抑制消减杂交的原理及应用
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胞死亡信号转导的研究
甘肃省肿瘤医院
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甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
driver准备:对于driver的ds cDNA只需经Rsa I或HacⅢ限制性内切酶
酶切成短片段，而不需添加接头。
消减杂交:分别向两个tester样品中加入过量的driver cDNA，于杂交缓
冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个tester样品混合， 再加入过量变性的driver cDNA继续杂交反应。获得作为PCR扩增模板 的差异表达序列。
巢式PCR示意图
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抑制消减杂交的原理
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
杂交双方为tester和driver ,tester含有要寻找的差异表达基因
合成ds cDNA:提取待比较的两组细胞的mRNA，利用3‘端引物将
mRNA反转录为cDNA，根据真核生物mRNA序列3'端具有poly A结构 的特点，合成3'端引物.反转录体系中要加入T4 DNA聚合酶以产生平头 cDNA 。
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抑制消减杂交的实验过程
※蓝白斑筛选原理：
大肠杆菌（ β-半乳糖苷酶缺陷型菌株）β-半 乳糖苷酶可分成2部分即α肽段和C-段。α肽 段的基因位于载体上并含有不影响其ORF （open reading ）的多克隆位点（MCS）， 而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。 二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与 载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无 色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖 苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛 蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而 使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互 补而不能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的 物质5-溴-4-靛蓝而产生白斑。选择转入的阳 性克隆即选择白斑。
甘肃省肿瘤医院
巢式PCR反应：巢式PCR是一种 变异的聚合酶链反应(PCR)，使 用两对（而非一对）PCR引物扩 增完整的片段。第一对PCR引物 扩增片段和普通PCR相似。第二 对引物称为巢式引物，结合在 第一次PCR产物内部，使得第二 次PCR扩增片段短于第一次扩增。 巢式PCR的好处在于，如果第一 次扩增产生了错误片断，则第 二次能在错误片段上进行引物 配对并扩增的概率极低。因此， 巢式PCR的扩增非常特异性
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
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抑制消减杂交的实验过程
消减文库的克隆:经巢式
PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
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抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别. 探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
2 Western blotting 3 northern blotting
4 dot blotting
斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后 与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。
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抑制消减杂交的实验过程
※斑点杂交：
将核酸点在能与核酸结合的膜（硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等）上， 经80℃烘烤或紫外光照等处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子 杂交，用放射自显影或非放射性显色检测。并做定性或半定量分析。
荧光素标记：用荧光素标记核酸；用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛 抗体。 地高辛标记：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。 酶促生物素标记：生物素与dUTP中尿嘧啶的C5相连，在聚合酶作用下掺 入DNA 生物素标记:将生物素链接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和 力的原理，分子杂交后用亲和素或链酶亲和素进行检测
斑点杂交点膜
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抑制消减杂交技术的优点
抑制消减杂交技术的优点
1
2
3
4
本技术对高、 低丰度的差异 表达基因都能 有效分离。主 要原因是该技 术利用了杂交 二级动力学原 理
简便易行及重 复性好：本技 术所采用的方 法简单、成熟、 易掌握，易操 作，且假阳性 率低
灵敏度高：用 抑制消减杂交 技术仅需要 1~2ug的 mRNA
快速：应用 这种方法一 般3~4天即 可获得差异 表达基因片 段的cDNA
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交技术的应用
肿瘤——大鼠高转移细胞株与低转移细胞株的比较
免疫学——T细饱杂交瘤比较获得一个新的TNF家族成员
TRANCE基因，编码产物能调节T细胞依赖免疫反应
应 用
器官发育——睾丸特异表达基因的研究 信号转导——NF-KB和IAP(凋亡抑制剂)参与TNF诱导细
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理： TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
核酸
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抑制消减杂交的实验过程
探针的种类
RNA探针 cDNA探针
探针种 类
合成寡核苷酸 探针
基因组探针
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抑制消减杂交杂交的实验过程
探针的标记方法
放射性同位素标记：常见的为32P,它能量高信号强。放射性同位素具辐射 危害和半衰期限制。 光敏生物素标记：标记简单，但是效率较低，对于短探针不宜使用。
1 southern blotting
