预测基因功能;而对RNA序列的分析,则可以了解基因的表达和调控。

本文将从分子生物学和生物信息学的角度来探讨核酸序列分析。

1. PCR扩增与测序分析PCR(聚合酶链式反应)是一种常用的分子生物学技术,可以从少量的DNA或RNA样品中扩增出目标片段,为进一步的分析提供足够的材料。

PCR过程中需要用到一组引物,其可以通过生物信息学分析DNA序列寻找到设计合适的引物。

PCR扩增得到的产物可以进一步进行测序分析,最常用的测序方式为Sanger测序技术。

此技术基于DNA链延伸过程中的dNTP和ddNTP的竞争关系,通过荧光信号和电泳进行测序。

测序结果可以通过生物信息学工具进行比对、序列注释和统计分析。

2. 基因功能预测高通量基因组测序技术的出现,导致了大量未知基因序列的暴增。

对于这些基因序列的功能预测,通常需要先进行同源比对。

同源比对基于多序列比对的原理,将物种间已知的方向同源序列,与未知序列比对,寻找到相似的序列区域,从而对未知序列的基因功能进行推测。

同源比对时,需要注意序列的物种来源和序列的质量。

不同物种间的序列可能在不同位置发生突变,导致序列的比对不准确;若序列存在较多的突变,也可能会影响比对结果。

因此,如何选择合适的工具和参数进行同源比对很关键。

同时,基因家族和重复序列也可能会干扰比对结果,因此需要进行筛除和过滤。

3. RNA测序与转录组分析RNA测序技术可以获得全基因组水平的转录信息,从而了解基因的表达状态和调控机理。

RNA测序通常经过文库构建和深度测序等多个步骤。

4DNA序列分析

4DNA序列分析

Clustal输入多个序列
快速的序列两两比对,计算序列间的 距离,获得一个距离矩阵。
邻接法(NJ)构建一个树(引导树)
根据引导树,渐进比对多个序列。
第一步:输入序列文件
第二步:设定比对参数
参数设定窗口
0:碱基不匹配; 1:碱基完全匹配
第三步:开始序列比对
第四步:比对完成,选择保存结果文件的格式
Blastn---1
Blastn1的作用: ①对于已知的基因,可以分析其相似基因; ②对于未知的基因片段,可以分析其属于什么基因。
描述以表格的形式呈现(以匹配分值从大到小排序) Accession下程序比对的序列名称,点击相应的可以进入更为详细的map viewer Descriptions下是对所比对序列的简单描述 Max score匹配分值,点击可进入第四部分相应序列的blast的详细比对结果 Total score总体分值 Query coverage覆盖率 E value——E(Expect)值 Max ident——匹配一致性,即匹配上的碱基数占总序列长的百分数。 Links——到其他数据库的链接。
可直接查看所在ORF对应的 蛋白质的对数据库的比对
单击,详细查看一个ORF。进一步 确定ORF是否正确需要借助Kozak规 则。
Kozak规则
Kozak序列是存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的 起始中有重要作用。
Kozak序列 位于真核生物mRNA 5’端帽子(m7GPPPN)结构
Expect是输入序列被随机搜索出来的概率,该值越小越好。 Identities是相似程度,即输入序列和搜索到序列的匹配率 Gaps就是空白,即比对序列只有一条链上有碱基 strand=plus/minus即询问序列和数据库里面序列的互补链匹配

基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析

基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析

(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个
碱基,适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序; 从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列,相互 参照测定结果,可以得到准确的核苷酸序列;
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应,
起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结
尾的DNA片段群; 3. 分离:通过凝胶电泳分离片段群;
4. 推导:再经放射线自显影,确定各片段末端碱基, 从而得出目的DNA的碱基序列。
凝胶电泳分离,放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T T T T T G G G C T T A G C 3′
基因分析工具
NCBI:(美国国家生物技术信息中心)

EMBL:(欧洲生物信息学研究所)

Sanger中心:(基因组测序中心)

