酶联免疫方法的原理及详细操作步骤共57页

酶联免疫吸附法实验步骤

酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，其实验步骤大致如下：
1.准备所需的试剂和设备，如酶标板、酶标抗体、抗原、洗涤液等。

2.将抗原或抗体与酶标记物结合，形成酶标抗原或酶标抗体。

3.在酶标板中加入酶标抗原或酶标抗体，并使其与待测样本中的相应抗体或抗
原发生反应。

4.洗涤酶标板，去除未结合的酶标抗原或酶标抗体。

5.加入底物溶液，使酶催化底物生成有色产物。

6.洗涤酶标板，去除未结合的底物。

7.加入终止液，使反应停止。

8.在酶标仪中测量各孔的光密度值，根据标准曲线确定待测样本中的抗原或抗
体的浓度。

需要注意的是，具体的实验步骤可能会因不同的实验需求和试剂而有所差异。

在进行实验前，建议仔细阅读试剂说明书和实验指南，确保正确操作。

酶联免疫吸附法原理

酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物制药等领域。

它通过酶与抗原或抗体的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子，具有高灵敏度、高特异性和简便易行的特点。

下面将详细介绍酶联免疫吸附法的原理。

首先，酶联免疫吸附法的基本原理是利用酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体结合，再通过酶底物的作用来间接或直接检测样品中的特定蛋白质。

整个实验过程可以分为固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤。

固相吸附是酶联免疫吸附法的第一步，通常将待检测的抗原或抗体通过物理吸附或共价结合的方式固定在固相载体（如微孔板）上。

这样做的目的是为了使待检测的抗原或抗体能够与酶标记的抗体或抗原发生特异性结合。

特异性结合是酶联免疫吸附法的关键步骤，它是指将酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合。

在这一步骤中，酶标记的抗体或抗原将与待检测的抗原或抗体形成免疫复合物，而非特异性结合则会被洗涤去除。

非特异性结合是指除了特异性结合外，固相载体上还可能存在一些非特异性结合的情况。

为了减少非特异性结合的干扰，需要通过洗涤的方式将非特异性结合的物质去除，以保证后续的酶底物反应的准确性和特异性。

最后，酶底物反应是酶联免疫吸附法的最后一步，当酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合后，加入酶底物后，酶将催化底物的变化，产生可测量的信号。

通过测定信号的强度或颜色的变化，可以间接或直接检测样品中特定蛋白质的含量或存在情况。

总的来说，酶联免疫吸附法是一种基于酶与抗原或抗体的特异性结合来检测特定蛋白质的技术。

它通过固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤，实现对样品中特定蛋白质的高灵敏度、高特异性的检测。

在实际应用中，酶联免疫吸附法已经成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的重要技术手段。

酶联免疫的原理及应用

酶联免疫的原理及应用引言酶联免疫（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验室技术，广泛应用于医学诊断、生物制药和基础研究等领域。