将DNA电泳转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行 检测的方法。是基因分离和鉴定的重要手段，广泛用于遗传多态性分 析 利用类似Southern印迹法的方法对蛋白质进行印迹分析，蛋白质经 单向电泳分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的 特异抗体来检测相应抗原的存在。 mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记 的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子 在样品中存在与否及其长度大小
抑制消减杂交的原理及应用
尚立娜
主要内容
1
Hale Waihona Puke Baidu
抑制消减杂交的定义
2
抑制消减杂交的基本原理及实验过程
3
抑制消减杂交技术的优点
4
抑制消减杂交技术的应用
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抑制消减杂交的定义
人类基因组包括100000 个不同的基因，但对于每个 细胞而言一般只有15 000 种基因表达
基因的选择性表达决定 了生物体的各项生命活动 动
抑制消减杂交
要了解人体各项生命活动的 分子调控机制，就必须将这 些差异表达的基因分离、 鉴定作深入研究
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抑制消减杂交的原理
抑制性消减杂交技术的定义：
是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术. 其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的 cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于 测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达 的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他 消减杂交技术相比 假阳性率低、敏感性高、效率高等 优点而得到广泛应用.
大肠杆菌
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抑制消减杂交的实验过程
蓝白斑筛选示意图
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抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
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抑制消减杂交的原理
杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产 生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在 丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使 非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡 的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制 了非目的基因片段的扩增。
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抑制消减杂交的实验过程
2核酸分子杂交方法的分类
PCRSouthern 杂交
dot blotting
Western blotting
Southern blotting
Northern blotting
In Situ Hybridization
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抑制消减杂交的实验过程
杂交主要方法及应用
tester准备:产生平头ds cDNA后，用Rsa I或Hae Ⅲ限制性内切酶将ds
cDNA酶切成短片段，将tester cDNA分为两组，在T4连接酶的作用下 分别在cDNA的5‘端连上两个不同的寡聚核苷酸接头(接头1和接头2).接 头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利 于以后的选择性扩增。
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甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
driver准备:对于driver的ds cDNA只需经Rsa I或HacⅢ限制性内切酶
酶切成短片段，而不需添加接头。
消减杂交:分别向两个tester样品中加入过量的driver cDNA，于杂交缓
冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个tester样品混合， 再加入过量变性的driver cDNA继续杂交反应。获得作为PCR扩增模板 的差异表达序列。
巢式PCR示意图
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抑制消减杂交的原理
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
杂交双方为tester和driver ,tester含有要寻找的差异表达基因
合成ds cDNA:提取待比较的两组细胞的mRNA，利用3‘端引物将
mRNA反转录为cDNA，根据真核生物mRNA序列3'端具有poly A结构 的特点，合成3'端引物.反转录体系中要加入T4 DNA聚合酶以产生平头 cDNA 。
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抑制消减杂交的实验过程
※蓝白斑筛选原理：
大肠杆菌（ β-半乳糖苷酶缺陷型菌株）β-半 乳糖苷酶可分成2部分即α肽段和C-段。α肽 段的基因位于载体上并含有不影响其ORF （open reading ）的多克隆位点（MCS）， 而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。 二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与 载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无 色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖 苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛 蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而 使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互 补而不能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的 物质5-溴-4-靛蓝而产生白斑。选择转入的阳 性克隆即选择白斑。
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巢式PCR反应：巢式PCR是一种 变异的聚合酶链反应(PCR)，使 用两对（而非一对）PCR引物扩 增完整的片段。第一对PCR引物 扩增片段和普通PCR相似。第二 对引物称为巢式引物，结合在 第一次PCR产物内部，使得第二 次PCR扩增片段短于第一次扩增。 巢式PCR的好处在于，如果第一 次扩增产生了错误片断，则第 二次能在错误片段上进行引物 配对并扩增的概率极低。因此， 巢式PCR的扩增非常特异性
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
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抑制消减杂交的实验过程
消减文库的克隆:经巢式
PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