ExPASy:(瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统)
H
ddNTP
ddATP
ddCTP
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template):将待测DNA模板 与引物混合,通过加热时模板变性; 退火(annealing):将变性的模板与引物混合物 缓慢降温,使引物与模板结合; 标记(labeling):利用放射性同位素标记核苷酸 或引物; 延伸(extension)和终止(termination):反应体 系中新生核苷酸的合成和随机终止过程; 电泳分析和数据读取:聚丙烯酰胺凝胶电泳,放 射自显影,读取DNA的碱基排列顺序。

第四章核酸序列分析

第四章核酸序列分析
对核酸序列进行电子基因定位(即基因的染色体定 位),通过所定位区带的相邻基因簇,间接地提示该 基因的功能,是核酸序列分析的一个重要方面。进 行电子基因定位策略是:
利用基因组序列定位
A、将待分析序列进行对基因组数据库的同源性检索 B、得到确定基因组序列后点击“Genome View”观察
其基因组结构
C、点击用红色标记所指示的染色体列表中选择所对应 的染色体及区域。
500kb
500kb 500kb
1500kb 500kb
2、基本过程
(1)将待分析的核酸序列(称为种子序列)采用 Blast软件搜索GenBank的EST数据库,选择与种 子序列具有较高同源性的EST序列(一般要求在重 叠40个碱基范围内有95%以上有同源性)(称为匹 配序列)
(2)将匹配序列和种子序列装配产生新生序列,此 过程称为片段重叠群分析(conti(expressed sequence tag,EST)和 较长的cDNA序列。然而在大多数情况下,人们 只能获得EST序列或较长的cDNA序列。全长 cDNA序列的获得一直是制约新基因发现的瓶颈。
同时,很多实验室采用差异显示PCR(different display PCR,DD-PCR)、代表性差异分析 (representational difference analysis,RDA)等技
一些生物如大肠杆菌含有可移动的遗传物质如插入序 列。在进行克隆构建以便测序的过程中,这些序列有 时会插入到所构建的克隆,导致目的序列测序的干扰。 BlastN程序可以很方便地鉴定此类结果。如果是这样 的话,此类序列则值得怀疑。
二、核酸序列的电子延伸
1、简介 随着人类基因组计划的深入进行,很多实验室采
术发现了大量具有潜在应用价值的新基因片段,也 同时面临着全长cDNA序列难以获得的全长cDNA序列,均需要投 入较大的精力。

吴乃虎《基因工程原理》4-6知识点总结

吴乃虎《基因工程原理》4-6知识点总结

第4章基因操作的主要技术原理基因操作的方法包括:大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。

DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。

一、核酸的分离和纯化技术核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。

DNA:真核生物染色体DNA——双链线性;真核生物的细胞器DNA——双链环状;原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。

RNA:RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。

一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。

DNA提取的目的(1)可用PCR从基因组中扩增基因;(2)作RAPD分析,区别两种物种之间的亲缘关系;(3)作Southern分析,检测是否转入基因;探测同源的基因;(4)作酶切图谱,用于DNA测序。

(一)总DNA的提取DNA在低浓度盐溶液中,几乎不溶解,如在0。

14 mol/L的氯化钠溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L氯化钠中的溶解度很大,比纯水高2倍。

总DNA:一般来说是指基因组DNA ,即细胞核内的染色体DNA分子。

核DNA分子呈极不对称的线性结构,一条染色体为一个DNA分子。

其长度与直径的比例极不对称性,使其对极械力十分敏感。

分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。

尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。

(1)有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则:①防止和抑制内源DNase对DNA的降解;DNase 以Mg2+、Mn2+为辅助因子,只要加入一定的螯合剂,如EDTA(乙二胺四乙酸钠)、柠檬酸便可。

