动物组织淋巴细胞分离液使用说明
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
猪脾脏淋巴细胞分离
加入Hank‘s液后，要混匀
为了彻底洗涤淋巴细胞的分离液 残留，一般需要重复洗涤一次。
计数
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合
• 先在低倍镜 下找到中方 格区域，再 在中倍镜下 进行细胞计 数。
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
文献分析。
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生ห้องสมุดไป่ตู้学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
四、实验操作
• 破碎 • 分离 • 洗涤 • 计数
机械破碎（细胞筛） 密度梯度离心 Hank’s液多次离心 细胞计数板
破碎并过筛
• 剪一小块脾脏（先用Hank‘s液清洗掉表面 的杂物），置于细胞筛（放在平皿上）中， 用针头不断搓烂组织块，同时用Hank’s液 （5mL）将细胞洗到平皿中。
转移组织液
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
提取淋巴细胞流程
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。
Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
试剂与器材
·外周血单个核细胞
·PBS 1×和PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mMEDTA
·胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）
(二)操作方法及注意事项
1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备:先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。
Percoll浓度(％)706050403020
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Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
撰写 金伯泉
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(一)原理
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２O),粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
大鼠骨髓淋巴细胞分离液使用方法
大鼠骨髓淋巴细胞分离液使用方法
大鼠骨髓淋巴细胞分离液的使用方法如下：
1. 悬浮细胞：将需要进行分离的细胞悬浮在分离液中。
2. 离心：将悬浮液在2000rpm的转速下离心5分钟，收集沉淀的细胞。
3. 清洗：使用清洗液清洗离心后的细胞沉淀，以去除杂质和多余的分离液。
4. 再次离心：将清洗后的细胞在相同条件下再次离心，以进一步纯化细胞。
5. 培养：将纯化后的细胞接种到培养基中进行培养，以进行后续的实验或研究。
需要注意的是，大鼠骨髓淋巴细胞分离液需要在无菌条件下操作，且启封后应置常温保存。
如果需要在4℃保存，应避免出现白色结晶，以免影响分离效果。
此外，该试剂盒易感染细菌，因此在使用过程中需要特别注意无菌操作。
以上是大鼠骨髓淋巴细胞分离液的使用方法，仅供参考，如需获取更多详细信息，建议查阅相关网站。
各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项：
各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项：各种动物或人淋巴细胞分离液操作说明和使用保存中的注意事项: 本品为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液。
主要成分是Ficoll 400与泛影酸葡甲胺。
适用于从血液及组织匀浆中(小牛血清或人血清悬起匀浆的细胞 1X107/ml)分离所需细胞，在医疗和医学生物中广泛应用。
其他人及动物多种比重细胞分离液。
注:因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，所以用户在定制分离液时应提供所需分离液的比重、动物的种属及被分离细胞的名称。
使用方法例:取新鲜抗凝血1ml，与全血及组织匀浆稀释液(LOT#:2010C1119)液1:1 混匀后，小心加于2ml的细胞分离液之液面上，以1500-2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。
第一层;为血浆或组织匀浆液层。
第二层;为环状乳白色淋巴细胞。
第三层;为透明分离液层。
第四层;为红细胞层，收集第二层细胞放入含细胞洗涤液 (LOT#:2010X1118)4-5毫升的试管中，充分混匀后，以1500-2000转/分离心10-30分钟。
沉淀经反复洗2次即得所需细胞。
(此方法效果较好，推荐使用)注意事项1. 启封后应置4?保存避免微生物的污染。
2. 细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用。
3. 整个分离过程中，温度应控制在18-28?且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量。
应用-从动物血液及组织中分离所需细胞特点-密度变化率依照Ficoll 400，泛影酸和氢氧化钠. -最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数 -在低粘度时高密度 -无菌-即用型-溶液产品规格溶液水PH 7.0-7.5渗透压 280-340mOsmol/kg 内毒素 <5EU/ml 无菌已检测保存期限 2年贮藏 +18?-+25?注意TBD实验室的细胞分离培养基是敏光型的。
免疫学实验方案设计——证明某产品具有免疫增强作用(从淋巴细胞数目及活性的角度考虑)
免疫细胞的计数
1. 直接计数 2. 检测细胞表面特征性标记分子 膜表面分子免疫荧光检测法 流式细胞分析法 免疫细胞化学法 抗体致敏细胞花环法 3. 检测细胞特定功能（微量细胞毒试验、细胞因子检测）
直接计数
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数并检测活性
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul台盼蓝液混合
单次密度梯度分离法 单一密度 连续密度梯度
血浆
PBMC 分离液 多形核白细胞 红细胞
取PBMC
玻璃平皿
单核细胞吸附； 未吸附的为淋巴细胞
淋巴细胞及其亚群的分离
✓尼 龙 毛 分 离 法 ✓E 花 环 沉 降 法 （ 课 本 内 容 ） ✓免 疫 吸 附 分 离 法 ✓磁 珠 分 离 法 ( I M B ) ✓流 式 细 胞 术 ( F C M ) ✓抗 原 肽 - M H C 分 子 四 聚 体 技 术
• 免疫细胞的种类：
淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞 单核/巨噬细胞、树突状细胞、中心粒细胞
• 免疫细胞的分布：
• 外周血 • 免疫器官： • 组织
胸腺、骨髓 脾脏、淋巴结 粘膜相关淋巴组织
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免疫细胞检测
免疫细胞数量与功能检测是判断机体免疫功能状态的重要指标
• 免疫细胞及亚群的分离、鉴定与计数 • 单核-吞噬细胞功能测定 • T淋巴细胞功能测定 • B淋巴细胞功能测定 • NK细胞功能测定 • 其他免疫细胞功能测定
取10ul于细胞计数板上 镜检
死细胞染成蓝色，活细胞不着色
Thank you!
