LC-MS定性定量方法与技术
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TIC
BPC
磺胺类药物的LC/MS
TIC
EIC m/z 311.0805
磺胺类药物的MS/MS
H3C O
N H3C O
NO NH2+S O
H3C O
N H3C
O
N NH3+
specific to sulfadimethoxine
NH2
O
H3N+
S O
common to all sulfonamides
• 在质谱法中，此式只适用于分子离子M＋·。偶电子离 子 同理，，如由CHM3++比HC+计H4算少所1个得氢的，中故性导分致子DMB的E出DB现E应半加整0数.5。； (M-H)-计算得到的M的DBE应减去0.5。
“氮规律”，奇电子离子，偶电子离子
• 氮规律指出：含偶数氮原子或不含氮原子的分子其分 子量为偶数。这是因为氮的质量是偶数（14），而价 态为奇数。而其他元素的质量和价态要么均为偶数， 要么均为奇数。
• 用LC/MS鉴定化合物鉴定时 ， 以质谱全扫描作为搜索扫描，触发MS/MS扫 描。 在总离子流或基峰离子流中发现化合物，用产物离子谱进行结构鉴 定。
• 分析同类化合物中的未知物时， 可用已知的裂解途径 ， 进行母离子扫描 （PI） 或中性丢失扫描（NL） 以发现未知物， 然后采集产物离子谱进行 结构鉴定。
环状离子断裂两个键，电荷保留
基本的偶电子离子裂解反应（2）
两个键的断裂，伴随着重排
基本的偶电子离子裂解反应（3）
如烷链较长，通过六元环的γ位氢重排为优势过程，这是发生在偶电子离子上的 McLafferty重排
肽产生的离子的命名
寡核苷酸产生的离子的命名
磷酸二酯键的4种可能的裂解产生8种离子，含5’-OH的离子称an 、bn 、cn 和dn而含3’-OH的离子称wn 、xn 、yn和zn。下标n指示其裂解位置。碱基的 进一步丢失用括号表示，如a3-B3（A）表示键的开裂发生在3位的磷酸二酯 基的核糖碳原子和氧原子之间并在同一位置进一步丢失了腺苷碱基。
形成B、Y的机制
形成A、X的机制
黄酮苷产生的离子的命名
化合物鉴定
• 用LC/MS 鉴定化合物通常分两个步骤：
– 在样品中发现化合物； – 采集产物离子谱鉴定化合物
• 在复杂样品中鉴定化合物， 有一定挑战性，低浓度的 化合物常被基质抑制或掩盖。
化合物鉴定
—基于四极仪器的方法技术
• 如前所述， 目前用得最多的还是基于四极原理的质谱仪， 如 QMS、 TSQMS、QTrap 、ITMS， 这些仪器为扫描仪器。 此处， 主要讨论MS/MS 的方法。
质量a 1.007825035 2.014101779 12 13.00335483 14.003074 15.00010897 15.99491463 16.9991312 17.9991603 18.99840322 22.9896767 27.9769271 28.9764949 29.9737701 30.973762 31.9720707 32.97145843 33.96786665 35.96708062 34.96885273 36.96590262 38.9637074 39.9639992 40.9618254 78.9183361 80.916289 126.904473
因为每个元素均有特定的准确质量，因此，如能准确测定离 子的或质分量分子别的为质1量8，0.1就75可3和以1计80算.1其87元9u素，组相成差。0.0例1如26Cu1，3H为24和了C分12离H2这2N 两个化合物，仪器的分辨率m/Δm应为14300，为了区分他们，质 量测定应准确到小数点后4位有效数字。但是，随着待测物质质 量的增加，由各种元素组合成该质量的可能性迅速增加，而且其 中某些组合的质量的差别可能很小，因此，对仪器的分辨率及质 量测定的准确度的要求更高。
分子量信息
• 平均分子量（average molecular mass）由分子中各元素的（相对）平均原子量计算所得。
元素 H C N O F Na Si P S Cl K Br I
原子量a 1.00794（7） 12.011（1） 14.00674（7） 15.9994（3） 18.998403（9） 22.989768（6） 28.0855（3） 30.973762（4） 32.066（6） 35.452（9） 39.0983（1） 79.904（1） 126.90447（3）
分子量信息
天然丰度（%）b 99.985 0.015 98.9 1.1 99.63 0.37 99.76 0.04 0.2 100 100 92.23 4.67 3.1 100 95.02 0.75 4.21 0.02 75.77 24.23 93.2581 0.012 6.7302 50.69 49.31 100
高分辨质谱和元素组成