②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。

动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。

(2)DNA提取的主要操作过程(3)DNA提取的主要问题及解决方法:①DNA沉淀呈棕色,很难酶切或扩增;多酚、单宁、色素等氧化所致。

核酸序列特征分析

核酸序列特征分析

核酸序列特征分析核酸序列特征分析是生物信息学研究中重要的一个方面。

它可以帮助我们更深入地理解基因组及基因表达研究。

本文旨在介绍核酸序列特征分析,其中包括核酸序列分析、核酸序列特征抽取和质粒抽取等内容。

首先,介绍核酸序列分析,其中包括特征分类、序列特征检测、序列分类和序列比对等。

核酸特征分类是将核酸序列分为有用的和无用的,从而排除噪声。

核酸序列特征检测包括对不同类型的基因、基因组表达、基因功能和结构等特征的检测,以及比较不同物种序列或不同基因组结构的检测。

核酸序列分类是用特征抽取技术分析序列长度,以确定序列的分类及特征。

序列比对是比较两个或多个序列的相似性,以发现可能的相似性或共同特征。

其次,介绍核酸序列特征抽取。

它分为特征抽取和质粒抽取两大类。

特征抽取的主要目的是抽取出序列的非特定特征,比如k-mer特征,基于序列单位的反向字典学习(RLD)等方法。

质粒抽取的目的是抽取出序列以及其表达周围的特定特征,比如突变、位点突变、基因连接等。

特征抽取是对序列的概括,抽取出重要的特征,而质粒抽取是对序列表达的概括,可以捕捉到序列的精细结构信息。

最后,介绍核酸序列特征分析的一些应用。

一方面,核酸序列特征分析可以用于揭示基因组结构和功能特征。

例如,可以利用序列比对技术对不同物种序列进行对比,揭示出不同物种的关键基因。

另一方面,核酸序列特征分析也可以用于揭示表达调控机制。

例如,可以用特征分类和序列特征抽取技术,结合表达评价结果,探索基因表达调控的内在机制。

综上所述,核酸序列特征分析是生物信息学研究中重要的一个方面。

它可以用来探索基因组结构和功能特征,揭示表达调控机制,改进基因调控机制,为临床实验提供分析指导,并帮助我们更加深入地了解基因组研究和基因表达研究。

因此,核酸序列特征分析的研究将给生物信息学领域带来许多新的机会。

核酸和蛋白质序列分析

核酸和蛋白质序列分析

核酸和蛋白质序列分析‎在获得‎一个基因序列后,需要‎对其进行生物信息学分‎析,从中尽量发掘信息‎,从而指导进一步的实‎验研究。

通过染色体定‎位分析、内含子/外显‎子分析、ORF分析、‎表达谱分析等,能够阐‎明基因的基本信息。

通‎过启动子预测、CpG‎岛分析和转录因子分析‎等,识别调控区的顺式‎作用元件,可以为基因‎的调控研究提供基础。

‎通过蛋白质基本性质分‎析,疏水性分析,跨膜‎区预测,信号肽预测,‎亚细胞定位预测,抗原‎性位点预测,可以对基‎因编码蛋白的性质作出‎初步判断和预测。

尤其‎通过疏水性分析和跨膜‎区预测可以预测基因是‎否为膜蛋白,这对确定‎实验研究方向有重要的‎参考意义。

此外,通过‎相似性搜索、功能位点‎分析、结构分析、查询‎基因表达谱聚簇数据库‎、基因敲除数据库、基‎因组上下游邻居等,尽‎量挖掘网络数据库中的‎信息,可以对基因功能‎作出推论。

上述技术路‎线可为其它类似分子的‎生物信息学分析提供借‎鉴。

本路线图及推荐网‎址已建立超级链接,放‎在北京大学人类疾病基‎因研究中心网站(ht‎t p://gene.‎b .c‎n/science/‎b ioinfomat‎i cs.htm),‎可以直接点击进入检索‎网站。

下面介‎绍其中一些基本分析。

‎值得注意的是,在对序‎列进行分析时,首先应‎当明确序列的性质,是‎m RNA序列还是基因‎组序列?是计算机拼接‎得到还是经过PCR扩‎增测序得到?是原核生‎物还是真核生物?这些‎决定了分析方法的选择‎和分析结果的解释。

‎(一)核酸序列分析‎1、双序列比对(pa‎i rwise ali‎g nment)‎双序列比对是指比‎较两条序列的相似性和‎寻找相似碱基及氨基酸‎的对应位置,它是用计‎算机进行序列分析的强‎大工具,分为全局比对‎和局部比对两类,各以‎N eedleman-‎W unsch算法和S‎m ith-Water‎m an算法为代表。

