各类光学显微镜课件

荧光的性质： 吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率



一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射 直接发出荧光。 二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处 理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。 荧光染料种类很多：
3.9工作距离 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面 到被检物体之间的距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔 径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。

点光源经过光学仪器的小圆孔后，由于衍射的 影响，所成的像不是一个点，而是一个明暗相 间的衍射图样，中央为爱里斑。
爱里斑 s1 * s2 *

透射式

落射式

汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜



现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间 呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸 发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大 气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间 放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很 强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普 遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工 作环境温度不宜太高。 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h， 开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿 命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中， 其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡 后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等 15min。 超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动 几个部分。在灯室上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安 装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。
2.3显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把 近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。 只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而 已。 物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于 物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它 经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像 A'B'。 A'B'靠近F2的位置上。再经目镜放大为 虚像A''B''后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜 一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不 是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大 了一次的像。
在日常生活中，室内飞扬的微粒灰 尘是不易被看见的，但在暗的房间 中若有一束光线从门缝斜射进来， 灰尘便粒粒可见了，这是光学上的 丁达尔现象。 暗视野显微镜就是利用此原理设计 的。
丁达尔现象


暗视野显微镜是在普通光学显微镜中去除明视野集光器， 换上一个暗视野集光器而成。 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器， 常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不 能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径， 倾斜地照射在观察的标本上。
光学显微镜分类、原理和应用
刘术亮
光学显微镜的发展
主 要 内 容
显微镜的光学原理 显微镜的几个基本概念
光学显微镜的分类、原理及应用
要知道的几个重要的分辨率
人眼：0.2mm/250mm 光学显微镜：0.2um 电子显微镜：0.2nm
1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的 情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨 相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两 个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们 看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨 本领。 人眼视锥细胞直径为4微米，对应的视角约为 30秒，这个角度就是视角的极限。一般要能清晰 的分辨两个点，视角须在1分以上。高1米的物体 距 眼 睛 3 4 0 0 米 时 ， 视 角 为 1 分 。
D：分辨率 λ :光波的波长 N:介质折射率 α :物镜镜口角
3.3 孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光 线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角称为孔径角。 3.4 数值孔径：令N· = nsin , 叫物镜的数值孔径。 A
数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越 短，NA越大，分辨率越高。数值孔径最大值为1.4， 这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前， 有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66, 所以NA值可大于1.4。
1.2 放大镜：约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制 放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有3—5x 1.3 显微镜： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显 微镜的放大仪器。 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜 式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的 古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，
荧光显微镜的优点和用途
优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
双重染色标本的单色和双色观察
WU WIB DUAL BAND
DAPI+FITC
WIBA
WIG
WIB
FIT 可见光频率范围：7.5×1014 - 3.9×1014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm – 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红
3.2 分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离， 用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。 D=0.61λ / nsin
其光学结构原理是 由一个共用的初级物镜，对物 体成像后的两个光束被两组中 间物镜亦称变焦镜分开，并组 成一定的角度称为体视角（一 般为12度--15度），再经各自 的目镜成像，它的倍率变化是 由改变中间镜组之间的距离而 获得， 利用双通道光路，双目镜筒中 的左右两光束不是平行，而是 具有一定的夹角，为左右两眼 提供一个具有立体感的图像。 它实质上是两个单镜筒显微镜 并列放置，两个镜筒的光轴构 成相当于人们用双目观察一个 物体时所形成的视角，以此形 成三维空间的立体视觉图像。
4、光学显微镜分类、原理及应用
4.1 光学显微镜分类：
1、普通眀场光学显微镜 2、暗视野显微镜 3、荧光显微镜 4、体式显微镜 5、倒置显微镜 6、金相显微镜 7、相差显微镜 8、偏光显微镜 9、微分干涉显微镜 10、激光共聚焦显微镜
应用：微小粒子、细菌 形态、细菌记数，透 明标本观察等。


暗场照明光路图 明场普通显微镜成像光路图

标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜 内，因而整个视野是黑暗的。

在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像,并非物 体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物 体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。

但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射 光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系 统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光 420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各 种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观 察。 这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认， 敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的 研究。
原位杂交技术


又被称为实体显微镜或解剖显微镜，是为了不同的 工作需求所设计的显微镜。 利用解剖显微镜观察时，进入两眼的光各来自一个 独立的路径，这两个路径只夹一个小小的角度，因 此在观察时，样品可以呈现立体的样貌。
其特点为： 视场直径大、焦深大这样便于观察被检测物体的全部层面； 虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长； 像是直立的，便于实际操作，这是由于在目镜下方的棱镜把象倒转过来 的缘故。

D


瑞利判据：当一个点光源的衍射图样的中央最亮 处刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹 相重合时，这两个点光源恰好能被分辨。
恰 能 分 辨
能 分 辨
不 能 分 辨
（1）增大物镜的数值孔径 在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径角 也增大。 （2）用短波长的光照射 如紫外光显微镜，电子显微镜。


1.解剖实验：当要解剖细微部分时，需要放大观察。 2.微小生物生态：如昆虫或其它小动物、植物的生 态观察。 3.花粉的形态及萌芽的过程，从而加深对花粉的认 识。 4.植物的组织和动物的组织观察。 5. 藻类、蕨类孢子体及配子体的形态与构造.

倒置显微镜的组成与普通 显微镜相同, 不同的是光源在载物台上, 物镜与照明系统在载物 台下,与其它显微镜的结构 位置相反,故称倒置显微镜.
3.8 视场数 目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。 显微镜的总放大率小的时候所能看到的标 本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本 的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率 成反比。 在同一总放大率的条件下视野也可有大小 差别。这种差别决定于目镜的某些性能。首先 目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场 光栏的直径叫目镜的视场数值．
罗伯特· 虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍
列文虎克和他的显微镜（约1680）
2.1折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直 线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发 生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不 同造成的。
2.2凸透镜的五种成象规律 (1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象 方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； (2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象 方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象； (3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以 外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； (4) 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能 成象； (5) 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也 无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置 形成放大的直立虚象。