基因工程菌培养 ppt课件
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最新【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养幻灯片课件
【微生物工程】第八章_基 因工程菌的培养
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
格式塔心理学
目录
❖ 第一部分：前言 ❖ 第二部分：格式塔心理学产生背景 ❖ 第三部分：格式塔心理学的主要代表人物 ❖ 第四部分：格式塔学派的研究成果 ❖ 第无部分：对格式塔心理学的评价
一、前言
❖ “格式塔”（Gestalt）一词具有两种涵义。一种涵义是 指形状或形式，亦即物体的性质，例如，用“有角的”或 “对称的”这样一些术语来表示物体的一般性质，以示三 角形（在几何图形中）或时间序列（在曲调中）的一些特 性。在这个意义上说，格式塔意即“形式”。另一种涵义 是指一个具体的实体和它具有一种特殊形状或形式的特征， 例如，“有角的”或“对称的”是指具体的三角形或曲调， 而非第一种涵义那样意指三角形或时间序列的概念，它涉 及物体本身，而不是物体的特殊形式，形式只是物体的属 性之一。
❖ 正式诞生：1912年惠特海默发表《于运动知觉的实验研 究》。
❖ 主要观点：强调经验和行为的整体性，认为整体不等于且 大于部分之和，主张从整体的动力结构观来研究心理现象。
二、格式塔心理学产生背景
1 整体观的思想传统
2
社会历史背景
3
哲学理论背景
4
心理学背景
5
科学背景
三、格式塔心理学的主要代表人物
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
格式塔心理学
目录
❖ 第一部分：前言 ❖ 第二部分：格式塔心理学产生背景 ❖ 第三部分：格式塔心理学的主要代表人物 ❖ 第四部分：格式塔学派的研究成果 ❖ 第无部分：对格式塔心理学的评价
一、前言
❖ “格式塔”（Gestalt）一词具有两种涵义。一种涵义是 指形状或形式，亦即物体的性质，例如，用“有角的”或 “对称的”这样一些术语来表示物体的一般性质，以示三 角形（在几何图形中）或时间序列（在曲调中）的一些特 性。在这个意义上说，格式塔意即“形式”。另一种涵义 是指一个具体的实体和它具有一种特殊形状或形式的特征， 例如，“有角的”或“对称的”是指具体的三角形或曲调， 而非第一种涵义那样意指三角形或时间序列的概念，它涉 及物体本身，而不是物体的特殊形式，形式只是物体的属 性之一。
❖ 正式诞生：1912年惠特海默发表《于运动知觉的实验研 究》。
❖ 主要观点：强调经验和行为的整体性，认为整体不等于且 大于部分之和，主张从整体的动力结构观来研究心理现象。
二、格式塔心理学产生背景
1 整体观的思想传统
2
社会历史背景
3
哲学理论背景
4
心理学背景
5
科学背景
三、格式塔心理学的主要代表人物
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
《生物工艺学》基因工程菌的发酵 ppt课件
（3）使质粒稳定的措施
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3，表达效率及质粒拷贝数控制
• 在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上， 应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。
• 在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达 到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝 数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加， 目的基因产量提高。
四、工程菌的应用
ppt课件
6
2，其它发酵产品 • 酶制剂 • 氨基酸（苏氨酸、色氨酸） • 抗生素
ppt课件
7
第二节 工程菌的培养
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存 过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。
ppt课件
4
三、工程菌应具备的条件
• 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 • 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 • 菌株不是致病株，也不产内毒素。 • 代谢控制容易进行。 • 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。
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5
1，基因药物 • 红细胞生成素 • 胰岛素 • 干扰素 • 乙肝疫苗 • 生长激素 • 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
• 这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定， 采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。
ppt课件
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• 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。 实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项 组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。
基因工程-PPT课件
干扰素 1200 升人血 2－3 万美元 / 病人
1 升发酵液 200－300 美元 / 病人
国外生物医药的发展
➢1976年第一家基因工程技术开发药物的公司建立。 ➢1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素正式生产，推向市场。 ➢2019年全球生物技术公司总数已达4284家，美国占34％。 ➢2019年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元。 ➢2019年市场上的生物技术药物达到200种左右，而在研的药物为600种。 ➢全世界已有2.5亿人使用生物技术药物和疫苗。
• 曼哈顿计划 • 阿波罗计划
20世纪科学史上3个里程碑
HGP的意义
• 了解生命的起源与进化 – 认识种属之间和个体之间存在差异的起因 – 五种“模式生物” 基因组的研究：大肠杆菌、酵母、 线虫、果蝇和小鼠
• 解码生命，认识自身 – 了解生命体生长发育的规律
• 认识疾病产生的机制，掌握生老病死规律 – 疾病的诊断和治疗
甜椒在栽培的过 程中，容易受病毒的 感染。我国科学工作 者，采用转基因技术， 培育出抗病毒的甜椒。
油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜 籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育 出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且 油的纯度质量更好。
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以 用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称 它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好， 产量更高。
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状
遗传缺陷病人
腺病毒 adenovirus
修正基因
插入修正基因
感染病人細胞
取出病人細胞
修正基因转入到患者体内
注射修正基因
生化工程-基因工程菌培养
生物制药的挑战
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
基因工程菌培养培训课件
1/14/2021
基因工程菌培养
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3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