它通过利用抗体和酶的结合，实现对特定分子的定量或定性检测。

本文将介绍酶联免疫的原理和应用，并阐述其在医学和科研中的重要性。

酶联免疫的原理酶联免疫的原理基于抗体与抗原的特异性结合以及酶的催化作用。

一般而言，酶联免疫包括两个主要步骤：抗原与抗体的结合和酶的检测。

下面将具体介绍这两个步骤。

抗原与抗体的结合酶联免疫的第一步是将待检测的抗原与特异性的抗体结合。

该抗体一般由动物免疫生成，并与待检测的抗原发生特异性结合作用。

这种结合可以通过多种手段实现，例如直接结合、间接结合和竞争性结合等。

结合后的抗原-抗体复合物将固定在试验物质表面，为下一步的酶检测提供基础。

酶的检测酶联免疫的第二步是利用酶的催化作用对固定在试验物质表面的抗原-抗体复合物进行检测。

常用的酶包括辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AP）等。

这些酶能够催化底物的反应，产生可检测的颜色或荧光信号。

具体而言，酶联免疫将待测物固定在微孔板上，并加入与待测物发生特异性结合的抗体。

然后，加入酶标记的第二抗体，该抗体能够与被检测物的抗体结合。

最后，加入适当的底物，使酶催化产生可测量的信号。

通过测量信号的强度，可以间接地推断待测物的浓度或存在与否。

酶联免疫的应用医学诊断酶联免疫在医学诊断中广泛应用。

它能够用于检测疾病标志物，如肿瘤标志物、免疫球蛋白和生化指标等。

临床医生可以通过酶联免疫的结果判断疾病的存在和严重程度，并据此进行诊断和治疗决策。

例如，酶联免疫已经被应用于乳腺癌、前列腺癌和艾滋病等疾病的诊断。

生物制药酶联免疫在生物制药中也有重要的应用。

它可以用于检测和定量生物药物，例如蛋白质药物和抗体药物等。

酶联免疫的原理

酶联免疫的原理
酶联免疫法是一种常用的免疫学研究方法，其基本原理是利用酶与抗原-抗体反应的结果产生的底物转化反应来检测目标物
质的含量。

首先，需要制备特异性的抗原或抗体。

通常，我们会将目标物质注射到动物体内，刺激产生特异性抗体。

然后，从动物体内获取抗体。

接下来，将待测物质或抗原固定在固相支持材料上，如酶标板。

然后，将样本加入到酶标板孔中，与固相支持材料上的抗原结合。

随后，加入特异性的酶标记的抗体（与样本中的抗原结合），形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。

这个酶标记抗体通常是与
酶分子共价结合的。

然后，洗涤掉未结合的物质，使只有与抗原结合的抗体-酶标
记抗体复合物留在孔中。

接着，加入底物，例如染色底物或荧光底物。

如果抗原存在并与酶标记的抗体形成复合物，酶会催化底物转化，产生染色或发出荧光。

最后，通过测量样品中底物转化的产物的颜色强度或荧光强度，可以确定原始样品中目标物质的含量。

酶联免疫法具有很高的灵敏度和特异性，可以检测非常低浓度的抗原或抗体。

因此，它被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。

酶联免疫操作方法

酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法是一种用于检测和定量分析特定蛋白质的技术方法。

以下是一般的酶联免疫操作方法的步骤：
1. 杂交：将待检的抗原或抗体固定在固相载体上，如微孔板或膜。

可以通过直接插入法或被动吸附法将抗原或抗体与载体结合。

2. 阻断：在固相载体上，加入一种非特异性蛋白质（如牛血清蛋白，BSA）或洗脱缓冲液来阻断未被固定的表面；这样可以减少非特异性结合。

3. 反应：加入待测样品，使其与固相上的抗原或抗体结合。

待测样品可能是抗原，也可能是抗体。

4. 洗涤：用洗涤缓冲液彻底洗涤固相载体，以去除未结合的物质，尤其是非特异性结合。

5. 标记：加入与待检测物质相匹配的标记物，如酶标签，荧光标记或放射性标记。

6. 反应：与酶标签或其他标记物相互作用，生成底物反应产物。

这种反应可用于颜色变化、荧光或放射性计数等信号读取。

7. 终止反应：加入终止试剂停止底物反应。

8. 测量：测量反应产物的信号强度，通过比较标准曲线或对照样品来定量待测物质的浓度。

以上是一般酶联免疫操作方法的步骤，不同的实验可以根据需要进行适当的调整。

酶联免疫法ELISA的原理

酶联免疫法ELISA的原理引言酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用于探测和定量分析生物样本中特定分子的方法。