磁珠分离法
• 在磁珠表面包被具免疫 反应性的抗体进行抗原 抗体反应，在细胞表面 形成玫瑰花结
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
巨噬细胞的分离、纯化与培养
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
细胞分离实验
视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞同学们好！组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。
研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。
研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。
实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。
脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。
研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。
实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。
实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝染色——镜检细胞活率具体操作步骤如下：1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。
2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小鼠，消毒3~5min。
3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。
免疫细胞使用说明书
免疫细胞使用说明书（V1.0）【适用范围】该产品说明书适用于人和动物PBMC、SMC、CBMC、BMMNCs等单个核细胞和人、小鼠CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、单核、NK细胞等亚型免疫细胞的复苏、保存、使用等过程。
【产品描述】单个核细胞是白细胞中只有一个细胞核的细胞，相对密度在1.076~1.090。
根据其组织来源不同，又可分为外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）、脐带血单个核细胞（Cord Blood Mononuclear Cell，CBMC)、脾脏单个核细胞（Spleen Mononuclear Cell）、骨髓单个核细胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs）等。
IPHASE单个核细胞均是由新鲜的组织或器官，利用细胞比重的差异，通过密度梯度离心的方法获得。
免疫细胞（Immune cell），由多种不同类型的细胞组成，包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等。
免疫细胞作为免疫系统的重要成员，具有吞噬异物并产生抗体、机体伤病的损伤治愈、抗御病原体入侵等能力，在执行免疫应答和免疫功能方面担负重任。
IPHASE免疫亚型细胞均是通过免疫磁性细胞阴选分选的方法，从新鲜制备的单个核细胞悬液中分选而来。
【包装规格】5×106cells/管1×107cells/管2×107cells/管5×107cells/管【应用方向】可作为大分子药物临床前药代动力学和药效学研究、药物毒性筛选、免疫学研究、疫苗开发以及移植免疫等多个领域研究的原材料。
【合规保障】合规是研究的开始。
按照国家要求，凡涉及到人和猴相关的细胞产品均需办理合规审批流程，只有审批通过，且取得证明文件后才可买卖细胞。
IPHASE/汇智和源分离免疫细胞的组织或器官均由合规渠道获得，来源清晰，免除客户后顾之忧。
treg淋巴细胞检测报告解读
1、Treg细胞概述高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反应大大降低，移植物的存活时间明显延长；器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途径。
但是免疫抑制剂具有明显的毒副作用(如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等)及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题，均限制了免疫抑制剂的长期应用。
因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免疫耐受途径来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。
在上个世纪九十年代中期，由Sakaguchi等首先证实了天然CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)为一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%～5%，约占外周CD4+T细胞的5～10%。
该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答／免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。
2、Treg细胞的来源研究证实，天然的CD4+CD25+Treg细胞来源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+CD25+Treg细胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。
而在第0天和第7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。
这说明出生3d内是胸腺产生CD4+CD25+Treg细胞的关键时期，这时切除胸腺引起自身反应性CD4+T细胞的过度增殖。
但是，出生第0天胸腺产生的自身反应性CD4+T细胞不足，出生第7天胸腺已经产生了足够的CD4+CD25+Treg细胞，所以这时切除胸腺，小鼠不出现自身免疫性疾病。
Papiernik等证实，CD4+CD25+Treg细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25+胸腺细胞与外周的CD4+CD25+Treg细胞一样，表现对经②FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族，通常和细胞生长发育的调控有关。
细胞分离与培养技术
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细胞分离技术
二、从原代组织中分离细胞 组织和器官采集：
人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。 大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹
过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
优缺点：
流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标 记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就 可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞， 流式分选成本比磁珠低。
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细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞
黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞
因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于 尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱）， 所以可将其与T淋巴细胞分离。
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具体步骤：
单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3） ×107/ml的细胞悬液。
先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼 龙纤维柱，冲洗液尽量流净。
3.中性蛋白酶(Dispase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡 盐溶液清洗组织碎片几次
加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
在37℃孵育20分钟到几个小时。
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细胞分离技术
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎 片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase
巨噬细胞分离方法[汇总]
![巨噬细胞分离方法[汇总]](https://img.taocdn.com/s3/m/6ebbd0e54793daef5ef7ba0d4a7302768e996f76.png)
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
实验一外周血淋巴细胞的分离
Enzyme-linked immunoabsobant assays
融合剂
• PEG： • 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质
双分子层不稳定，引起细胞融合。 • 分子量：1500-2000
HAT选择性培养
HAT: 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶（thymidine, T）
细胞的DNA生物合成有两条途径：
• 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 • 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。
实验四
B淋巴细胞杂交
杂交瘤的目的 --- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。 利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能 长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养 获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. （Hybridoma）
• 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从 脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合 成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能 在HAT选择培养液中生存下来。
实验步骤：免疫脾细胞的制备
处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的 平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬 液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤 细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 •骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10 •一个脾脏可获约108个细胞
T淋巴细胞提取
1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。
3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）
ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
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动物组织淋巴细胞分离液使用说明
规格：4×200mL/kit
保存：18-25℃保存，有效期2年。
动物组织淋巴细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。
无菌条件下操作，启封后置于常温保存。
如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
试剂盒内容：
样本稀释液200mL
清洗液200mL
动物组织淋巴细胞分离液200mL
F液200mL
操作步骤：
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
1.首先制备组织单细胞悬液。
2.取一支15ml离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。
3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min。
（注：根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。
第一层为稀释液层。
第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层。
5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入
10ml清洗液，混匀细胞。
6.250g，离心10min。
7.弃上清。
8.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。
9.250g，离心10min。
10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
注意事项：
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。
为获得最佳的实验结果，最好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。
样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。