1/14/2021
基因工程菌培养
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1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出
现分离丢失。
为什么会出现质粒丢失呢？
质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细ห้องสมุดไป่ตู้）和
低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷
贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代
细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少
遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
1/14/2021
基因工程菌培养
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三、利用基因工程菌生产的特点
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。
1/14/2021
基因工程菌培养
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3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物
现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等
重组工程菌的培养
二、基因工程菌的培养工艺
5. 诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。
二、基因工程菌的培养工艺
6. 诱导表达程序的影响
二、基因工程菌的培养工艺
7. pH的影响
如采用两段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳 生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。
细胞生长期的最佳pH为6.8～7.4， 外源蛋白表达的最佳pH为6.0～6.5。
一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
二、基因工程菌的培养工艺
第八节 基因工程菌的培养
本节讲解的三个重点内容 1. 基因工程菌的培养方式 2. 基因工程菌的培养工艺 3. 基因工程菌的培养设备
一、基因工程菌的培养方式
1. 分批培养
分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体 密度也有限。
一、基因工程菌的培养方式
2. 补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时 间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
二、基因工程菌的培养工艺
3. 温度的影响
温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成 水平上。
二、基因工程菌的培养工艺
4. 溶解氧的影响
溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产 物的生成影响很大。
维持较高水平的DO2 值（>40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋 白产物的形成。
基因工程菌培养
-
培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
-
诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
稳定
-
选择合适拷贝数的菌株 在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
-
控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表
达程度 控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定
件较用合成培养基为高 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的
毒
-
pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
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诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
稳定
-
选择合适拷贝数的菌株 在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
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控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表
达程度 控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定
件较用合成培养基为高 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的
毒
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pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养ppt课件
细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物
基因工程菌培育方式
补料分批培育 补料分批培育是将种子接入发酵反响器中进展培育，经过一段时间，
间歇或延续地补加新颖培育基，使菌体进一步生长的培育方法。 在分批培育中，为坚持基因工程菌生长所需的良好微环境，延伸其生
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调理补料的流加速率。
基因工程菌培育方式
延续培育 延续培育是将种子接入发酵反响器中，搅拌培育至菌体浓度到达一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进展不延续培育。 延续培育可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
讨基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境要素对基因表达的影响等 发明了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，延续培育比较困难。为理处理这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进展两阶段延续培育。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导程度、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培育时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达程度或最大产率。
提高基因工程菌稳定性的战略
施加选择压力
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
生素
根据载体上的抗药性标志，向培育系统中添加相应的抗
药物和食品消费时制止运用抗生素
参与大量的抗生素会使消费本钱添加
添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的战略 分阶段控制培育 因外源基因表达呵斥质粒不稳定时，可以思索将发酵过程
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产活力制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降
基因工程菌培育方式
补料分批培育 补料分批培育是将种子接入发酵反响器中进展培育，经过一段时间，