该方法利用抗原-抗体的特异性识别作用和酶的催化反应，可以检测到低浓度的抗原或抗体。

ELISA技术广泛应用于医学、生物学、农业等领域，被用于疾病诊断、药物筛选、免疫学研究等。

ELISA的原理ELISA的原理基于抗原-抗体的特异性识别和酶催化的反应。

ELISA方法通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间隔ELISA等。

下面将对其中的直接ELISA 进行详细介绍。

直接ELISA直接ELISA是一种简单、直接的抗原-抗体反应检测方法。

其基本原理是将要检测的抗原固定在固相（如微孔板）上，然后加入与抗原特异性结合的抗体。

接下来，通过添加与抗体结合的酶标记抗体，使样本中的抗原成为可测定的目标。

最后，加入适当的底物，测定底物的酶活性，从而确定抗原的存在量。

步骤1.准备固相：将要检测的抗原固定在固相（如微孔板）上。

2.来样及对照：加入待测样品和对照样品到固相中，使其与固相上的抗原发生特异性结合。

3.清洗：将固相反复洗涤，去除非特异性结合的物质。

4.添加酶标记抗体：加入与抗体特异性结合的酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。

5.清洗：将固相反复洗涤，去除未结合的酶标记抗体。

6.酶反应：加入适当的底物，使酶标记抗体催化底物反应产生可测定的信号。

7.停止反应：加入适当的停止液，停止酶活性，防止底物继续反应。

8.信号检测：通过测定底物反应后的产物或底物代谢产生的染色物质的吸光度或荧光强度来测定抗原的存在量。

特点和应用直接ELISA主要适用于检测抗原或抗体含量较高的样品，如分泌型免疫球蛋白或细胞上的抗原。

其特点包括简单、快速、灵敏度高，能够定量检测目标物质的含量。

直接ELISA广泛应用于疾病的诊断、感染的检测、生物标志物的鉴定等。

酶联免疫的操作方法

酶联免疫的操作方法酶联免疫是一种常见的免疫测定方法，常用于检测抗原或抗体的存在和浓度。

其操作方法如下：1. 抗原包被：首先，将待检测样品中的抗原加入到含有特异性抗体的孔或固相载体表面，通过吸附或共价键结合的方式，将抗原固定在孔或固相载体上。

这样做是为了使抗原与特异性抗体充分结合，形成抗原-抗体复合物。

2. 洗涤：将包被好的板子或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物，减少误差的发生。

3. 反应：将与抗原-抗体复合物结合的二抗（或识别抗体）加入孔或固相载体中，与复合物发生特异性结合。

该二抗预先被连接上与酶（通常是辣根过氧化物酶HRP）结合的分子，因此称之为辣根过氧化物酶标记的二抗。

4. 洗涤：将孔或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物。

5. 底物添加：将染色底物加入孔或固相载体中，底物在酶的作用下，发生可见的颜色反应。

该底物通常是染色体底物或亚硝酸4-硫酸钠。

6. 反应停止：通过加入酸或碱，停止底物的反应，并阻止底物继续发色。

7. 反应评估：测量底物反应产生的颜色强度或发光强度，使用光度计或发光仪等设备进行测定。

酶联免疫方法优点如下：- 高灵敏度：酶标记可提供较强的信号，使检测到的目标物浓度可达到可靠的程度。

- 特异性：通过使用具有特异性的抗体或抗原，酶联免疫能够准确检测目标物。

- 简单易行：操作相对简单，无需复杂的实验条件和设备。

- 可量化：根据底物反应的强度，可以定量测定目标物的含量。

- 高通量：酶联免疫可同时处理多个样品，提高工作效率。

然而，酶联免疫也有一些局限性，例如：- 检测范围受限：传统的酶联免疫方法通常只能在较低至中等浓度范围内进行可靠的检测，对于高浓度的目标物可能不敏感。

- 受干扰物影响：某些样品中可能含有干扰物质，如脂质、乳糖、硫醇等，它们可能影响酶的活性或干扰底物的测定。

- 特异性限制：一些高度相似的抗原或抗体可能导致交叉反应，从而降低特异性。

总的来说，酶联免疫是一种常用的免疫测定方法，通过将抗原或抗体固定在固相载体上，并利用酶的催化反应使其产生可见的颜色或发光信号，从而实现对目标物的检测和定量。

酶联免疫吸附试验的原理、操作方法及注意事项

附于反应孔周围，不能完全清洗干净，使试验结果不准确。必须贴封片或加盖，按照说明严格控制操作温度和时间。孵育时反应板均不宜叠放，以保证各板温
影响实验结果。因此，ＥＩＡ试验实际操作中除了在ＬＳ选择优良仪器设备和试剂外，正确的操作是保证
ＥＩＬＳＡ检测结果准确可靠的必要条件。必须熟知试验