由‎于这些算法都是启发式‎(heuristic‎)的算法,因此并没有‎最优值。

【生物课件】第四章 序列分析

【生物课件】第四章 序列分析

第二步:查找ORF并将目标序列翻译成蛋白质序列
利用相应工具,如ORF Finder、Gene feature(Baylor College of Medicine)、GenLang(University of Pennsylvania)等,查找ORF并将 DNA序列翻译成蛋白质序列
第三步:在数据库中进行序列搜索
可以利用BLAST进行ORF核苷酸序列和ORF翻译的蛋白质序列搜索
第四步:进行目标序列与搜索得到的相似序列的整体列线(global alignment)
虽然第三步已进行局部列线(local alignment)分析,但整体列线有助于 进一步加深目标序列的认识
第五步:查找基因家族
进行多序列列线(multiple sequence alignment)和获得列线区段的可视信息。 可分别在AMAS(Oxford University)和BOXSHADE(ISREC,Switzerland)等服 务器上进行
色体”、基因—“同源基因”和基因组的一个片断—“同源片断”
必须指出,相似性(similarity)和同源性(homology)是两 个完全不同的概念。
相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和
目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占 比例的高低。相似性本身的含义,并不要求与进化起源是
否同一,与亲缘关系的远近、甚至于结构与功能有什么联系。
【生物课件】第四章 序列分析
表1 九种完整DNA序列的碱基组成
表2 人类胎儿球蛋白基因不同区段的碱基组成
二.碱基相邻频率
分析DNA序列的主要困难之一是碱基相邻的频率 不是独立的。碱基相邻的频率一般不等于单个碱基 频率的乘积
例: 鸡血红蛋白β链的RNA编码区的438个碱基

核酸序列特征分析

核酸序列特征分析

核酸序列特征分析核酸序列特征分析是一个针对基因及其控制结构的重要研究课题,它可以帮助我们更好地理解遗传物质的结构和功能。

本文将介绍核酸序列特征分析的基本原理、步骤及分析方法,最后介绍可视化工具。

一、核酸序列特征分析的基本原理核酸序列特征分析是一种统计分析方法,用于全面分析核酸序列的某种特征,以发现和探索结构以及功能关系。

这种方法依赖于统计模型,以及不同特征度量标准,例如单碱基特征、二碱基特征、多碱基特征和序列分类等等。

可以选择不同特征的集合,用来发现序列的一些特殊结构,包括基因、调控序列、蛋白质结构和功能。

二、核酸序列特征分析的步骤核酸序列特征分析的步骤一般分为五个步骤:(1)获取输入数据,根据特征选择相应的特征计算库。

(2)利用统计模型以及参数,计算得出相应特征度量值,并将它们存储到计算机中。

(3)根据特征选择合适的建模方法,比如对数据进行聚类。

(4)根据模型参数,绘制特征分析图。

(5)根据图形结果做出结论,并给出相应的解释。

三、核酸特征分析中的分析方法1、基于核酸序列的单碱基特征分析:该方法的主要目的是分析单个碱基的分布,例如A/G,C/T,或者任意一对对立的碱基,通过比较单碱基出现次数的差异,来确定特定序列应该具有什么样的特征。

2、基于核酸序列的二碱基特征分析:该方法是针对两个或多个二碱基的比较,可以用来确定二碱基的组合的特征,以探究其中的影响因素。

3、基于核酸序列的多碱基特征分析:该方法是以一组碱基为单位进行分析,识别给定序列的多碱基特征,并评估它们之间的相关性。

4、基于核酸序列的序列分类:这是一种机器学习方法,通过特征选择,建立一个分类模型,然后将训练集中的序列分类为种类,利用这一模型,可以对未知序列进行预测。

四、可视化工具随着科技的发展,可视化工具也得到了极大的改进,它们可以帮助我们更好地理解核酸序列特征分析的结果。

例如Cytoscape,这是一个开源的网络可视化软件,可以帮助我们更直观地了解核酸序列中的二碱基关系;SeqView,这是一个基于web的序列可视化工具,提供了多种的可视化效果,例如3D结构、双向序列特征分析等;Circos,这是一个用于可视化大规模连接数据和关系的高效工具,可以帮助我们将序列特征分析结果可视化为动态图形。