间歇或延续地补加新颖培育基，使菌体进一步生长的培育方法。 在分批培育中，为坚持基因工程菌生长所需的良好微环境，延伸其生
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调理补料的流加速率。
基因工程菌培育方式
延续培育 延续培育是将种子接入发酵反响器中，搅拌培育至菌体浓度到达一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进展不延续培育。 延续培育可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
讨基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境要素对基因表达的影响等 发明了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，延续培育比较困难。为理处理这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进展两阶段延续培育。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导程度、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培育时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达程度或最大产率。
提高基因工程菌稳定性的战略
施加选择压力
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
生素
根据载体上的抗药性标志，向培育系统中添加相应的抗
药物和食品消费时制止运用抗生素
参与大量的抗生素会使消费本钱添加
添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的战略 分阶段控制培育 因外源基因表达呵斥质粒不稳定时，可以思索将发酵过程
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产活力制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降
基因工程菌培养
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜， 并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产 非常有吸引力。 主要问题: •枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。 •枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所 以在使用上有较大的限制，
3、低等真核细胞
大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的 宿主。
优点：
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任 何生物深。有利于进行复杂的基因操作；
大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度 （50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境 中以离子化（CH3COO－）和质子化（CH3COOH）两种形式 存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过线粒体膜进入 胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H＋，这样就降 低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减弱了质子的推动 力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生 理活性。
• 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才 有活性。
• 治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本 并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。
二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希望翻译后 的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中， 列入的认为是安全的菌。
四、生长与表达的影响因素
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
《基因工程菌发酵》PPT课件
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分批培养中选择不同的碳源，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸 的产生，减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生。
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大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提 高产量。
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它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的 RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少。
也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应。
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第七节基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件,如温度、pH、培养基各种组分、 碳氧比，分析表达产物的合成、积累 对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。
高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，从而产生“严紧反应”有 关。
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“严紧反应”是当氨酰tRNA不 足时,核糖体在密码子上停留,并合 成被称为魔点的ppGpp的结果。
ppGpp是一个重要的调控分子。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录。
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
整理ppt
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发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
细菌基因工程ppt课件
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⒉芽孢杆菌表达系统
枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌、无 荚膜、能运动的杆状细菌，无致病性，对 人畜无害。
具有良好的分泌能力，遗传背景清楚， 生长迅速，培养条件简便。
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下面介绍两种应用于枯草芽孢杆菌 的载体
⑴穿梭载体 作为穿梭载体（shuttle vector） 应同时具有大肠杆菌载体和枯草芽孢杆菌载 体的复制起点例如pDG148-Stu。（图16-2） 其结构特点为：
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⒋翻译的有效终止
在基因工程中，一般都采用UAA或一 连串的终止密码来有效终止原核细胞的翻 译。