每次加样必须更换吸头，做到１样品１个吸个
振动３秒，Ｏ使底物与终止液充分混合再读数。
４７酶标仪读数环节．
使用前应先预热仪器１～０分钟，并调整到试５３
验要求的波长，使测定结果更稳定。最好先擦拭微孔板底部并压平板条，避免反应板底划痕、不平、印或液面高度差异造成干扰，指致使读数结果不准确。因此要保持酶标板干净，不能用手触摸板底留下指印。
４５洗涤反应板环节．
ＥＩＬＳＡ试验是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物。酶联免疫吸附板每次洗涤要充分。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异吸附于固相载体上的干扰物质。如果洗涤不充分，应该除去的杂质没有洗掉，这样就会影响试验结果。洗板时需保证微孔板平放，将洗涤液注满各孔，尽量避免漏液、溢液现象。
ＥＩＡ反应终止后需要在１ＬＳＯ分钟内读数，否则
头，以免发生交叉污染。每次加样应加在板孔的底
部，免加在孔壁上部，注意不可溅出，可产生避并不气泡，以免加样不准确，响试验结果。影

简述酶联免疫技术的基本原理

简述酶联免疫技术的基本原理
酶联免疫技术（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的实验方法。

其基本原理是利用酶的特异性催化反应作为检测方法。

酶联免疫技术通过将特异性抗体固定在微孔板上，封闭与抗原的结合位点，再加入被检样品，使得被检分子与抗体发生特异性结合，去除未结合的分子，再加入与抗体结合的酶标记二抗，允许其与样品充分反应形成复合物。

洗涤步骤将未结合的酶标记物清洗掉，加入底物，使得酶催化底物的色变反应。

色素依此减少，将被检分子的浓度与底物反应酶标记分子的浓度联系在一起，可用光谱仪测量读数从而量化被检分子的浓度。

总之，酶联免疫技术基于抗体与抗原的特异性结合，通过酶标记的二次抗体识别该特异性结合，并通过酶的催化产生着色反应来实现对被检测物质的定量检测。

酶联免疫吸附法实验步骤

酶联免疫吸附法实验步骤酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样品中特定的抗原或抗体。

以下是ELISA实验的基本步骤。

步骤1：制备试样首先，需要准备样品，可以是血清、细胞上清、尿液等。

样品可能含有目标抗原或抗体，也可能含有其他干扰物质。

样品的准备过程通常包括离心、稀释等步骤，以获得适合实验的样品。

步骤2：涂布固相材料ELISA试验通常使用微孔板（96孔板），每个孔都涂布有特定的抗原或抗体。

涂布的过程包括将抗原或抗体溶液加入每个孔中，并在适当的条件下孵育一段时间，使其吸附在固相材料上。

步骤3：阻断非特异性结合为了降低非特异性背景信号，需要在涂布后阻断孔中未被特异性结合的部分。

常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA），牛阴离子解脂磷酸酰胆碱（BSA-PIPC），非脂阻断剂（Nonfat blocking reagent）等。

阻断剂溶液通常加入每个孔，孵育一段时间，然后将其倒出。

步骤4：加入样品与控制品经过阻断后，样品和控制品被加入每个孔中，以检测其中的特定抗原或抗体。

每个孔可以添加不同浓度的样品和控制品，以建立浓度-效应曲线。

步骤5：孵育与洗涤样品和控制品孵育的时间和温度因实验设计而异。

在孵育过程中，抗原或抗体与样品中的目标分子发生特异性结合。

完成孵育后，需要进行洗涤以去除未结合的物质，减少背景干扰。

洗涤缓冲液通常用洗板机进行，该步骤重复数次。

步骤6：加入检测抗体经过洗涤后，需要加入与样品中目标分子特异结合的检测抗体。

检测抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶HRP）偶联，以便在后续步骤中进行信号放大。

加入的检测抗体需要与目标分子特异性结合，并在适当的条件下孵育。

步骤7：加入底物经过检测抗体孵育后，需要加入底物以触发酶催化反应。

底物的选择取决于所使用的酶和反应类型。

例如，在HRP酶联ELISA中，一种常用的底物为TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基胺）。

酶联免疫系统的原理

酶联免疫系统的原理
酶联免疫系统（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的检测方法，它利用酶的催化作用将目标物与特异性抗体结合反应产生的信号放大，从而实现对目标物的定量检测。