核酸序列分析

核酸序列分析

Smith-Waterman算法
在序列比对中,通常希望使用能够反映一个氨基酸发生改 变的概率与两个氨基酸随机出现的概率的比值的矩阵。这些比 值可以用相关几率(relatedness odds)矩阵表示。这就是突 变数据相似性分数矩阵产生的基础,在序列比对过程中,两个 序列从头到尾逐个残基进行比对,所得几率值的乘积就是整个 比对的分值。 在实际使用时,通常取几率值的对数以简化运算。因此, 常用的突变数据矩阵PAM250实际上是几率值的对数矩阵(图 3)。矩阵中值大于0的元素所对应的两个残基之间发生突变 的可能性较大,值小于0的元素所对应的两个残基之间发生突 变的可能性较小。
Needleman-Wunsch算法 Needleman-Wunsch算法
当两个序列被联配时,通过计算其重排序列
(shuffed version) 的联配距离,可以得到这两个序列间 的最小距离估计。如果实际得到的联配距离小于重排序 列距离的95%,则表明实际的联配距离达到了5%的显 著水平,是不可能由机误造成的,即实际联配距离是正 确的。
Needleman-Wunsch算法
将两条联配的序列沿双向表的轴放置。从任一碱基
对,即表中的任一单元开始,联配可延三种可能的方式
延伸:如果碱基不匹配,则每一序列加上一个碱基,并 给其增加一个规定的距离权重;或在一个序列中增加一
个碱基而在另一序列中增加一个空位或反之亦然。引入
一个空位时也将增加一个规定的距离权重。
62%或以上相同的串用于产生BLOSUM62矩阵,依此类推。
BLOSUM与BLOCKS对于同样的 序列比对产生的结果 在局部有所不同,可能是一个认为不相似不可以替换而另一 个认为相似可以替换。必须说明,如果比对这两个序列高度 相似,这些细微的差别对整个序列比对结果的影响不大,但 在序列比对的边界区可能产生显著影响,此时增强微弱信号 以探测远距离相关变得十分重要。

核酸序列分析泛讲

核酸序列分析泛讲
RNA 5’
UUUUUUUUU C-G C-G G-C G-C U-A G-C G-C C-G G-C
3’
10
真核基因组中的重复序列
存在方式
长度 拷贝数
单一序列
重复序列 中度重复序列 大于300bp 高度重复序列 2~200bp 拷贝数106~108之间
出现一次或很少几 拷贝数102~106之间 次
预测工具:
GENSCAN,GENEMARK NetGene2, Splice View
14
(三)、CpG岛
CpG岛(CpG island)是短的、分散的、非甲基化核酸序列, 它常出现在持家基因和受调节表达的基因5’端,CpG岛定 义为长度超过200bp,p(CG)> 0.6×p(C)×p(G)值,且GC 含量大于50%的序列区域。 统计表明在人和鼠的基因中80%含有CpG岛。覆盖5’启动 子区域,并常向3端延伸约1000bp,进入基因翻译区。通过 CpG岛分析可帮助确定基因5’末端位置。分析序列中的 CpG岛可用WebGene 或CpGplot 。
基因结构分析 (1)原核基因结构
• 原核生物基因组小,基因密度高,很少存在重复序列, 一个基因是由编码一个蛋白质或RNA的开封阅读框构成, 中间没有间断。 • 细菌的起始密码子为: ATG, GTG, TTG • 核糖体结合位点(Shine-Delgaron sequence) • 终止密码子较容易确定 • 转录终止子 • 密码子偏好与转录因子 CTF 结 与转录因子 SP1 结 合 , 能 够 准 确 合,促进转录 结合,起增强 识别转录起始点 转录效率的作 用
原核和真核生物基因转录起始位点上游区 结构
原核生物
-35 -10 +1 mRNA