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三、外源基因表达的方式
⒈外源基因以融合蛋白形式表达 融合表达是指目的基因与编码具有特殊活性
的多肽和蛋白质的基因融合，构建成一融合蛋白 基因。 ⒉构建可分泌蛋白，分泌到胞外培养基中
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大肠杆菌是目前研究最深入，使用最广的 基因工程宿主菌。在基因工程领域里，大 肠杆菌主要做为外源蛋白超量表达的平台， 其主要目的是对不同的蛋白质进行体外超 量表达从而可以将目的蛋白用于不同的下 游领域，如制备基因工程疫苗，蛋白质组 学研究。
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二、表达载体构建原则
表达载体实际上是在克隆载体的基础上装载 了用于表达的一些元件（cassette），当外源基 因插入到合适位点后，在宿主菌种就可以启动表 达。
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未来市场前景广阔的药品将集中在单克隆 抗体、反义药物、基因治疗药物、可溶性 蛋白质类药物和疫苗5类中，其中单抗最引 人注目。
基因工程菌苗优秀PPT
②荚膜细菌纯化的多糖菌苗，可诱导产生的抗 体能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血 性流感杆菌b(Hib)、伤寒杆菌Vi多糖等多糖苗 ，能诱导机体产生T细胞非依赖的抗体反应，其 特点是诱导产生短期的IgM抗体，缺乏免疫记 忆，对不到18个月幼儿的多糖苗免疫原性差， 而没有保护效果。因此多糖类的菌苗急需改进 。
。
➢据菌体抗原霍乱弧菌可分为200个以上的血清型 ❖目前流行的霍乱为O1和O139两种血清型。 ❖目前使用的霍乱疫苗是灭活全菌体或全菌与其毒 素的结合物，对成人有效，但不能诱发儿童免疫反 应。
霍乱菌苗有四类：
1.BS/WC灭活菌苗 由提取的或重组的霍乱毒素B亚单位（BS）及杀死的全菌
细胞（WC）组成。 2.CVD103-HgR减毒活菌苗
菌苗
类型
5
百日咳菌苗
类毒素 灭活菌苗
6
脑膜炎球菌苗（A、C 群）
多糖成分
7
脑膜炎球菌苗 （A/C/Y/W-35群）
多糖成分
8
流脑A群多糖-破伤风 蛋白结合菌 苗
多糖-蛋白结 合苗
伤寒菌苗（Ty21a） 活菌苗
9 伤寒菌苗（Ty21a） 灭活全菌苗
伤寒Vi多糖苗
多糖成分
1 0
精制破伤风菌苗
类毒素
1 1
第三节 重要细菌基因工程苗的研究进展P193
❖ 现有传统菌苗对重要细菌感染性疾病存在的问题： ①现有菌苗保护效果不好； ②副反应大； ③难以培养的细菌； ④可诱发癌变，有严重后遗症； ⑤新出现的病原体或新变异病原菌。
一、霍乱菌苗 P193
❖霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病。
➢临床表现轻重不一，轻者仅有轻度腹泻；重者剧烈吐泻大量 米泔水样排泄物，并引起严重脱水、肌肉痉挛，酸硷失衡、周 围循环衰竭及急性肾功能衰竭。
第十六章细菌基因工程ppt课件
• “超级工程菌”是第一个获得美国专利的 生物工程菌株
2019 8
3、细菌工程菌与食品、饲料及其他工业
• 食品生产：利用生物技术构建的品质优良 的食用乳酸杆菌能提高生产菌在食品发酵 过程中的稳定性，改善发酵食品的质量并 且降低了成本，大大缩短生产周期。
• 相关产品：酶制剂、氨基酸、维生素、增 稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食 用色素、食用香精及调味料等
大肠杆菌外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体， 含有大肠杆菌克隆载体的序列，便于在大肠杆菌中扩增和 制备。 例如，用于苏云金芽胞杆菌的克隆载体pHT304的基础 骨架为大肠杆菌克隆载体pUC18, 另装有能在Bt中复制的 质粒复制区序列ori1030和用于选择的红霉素抗性基因。
2019
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12
1. 启动子的选择
2019 2
细菌基因工程的发展简史
• 1973年，波依尔(Boyer)和科恩(Cohen)首 次完成外源基因在大肠杆菌中的表达 • 1982年，第一个基因工程产品──利用构建 的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从 此人类进入了生物技术的产业时代。
2019
-
3
细菌基因工程的发展现状
1、细菌工程菌与人类药物生产 • 1982年美国首先将重组胰岛素投放市场， 标志着世界第一个基因工程药物的诞生。
• 特征：同时具有大肠杆菌载体和枯草芽胞杆菌载 体的复制起点 • 举例： pDG148-Stu，利用大肠杆菌pBR322和枯草 芽胞杆菌载体pVB110的复制起点，能够超量表 达插入其StuI酶切位点的外源蛋白。
2019 24
pDG148-Stu克隆表达载体的结构特点
①具有乳糖操纵子调节基因lacI及其调控序列，使外源蛋白 的表达受IPTG的调控。
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3、细菌工程菌与食品、饲料及其他工业
• 食品生产：利用生物技术构建的品质优良 的食用乳酸杆菌能提高生产菌在食品发酵 过程中的稳定性，改善发酵食品的质量并 且降低了成本，大大缩短生产周期。
• 相关产品：酶制剂、氨基酸、维生素、增 稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食 用色素、食用香精及调味料等
大肠杆菌外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体， 含有大肠杆菌克隆载体的序列，便于在大肠杆菌中扩增和 制备。 例如，用于苏云金芽胞杆菌的克隆载体pHT304的基础 骨架为大肠杆菌克隆载体pUC18, 另装有能在Bt中复制的 质粒复制区序列ori1030和用于选择的红霉素抗性基因。
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1. 启动子的选择
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细菌基因工程的发展简史
• 1973年，波依尔(Boyer)和科恩(Cohen)首 次完成外源基因在大肠杆菌中的表达 • 1982年，第一个基因工程产品──利用构建 的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从 此人类进入了生物技术的产业时代。
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细菌基因工程的发展现状
1、细菌工程菌与人类药物生产 • 1982年美国首先将重组胰岛素投放市场， 标志着世界第一个基因工程药物的诞生。
• 特征：同时具有大肠杆菌载体和枯草芽胞杆菌载 体的复制起点 • 举例： pDG148-Stu，利用大肠杆菌pBR322和枯草 芽胞杆菌载体pVB110的复制起点，能够超量表 达插入其StuI酶切位点的外源蛋白。
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pDG148-Stu克隆表达载体的结构特点
①具有乳糖操纵子调节基因lacI及其调控序列，使外源蛋白 的表达受IPTG的调控。
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基因工程菌培养
5
基因工程菌发酵的设备
气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单， 低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）
基因工程菌培养
6
基因工程菌的高密度发酵
在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产 物的表达都是在对数期内完成的，因此， 发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌 的对数生长时间，缩短衰亡时间
酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提 高。