用质谱仪的应用程序，根据仪器测定的质量及离子或分子 中可能存在的元素，可计算出在一定测定误差范围内分子或离 子的各种可能的元素组成，即实验式。用准确质量计算元素组 成时，不能忽略电子的质量。质量测定的误差越小，可能的元 素组成越少。确定待测物质的实验式或元素组成时，应考虑质 谱法及其他理化方法提供的各种信息。
LC/MS定性定量方法与技术
盛龙生
中国药科大学 南京 210009 E-mail:shenglsh@yahoo.com.cn
LC-MS定性定量方法与技术
本讲内容：
1. LC/MS的基本数据与信息 2. LC/MS定性分析技术 3. LC/MS定量分析技术
LC/MS的基本数据与信息
LC/MS的基本数据与信息基于： MS质谱峰的m/z和强度 LC色谱峰的保留数据与面积
• 在质谱中氮规律指出：不含氮或含偶数氮原子的任何 离子，如为奇数电子（游离基阳离子或游离基阴离 子），其质量应为偶数，反之，若为偶电子离子（阳 离子或阴离子），其质量应为奇数。
• 含奇数氮的离子，如为奇电子离子，其质量应为奇数， 如为偶电子离子，其质量应为偶数。
质谱解析
• 质谱裂解主要为由游离基驱动（奇电子离子）的α 裂解和由电荷驱动（偶电子离子或奇电子离子）的 诱导裂解（i裂解）引起的两种基本途径。软离子化 技术，如ESI等，主要生成准分子离子，如M+H+， M+Na+，[M-H]-，M+Cl-等，这些离子均为偶电子离 子，在所得的质谱中，准分子离子常常是主峰，没 有或较少碎片峰，因而缺乏结构信息。为了获得结 构 信 息 ， 主 要 采 用 两 种 技 术 ， 即 MS-(CID)-MS（ 或 MSn）及源内碰撞诱导解离（in source CID）。偶电 子离子优势裂解反应为丢失一个小的中性分子并生 成另一偶电子离子。
122
100
N
NH N
HN
O
NN
N N
(M+H)+
O
386
75
磺胺类药物的
O
O
50
N
NH
N
O O
25
150
222 265
180
100
150
200
250
300
350
400
m/z
前体离子扫描-寻找代谢物
不饱和度
• 如果分子或碎片的元素组成己知，可计算其不饱和度， 包 括 环 、 双 健 和 叁 键 ， 故 又 称 双 键 相 等 数 （ double bond equivalents, DBE）。
• 设分百度文库式的通式为CxHyNzOn,, 则： DBE=x-(1/2y)+(1/2z)+1
• 卤素等取代一个H的元素计作H，S计作O, P计作N，Si 计作C。
裂解途径
为了解释互补离子an-Bn和wn的形成，提出了几种裂解途径，例如：
上述裂解途径中首先通过1，2消除丢失碱基。这一消除可能是由于分子间的碱催化产生 的（3’磷酸酯基的带负电的氧原子）。然后，由这一中间体通过磷酸二酯基的3’C-O键 的开裂产生an-Bn和wn碎片。
寡糖产生的离子的命名
电荷保留在非还原端的碎片称A、B、C，而电荷保留在还原端的碎片称X、Y、Z。
高分辨质谱法也提高了目标化合物筛选和定量测定的选择 性。
同位素丰度
• 绝大多数元素在自然界以同位素混合物存在，如天然 的碳是98.90%的12C和1.10%的13C的混合物。
• 由于元素的同位素的存在，所以质谱峰呈现为同位素 峰簇，是各种元素及其同位素组成的表现，他们提供 了另一重要性息。
• 在质量测定的准确度有限时，根据同位素丰度数据有 可量能均限为1定4元0 u素，组而成其。在例m如/z1，41C处10H的20同和位C8H素12峰O2相的对名于义质 m/z140峰的强度分别为11%和8.8%，这是由13C存在的 机率所确定的，因而可区分这两个离子。应该注意低 丰度同位素峰的测定误差较大，还可能有其他成分的 离子与之重叠，所以实际应用有一定限制。
156.07604 12184
4 GHz
8
7.5
7
6.5
6 5.5
Resolution 12184
5
4.5
4
3.5
3
156.01087 12238
2.5
2
1.5
1
156.11226
0.5
9868
0 155.78 155.8 155.82 155.84 155.86 155.88 155.9 155.92 155.94 155.96 155.98 156 156.02 156.04 156.06 156.08 156.1 156.12 156.14 156.16 156.18 156.2 156.22 156.24 156.26 156.28 156.3 156.32 156.34 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)
单同位素分子量 （mono isotopic molecular mass） 由分子中各元素
中丰度最高（最
轻）的同位素的
（相对）原子量 计算所得
高分辨质谱和元素组成