第四章 基因的鉴定与表达分析

第四章 基因的鉴定与表达分析

灵敏度,可以检测到一些稀有转录子。
CpG岛法
CpG岛(CpG island)是基因组DNA序列中富含C、G的 DNA区域。在大规模的DNA测序中,每发现一个CG岛,意 味着在此区域有一个基因。利用CpG岛稀有酶如SacⅡ、
BssHⅢ、EagⅠ、HpaⅡ、NotⅠ识别其位点,切割基因组
DNA。CpG岛又称HIF岛,即用HpaⅡ酶将CpG岛周围的DNA 切成许多小片段,这些序列称为HIF序列。 原理: 2) 载体上要有功能强大的真核基因启动子,以获得高 效表达; 3)还要有原核生物的复制子与生长选择标记(如Amp),
能在大肠杆菌中扩增,又要有真核生物的复制子、启动
子、加尾信号等以便在真核细胞中扩增及转录。
cDNA选择方法
基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题 是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题,
IEF)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分 离展开。
基因差异表达法
---二维电泳(two-dimensional electrophoresis)技术
步骤: 样品制备→等电聚焦→平衡转移→ SDS— PAGE→斑点染色→图像捕捉和图谱结构确定
随着人类基因组计划的完成,基因的鉴定与表 达分析已经成为功能基因组研究的一个重要内容。
基因的特异性特征:
整体上的高度进化保守;
表达RNA转录物----具有可读框(ORF);
脊椎动物-----CpG岛
一、基因的鉴定方法
常规方法
特异方法
(thern印迹杂交; 同源序列比对; 动物基因组印迹杂交;
• 主要步骤:
制备载体→将基因组片段亚克隆至表达载体中→

核酸序列分析总结

核酸序列分析总结

核酸序列分析1、核酸序列检索可通过NCBI使用Entrez系统进行检索,也可用EBI的SRS服务器进行检索。

在同时检索多条序列时,可通过罗逻辑关系式按照GenBank接受号进行批量检索。

如用“AF113671 [ac] OR AF113672 [ac]”可同时检索这两条序列。

其中“[ac]”是序列接受号的描述字段。

2、核酸序列的基本分析(1)分子质量、碱基组成、碱基分布分子质量、碱基组成、碱基分布可通过一些常用软件等直接获得。

如:BioEdit(/BioEdit/bioedit.html),DNAMAN()。

(2)序列变换进行序列分析时,经常需要对DNA序列进行各种变换,例如反向序列、互补序列、互补反向序列、显示DNA双链、转换为RNA序列等。

这些用DNAMAN软件可很容易实现,这些功能集中在Sequence→Display,从中可选择不同的序列变换方式对当前通道的序列进行转换。

(3)限制性酶切分析该方面最好的资源是限制酶数据库(Restriction Enzyme Database,REBASE)。

REBASE数据库(,/rebase)中含有限制酶的所有信息,包括甲基化酶、相应的微生物来源、识别序列位点、裂解位点、甲基化特异性、酶的商业来源及公开发表的和未发表的参考文献。

其它资源还有:WebGene:/~tjyin/WebGene/RE.html,/personal/tyin.htmlWebCutter2:http://www//firstmarkert/firstmarket/cutter/cut2.html同时,很多软件也能够识别REBASE限制酶数据库。