比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳ Ｈ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ /Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前 体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量 分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍
基因工程菌培养
9
培养方式
分批补料培养方式 补充营养 稀释代谢产物
基因工程菌培养
基因工程菌培养
1
什么是基因工程菌？
为什么要构建基因工程菌？ 遗传性状的改良 代谢途径的加工 生物反应器
基因工程菌培养
2
基因工程菌的构建
宿主菌：大肠杆菌
作为外源基因表达 的宿主,遗传背景清 楚,技术操作简单,培 养条件简单,大规模 发酵经济, 是应用最 广泛,最成功的表达 体系
宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 培养条件的影响（培养基，温度，pH等等）
基因工程菌培养
20
稳定基因工程菌的措施
改进重组质粒的结构 选择适当宿主 增加外界环境压力 调节培养条件
基因工程菌培养
21
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中
分离与培养耦合 固定化培养技术
固定化技术与连续培养，透析培养相结合 是基因工程菌发酵的发展方向
基因工程菌培养
10
接种量的控制
接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生 长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比 生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量 大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续 生长时间短,自溶也较快。
基因工程菌培养
18
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的 生长代谢
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的
缺失重排
基因工程菌培养
19
影响质粒稳定的因素
与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对 其稳定性的影响
血红蛋白，小球藻。 溶氧过高或局部过高，会使某些微生物氧中
毒
基因工程菌培养
13
pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
结构不稳定性
重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、 修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失
分配不稳定性
整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。 质粒拷贝数的影响
基因工程菌培养
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质粒的拷贝数的影响
外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数， 在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应 成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降， 高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性 增加。
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度；
⑵再诱导外源基因的表达
基因工程菌培养
23
控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表 达程度
控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定 件较用合成培养基为高
基因工程菌培养
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培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
基因工程菌培养
15
诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维 持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能 为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中 添加相应的营养组份
培养基复杂，成本较高
基因工程菌培养
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分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以
高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要 生产工艺
基因工程菌培养
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高密度发酵
培养基的要求 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达 产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细 菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需 要。
成分的要求：使用甘油的原因？ 浓度的要求
基因工程菌培养
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在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基
外源基因：质粒
基因工程菌培养
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基因工程菌生长的特点： 外源基因与宿主的互相影响 产物，资源的争夺
基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？
基因工程菌培养
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微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产 物，细胞生长并非主要目标。
基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物 。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒 上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表ห้องสมุดไป่ตู้水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
基因工程菌培养
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基因工程菌的不稳定性及对策
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组 质粒的不稳定性：
基因工程菌培养
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接种量过小，延迟期太长 较接种量大，可缩短生长延迟期，菌体 迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表 达外源基因。
接种量过高，使菌体生长过快，代谢物 积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。
基因工程菌培养
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发酵中溶解氧的控制
纯氧？富氧！ 添加提高传氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，