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抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别. 探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
2 Western blotting 3 northern blotting
4 dot blotting
斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后 与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。
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抑制消减杂交的实验过程
※斑点杂交：
将核酸点在能与核酸结合的膜（硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等）上， 经80℃烘烤或紫外光照等处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子 杂交，用放射自显影或非放射性显色检测。并做定性或半定量分析。
荧光素标记：用荧光素标记核酸；用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛 抗体。 地高辛标记：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。 酶促生物素标记：生物素与dUTP中尿嘧啶的C5相连，在聚合酶作用下掺 入DNA 生物素标记:将生物素链接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和 力的原理，分子杂交后用亲和素或链酶亲和素进行检测
斑点杂交点膜
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抑制消减杂交技术的优点
抑制消减杂交技术的优点
1
2
3
4
本技术对高、 低丰度的差异 表达基因都能 有效分离。主 要原因是该技 术利用了杂交 二级动力学原 理
简便易行及重 复性好：本技 术所采用的方 法简单、成熟、 易掌握，易操 作，且假阳性 率低
灵敏度高：用 抑制消减杂交 技术仅需要 1~2ug的 mRNA
快速：应用 这种方法一 般3~4天即 可获得差异 表达基因片 段的cDNA
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抑制消减杂交技术的应用
肿瘤——大鼠高转移细胞株与低转移细胞株的比较
免疫学——T细饱杂交瘤比较获得一个新的TNF家族成员
TRANCE基因，编码产物能调节T细胞依赖免疫反应
应 用
器官发育——睾丸特异表达基因的研究 信号转导——NF-KB和IAP(凋亡抑制剂)参与TNF诱导细
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理： TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
核酸
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抑制消减杂交的实验过程
探针的种类
RNA探针 cDNA探针
探针种 类
合成寡核苷酸 探针
基因组探针
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抑制消减杂交杂交的实验过程
探针的标记方法
放射性同位素标记：常见的为32P,它能量高信号强。放射性同位素具辐射 危害和半衰期限制。 光敏生物素标记：标记简单，但是效率较低，对于短探针不宜使用。
1 southern blotting
将DNA电泳转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行 检测的方法。是基因分离和鉴定的重要手段，广泛用于遗传多态性分 析 利用类似Southern印迹法的方法对蛋白质进行印迹分析，蛋白质经 单向电泳分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的 特异抗体来检测相应抗原的存在。 mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记 的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子 在样品中存在与否及其长度大小
抑制消减杂交的原理及应用
尚立娜
主要内容
1
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抑制消减杂交的定义
2
抑制消减杂交的基本原理及实验过程
3
抑制消减杂交技术的优点
4
抑制消减杂交技术的应用
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抑制消减杂交的定义
人类基因组包括100000 个不同的基因，但对于每个 细胞而言一般只有15 000 种基因表达
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抑制性消减杂交技术的定义：
是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术. 其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的 cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于 测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达 的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他 消减杂交技术相比 假阳性率低、敏感性高、效率高等 优点而得到广泛应用.
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抑制消减杂交的实验过程
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定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
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抑制消减杂交的原理
杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产 生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在 丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使 非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡 的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制 了非目的基因片段的扩增。
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抑制消减杂交的实验过程
2核酸分子杂交方法的分类
PCRSouthern 杂交
dot blotting
Western blotting
Southern blotting
Northern blotting
In Situ Hybridization
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抑制消减杂交的实验过程
杂交主要方法及应用
tester准备:产生平头ds cDNA后，用Rsa I或Hae Ⅲ限制性内切酶将ds
cDNA酶切成短片段，将tester cDNA分为两组，在T4连接酶的作用下 分别在cDNA的5‘端连上两个不同的寡聚核苷酸接头(接头1和接头2).接 头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利 于以后的选择性扩增。