强烈推荐使用集成化的软件如BioEdit和DNAMAN等。

所得出的结果给出指定DNA序列的酶切位点信息,为克隆鉴定和亚克隆提供了重要信息。

在实际进行分子生物学实验中,有时需要对多条相关序列(如发生突变的一批序列)同时进行酶切分析,以便为后续的克隆鉴定提供参考。

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用DNASTAR (editseq)寻找ORF
背景:艰难梭菌(Clostridium difficile,CD) 是肠道感染中仅次于 弯曲杆菌的常见致病菌,我们根据Genth 的文章(New Method to generate enzymatically deficient clostridium difficile toxin B as an antigen for immunization).将CD标准株 VIP10463毒素B分成 3个氨基酸片段: CDB1(氨基酸 1-546,包 含接触反应区),CDB2(氨基酸 90-1750,含有假定的跨膜区), CDB3(氨基酸 1751- 2366,被认为是受体结合区),发现抗毒素 B抗体与毒素B羧基末端 (氨基酸 175-2366)可以发生强烈反应, 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白.故 我们选取了毒素B羧基末端CDB3(氨基酸1751- 2366)进行克隆与 表达,为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础. 任务 寻找VPI 10463 标准株毒素B的编码序列(X53138)。 利用DNASTAR 寻找毒素B基因的开放阅读框 寻找CDB3区(氨基酸 1751- 2366)的编码序列 采用实验室仅有的Pgex-4t-1质粒载体进行表达,请选择合适的限 制性内切酶设计引物
核酸序列的组分分析一般包括分子质量,碱基组成, 碱基分布等 实例分析:使用BioEdit分析水稻瘤矮病毒基因组S8片 段编码序列的基本性质.
1 载入序列 运行BioEdit,依次打开File-open,载入待分析的目的序列.
2 输出结果 依次点击sequence ---nucleic acid ---nucleotide composition
实例分析 使用DNASTAR 的EditSeq程序进行序列转换.
1 载入序列 运行DNASTAR,依次打开File—new—new DNA 载入待分析的目的序列.
2 寻找原序列的反向序列 和 反向互补序列 依次点击Edit—select all sequence
菜单Goodies----Reverse Reverse complement
BLAST 程序
程序名 Blastn Blastp 查询序列 核酸 蛋白质 数据库 核酸 蛋白质 搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序 列 蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中 的序列
Blastx
Tblastn
核酸
蛋白质
蛋白质
核酸
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋 白质数据库中的序列逐一搜索。
蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序 列6框翻译后的蛋白质序列逐一比 对。 核酸序列6框翻译成蛋白质序列,再和 核酸数据库中的核酸序列6框翻译 成的蛋白质序列逐一进行比对。
序列比对
• DNA : A T G C • Protein: ARNDCQEGHILK…… 例: • TTCGCAGCGC • TTAGGACCTC (偶然相似性)
量化相似性 比对
• 考虑这样的两条核苷酸序列: AATCTATA和AAGATA 仅有三种比对方式
不考虑空位的简单比对,它的打分函数是由对比奖励和罚分 的和来决定
空位
• 两条或多条序列比对时,如果考虑到插入与删除 时间发生的可能性,那么候选的比对数量就会大 大增加,也就导致了比对的复杂性。
等等……
序列C D
• 序列C: CTGC • 序列D: ACCTAGATCG
-- C--T---G----CACCTAGATCG • 序列的联配中引入的空位不能太多
序列比对数学模型
(三)原核与真核生物ORF区别
• 原核生物编码区只含有一个单独的ORF
• 真核生物编码区被内含子分隔成若干个不 连续的外显子,因此分析真核基因的编码 区时,需要正确识别内含子和外显子的边 界。
(四)Kozak规则(基于已知数据的统计结果)
• 即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的 统计规律,若将第一个ATG中的碱基A\T\G分 别标为1、2、3位,则Kozak规则描述如下: • (1)第4位的偏好碱基为G • (2)ATG的5’端约15bp范围内的侧翼序列 内不含碱基T。 • (3)第3、6、9位,G为偏好碱基 • (4)除第3、6、9位,C为偏好碱基
• 网络版本 • 包括NCBI在内的很多网站都提供了在线 的blast服务,这也是我们最经常用到的 blast服务。网络版本的blast服务就有方便, 容易操作,数据库同步更新等优点。但是 缺点是不利于操作大批量的数据。
BLAST
• BLAST 是一个序列相似性搜索的程序包, 其中包含了很多个独立的程序,这些程序 是根据查询的对象和数据库的不同来定义 的。 • 比如说查询的序列为核酸,查询数据库亦 为核酸序列数据库,那么就应该选择 BLASTn程序。
Bl2seq参数设置
比对结果
多序列比对
打开ClustalX
载入序列界面
比对参数设置
双序列比对参数设置
Aln文件可用Bioedit软件打开
dnd文件可用tree view软件打开
4.3 基因结构识别
• 4.3.1 ORF识别及其可靠性验证
(一)ORF( open reading frame ) ORF( open reading frame )是一个 潜在的蛋白质编码区,确定DNA序列的编码 区,就需要检测该序列中有多少个ORF, 并 验证所预测ORF的可靠性
检测序列、目标序列
• 检测序列(查询序列):新测定的,希望 通过数据库搜索确定其性质或功能的序列 • 目标序列: 通过数据库搜索得到的和检测 序列具有一定相似性的序列
序列比对基本类型
• 两两比对:蛋白质序列之间 核酸序列之间 • 多序列比对:多个蛋白质或核酸同时比较
常用的序列比对工具BLAST、Clustal X
TBlastx
核酸
核酸
6 框翻译
BLAST 数据库
BLAST算法
• BLAST采用局部比对算法,它的基本要点是序 列片段对(segment pair)的概念。所谓序列片 段对是指两个给定序列中的一对子序列,它们的 长度相等,且可以形成无空位的完全匹配。 BLAST算法首先找出代查序列和目标序列间所 有匹配程度超过一定阈值的序列片段对,然后对 具有一定长度的片段对根据给定的相似性阈值延 伸,得到一定长度的相似性片段,称高分值片段 对(high-scoring pairs, HSPs)。