ELISA的原理可以分为间接ELISA、直接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等多种形式，以下为一般的ELISA原理的概况：
1. 固定：将特异性抗体固定在检测板上的孔内，获得免疫吸附层。

2. 捕获：样品中的目标物质（抗原）与免疫吸附层中的特异性抗体发生结合，使其固定在检测板上。

3. 洗涤：通过洗涤去除非特异性结合物。

4. 探针：加入标记物来检测目标物质的存在。

标记物可以是酶，如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）等。

5. 洗涤：去除未结合的标记物。

6. 底物：加入适当底物，在酶的催化下发生化学反应，产生可检测的信号，如发光、颜色变化等。

7. 测定：使用酶标仪或其他适当的设备测定信号的强度，根据标准曲线或对照样品的数值，计算出目标物质的浓度或活性。

总的来说，ELISA利用抗原与抗体的特异性结合，结合酶的催化作用，通过测定产生的化学反应信号的强度来定量检测目标物质。

这种方法具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围。

酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理

酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。

该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。

在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。

一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。

在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。

2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。

3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。

在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。

二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。

在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。

该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。

这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。

除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。

在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。

三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。

它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。

在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。

HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。

酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。

简述酶联免疫技术的基本原理

简述酶联免疫技术的基本原理酶联免疫技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和诊断的重要技术。

它通过酶的催化反应来标记和检测特定抗原或抗体，具有高灵敏度、高特异性和高重复性的特点。

其基本原理主要包括四个步骤：涂覆固相、特异性结合、信号产生和检测。

首先，涂覆固相是ELISA的第一步。

涂覆固相是将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板、磁珠等）上。

常用的固相载体为96孔微孔板，每个孔内都可以涂覆不同的固定抗原或抗体。

固定方式有物理吸附、共价键合等。

通过涂覆固相可以将待检测的抗原或抗体捕获并固定在孔底，为后续特异性结合提供基础。

第二步是特异性结合。

该步骤中，涂覆固相上固定的抗原或抗体与待检测样品中的抗原或抗体特异性结合。

此时，固相上的特异性抗原或抗体与待测样品中的目标分子形成特异性复合物。

这种特异性结合是ELISA技术的核心步骤，也是检测的关键。

特异性结合可以通过直接结合法、间接结合法、竞争结合法等方式进行。

第三步是信号产生。

在特异性结合之后，为了可视化或定量检测目标分子的浓度，需要引入能够产生可检测信号的物质。

常用的信号产生物质有酶类物质，如辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（AP）等。

这些酶可以与特异性结合的复合物反应，产生可观察到的信号。

通常使用酶标记的二抗或酶标记的探针进行信号产生。

例如，如果固相上固定的是抗体，则可以使用酶标记的与该抗体结合的二抗来引入酶，形成复合物并进行信号产生。

最后一步是检测，即对信号进行定量或可视化检测。

通常这一步骤是通过化学反应来实现的。

例如，在使用酶为信号产生物质的情况下，可以通过加入底物和底物转化物来产生有颜色的产物。

这个产物的颜色强度与样品中目标分子的浓度成正比。

通过比色反应或荧光反应等探测方法来对信号进行读取和分析。

常用的读取设备有酶标仪、荧光光度计等。

综上所述，ELISA技术的基本原理包括涂覆固相、特异性结合、信号产生和检测四个步骤。

酶联免疫法原理

酶联免疫法原理
酶联免疫法是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析目标蛋白质或抗原的存在和浓度。

其原理是利用特定抗体与目标蛋白质或抗原之间的特异性结合，再借助酶的催化作用，将目标物与酶的反应产物相关联，通过测量反应产物的信号强度来间接测定目标物的存在和浓度。