BLAST搜索算法概述
比对质量: 用打分来评价,算法是打分矩阵,如果两条序 列在同一位置上的残基相同,则给+1.0分,不同 则给0分,或者按转换或颠换给分。 空位罚分一 般作负值处理。 比特分值表明序列的得分,数值越高两序列越相 似。
E值:在选定数据库中搜索目标序列的概率。 当E趋向于0时,说明比对结果越显著; 当E 趋向于1则表明结果很可能来自于其 他生物序列,而且是随机产生。
• 全局比对:在搜索结果中两个被比较序列 所有片断均参与比对,并贯穿整个序列的 长度。 • 局部比对:找出两个被比较序列的最类似 片断,即优先寻找这些局部区域而不是将 对位排列延伸到全序列。
• BLAST 和FASTA都采用局部相似性比对 的方法
4.2.1 BLAST比对 • BLAST 是 Basic Local Alignment Search Tool (基本局部比对搜索工具) 的英文缩写,是一种序列类似性检索工具。 • NCBI提供了网络版BLAST的搜索在线服务 和单机版
4.2 序列比对
为什么要序列比对
• 序列比对又叫序列联配 , 对排 核酸、氨基酸序列的相似性
• 推测结构功能及进化上的联系,是基因识 别,分子进化,生命起源研究的基础。 • 序列 结构 功能
• 序列比对理论基础:进化学说 如果两个序列之间具有足够的相似性, 就推测二者可能有共同的进化祖先,经过序列 内残基的替换、残基或序列片段的缺失、以及 序列重组等遗传变异过程分别演化而来。 序列比较的基本操作是比对, 两条序列中 各个字符的一种对应关系,或字符对比排列。
实例分析
运用在线BLAST进行目标序列的同源性搜索 1.打开BLAST主页
4.2.1 双序列比对 • BLAST2sequences (NCBI) • 实例分析 比较RGDV S8广西分离物与泰国 分离物序列之间是否相关?二者之间是否 存在(互补/重复/转座 现象)?
提交序列
(五)ORF分析工具(如ORF finder)
实例分析(page 94)
• 应用ORF Finder预测水稻瘤矮病毒(RGDV) S8片段的ORF. • 研究背景:为构建融合蛋白的表达载体, 需要对RGDV S8片段的基因序列进行ORF分 析并确定其位置,为设计表达引物提供信 息。
1、提交序列 2、参数设置
(二)验证依据 • 1、在ORF上发现不寻常的序列变异类型, 即每个第3碱基趋向于相同的概率远大于仅 仅由随机产生的概率。 • GCG软件包的TESTCODE程序可以提供序列中 每个第3碱基的非随机性标示。
• 2、通过分析确定ORF的密码子是否与那些 用于同一生物其他基因中的密码子一致
• 可以用GCG软件包的CODONFREQUENCY程序进 行分析 • 3、比对法,将所预测的ORF翻译成氨基酸 序列,然后将结果序列与现有数据库进行 BLASTP比对,如果发现1个或多个相似的序 列,则所预测ORF的可信度就比较高。
用DNAMAN对RGDV S8片段编码 区进行限制性酶切分析
搜索查询序列
选择CDS
从文件载入序列
复制粘贴载入序列
限制性酶切进行参数设置
酶选择
结果分析
在线限制性酶切分析工具(例如NEBcutter)
NEBcutter序列提交界面
分析结果
附加内容
• 用DNASTAR (editseq)将 DNA序列翻 译为蛋白质
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