酶联免疫法的步骤通常包括以下几个主要步骤：
1. 预涂板：将具有特异性的抗体或抗原预先涂覆在微孔板的表面上，形成抗原或抗体捕获层；
2. 孵育：将待检测样品加入微孔板中，样品中的目标物与捕获层上的抗体或抗原结合，形成特异性复合物；
3. 洗涤：通过洗涤步骤，去除未结合的样品成分，减少背景干扰；
4. 二抗结合：加入与目标物结合的抗体标记物，这种抗体与目标物不同的抗体结合，形成“夹心”结构；
5. 再次洗涤：去除未结合的二抗成分，减少背景干扰；
6. 底物添加：加入底物，底物与酶结合，酶的催化作用使底物产生可测量的信号，例如颜色变化；
7. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物与酶的反应；
8. 信号检测：使用仪器测量底物的信号强度，常见的方法包括吸光度测定或荧光测定；
9. 数据分析：根据测得的信号强度，通过对照样品进行定量分析，计算目标物的浓度。

酶联免疫法通过将酶的催化作用与特异性抗体或抗原结合，能够高灵敏度地检测目标物，并且可同时处理多个样品，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛应用。

酶联免疫试验原理

酶联免疫试验原理酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验室技术，用于检测和测量蛋白质、抗体、肽或小分子化合物。

它是一种特异性高、敏感度好的定量或定性检测方法，具有应用广泛、结果准确可靠的优势。

酶联免疫试验的原理基于抗原与特异性抗体的特异性结合作用。

通常，免疫试验中常用的抗原是被测物，抗体则是与抗原特异结合的免疫球蛋白。

ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型，其原理略有差异。

一般而言，ELISA的关键步骤包括以下几部分：1.固相吸附：将抗原或抗体固定在实验室常用的微孔板上，如96孔板，通过物理吸附或化学偶联的方法，使其与微孔板上的表面结合。

2.试样处理：待测物质需要进行预处理，如适当的稀释、纯化或者反应梯度等。

这一步骤通常是为了提高试验的灵敏度和准确性。

3.特异性结合：将预处理好的试样加入孔中，与固相吸附的抗原结合，同时加入特异性结合的抗体，形成抗原-抗体复合物。

这个抗原-抗体复合物具有高度的特异性，可以仅与特定的抗原结合，并与其他非特异性物质的结合有所区别。

4.清洗：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反应后的洗涤步骤。

一般采用盐溶液、缓冲液或洗涤缓冲液进行洗涤，以去除没有结合的物质，保留住特异性抗原-抗体复合物。

5.信号产生：加入检测物质，以产生与特异性抗原-抗体复合物结合的信号。

一般常用的方法是将辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）结合在第二抗体上，使其与特异性抗原-抗体复合物结合。

这样，酶作用于底物时将可产生荧光、发光或颜色的变化。

6.信号测量：通过测量底物转化产物的光学性质，如吸光度或荧光强度，可以得到与原始抗原或抗体浓度相关的信号。

根据吸光度或荧光强度，可以使用分光光度计或光学显微镜等仪器设备进行检测。

总结来说，酶联免疫试验的原理是通过抗原与特异性抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物，通过特定的酶作用，产生可测量的信号，从而检测和测量所需的物质或分子。

酶联免疫方法的原理及详细操作步骤

不易吸附得非蛋白质抗原可用间接包被得抗原经固相抗体得亲和层析作用,包被在固相上得抗原纯度大大提高,因此含杂质较多得抗原也可采用捕获包被法。
亲和素生物素即用亲和素先包被载体,加入生物素化得DNA, 这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质得定量测定。脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。
3、4 洗涤液
在板式ELISA中,常用得稀释液为含0、05%吐温20 磷酸盐缓冲液。
ELISA得试剂准备B
3、2 结合物
即酶标记得抗体(或抗原)就是ELISA中关键得试剂 1 酶得催化活性 2抗体(或抗原)得免疫活性 3含有或少含有游离得抗体(或抗原) 4结合物尚要有良好得稳定性。
3、2、1 结合物用得抗原和抗体
3、 ELISA得试剂(A、B、C三部分)
ELISA中有三个必要得试剂:免疫吸附剂、结合物和酶得底物。 (1)已包被抗原或抗体得固相载体(免疫吸附剂); (2)酶标记得抗原或抗体(结合物); (3)酶得底物; (4)阴性对照品和阳性对照品,参考标准品; (5)结合物及标本得稀释液; (6)洗涤液; (7)酶反应终止液
TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后 ,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为 450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。
HRP对氢受体得专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇得过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。
可设计出各种不同类型得检测方法。