如果离子质量测定的准确度足够高，则可以得到该离子确定 的元素组成。对于未知物分析，这个方法非常重要，常常称为 “高分辨质谱”。其实，仪器的分辨率和质量测定的准确度显然 是两个不同的概念。但是，通常，质谱的准确质量测定是以高分 辨率为前提的。如果仪器的分辨率不高，不能分离名义质量（整 数质量）相同而准确质量稍有差别的离子，则质谱测定的是由不 同离子重叠而成的质谱峰的质量。
• 质谱解析的经典著作是McLafferty的《Interpretation of Mass Spectra》，另外，也有商品化的解析软件 《Mass Frontier》等。
基本的偶电子离子裂解反应（1）
单键裂解伴随电荷的迁移
CH3-CH2-OH2+ → CH3-CH2+ + H2O
键的裂解伴随环化及电荷的迁移
LC/MS定性定量分析数据
定性数据
• TIC（或BPC，EIC 等）色谱峰的保留时间（tR ） • 质谱及m/z测定数据 • 化合物或离子的分子量、实验式、不饱和度 • 质谱峰的同位素丰度比 • MSn （ CID）结构信息 • “氮规律”
定量数据
• 质谱峰強度，色谱峰的面积
LC/MS提供的信息
a “Atomic Weights of the Elements 1987,” Pure Appl. Chem. 1988，60：841 括号内的数值为测不准水平，主要是同位素 丰度的自然变化。例如，氢原子量为1.00794±0.00007
同位素 1H 2H 12C 13C 14N 15N 16O 17O 18O 19F 23Na 28Si 29Si 30Si 31P 32S 33S 34S 36S 35Cl 37Cl 39K 40K 41K 79Br 81Br 127I
ESI/MS全扫描图（Buspirone）
100
(M+H)+ 386
N
O
NN
N N
75
O
Buspirone
C21H31N5O2
50
MW = 385
Relative Abundance
25
(M+Na)+
408
150
200
250
300
350
400
450
500
m/z
Buspirone产物离子谱
Relative Abundance
O
S O+
NH2
NH2
磺胺类药物的MS/MS
m/z 156.0119
NH2
O S O+
m/z 156.0773
H3C O
N H3C
O
N NH3+
x10 1 + Product Ion (0.820-0.966 min, 10 scans) (311.08060[z=1] -> **) sulfas_10ng_4GHz-016.d 9.5 9 8.5
BPC
磺胺类药物的LC/MS
TIC
EIC m/z 311.0805
磺胺类药物的MS/MS
H3C O
N H3C O
NO NH2+S O
H3C O
N H3C
O
N NH3+
specific to sulfadimethoxine
NH2
O
H3N+
S O
common to all sulfonamides
• 在质谱法中，此式只适用于分子离子M＋·。偶电子离 子 同理，，如由CHM3++比HC+计H4算少所1个得氢的，中故性导分致子DMB的E出DB现E应半加整0数.5。； (M-H)-计算得到的M的DBE应减去0.5。
“氮规律”，奇电子离子，偶电子离子
• 氮规律指出：含偶数氮原子或不含氮原子的分子其分 子量为偶数。这是因为氮的质量是偶数（14），而价 态为奇数。而其他元素的质量和价态要么均为偶数， 要么均为奇数。
• 用LC/MS鉴定化合物鉴定时 ， 以质谱全扫描作为搜索扫描，触发MS/MS扫 描。 在总离子流或基峰离子流中发现化合物，用产物离子谱进行结构鉴 定。
• 分析同类化合物中的未知物时， 可用已知的裂解途径 ， 进行母离子扫描 （PI） 或中性丢失扫描（NL） 以发现未知物， 然后采集产物离子谱进行 结构鉴定。
环状离子断裂两个键，电荷保留
基本的偶电子离子裂解反应（2）
两个键的断裂，伴随着重排
基本的偶电子离子裂解反应（3）
如烷链较长，通过六元环的γ位氢重排为优势过程，这是发生在偶电子离子上的 McLafferty重排
肽产生的离子的命名
寡核苷酸产生的离子的命名
磷酸二酯键的4种可能的裂解产生8种离子，含5’-OH的离子称an 、bn 、cn 和dn而含3’-OH的离子称wn 、xn 、yn和zn。下标n指示其裂解位置。碱基的 进一步丢失用括号表示，如a3-B3（A）表示键的开裂发生在3位的磷酸二酯 基的核糖碳原子和氧原子之间并在同一位置进一步丢失了腺苷碱基。
形成B、Y的机制
形成A、X的机制
黄酮苷产生的离子的命名
化合物鉴定
• 用LC/MS 鉴定化合物通常分两个步骤：
– 在样品中发现化合物； – 采集产物离子谱鉴定化合物
• 在复杂样品中鉴定化合物， 有一定挑战性，低浓度的 化合物常被基质抑制或掩盖。
化合物鉴定
—基于四极仪器的方法技术
• 如前所述， 目前用得最多的还是基于四极原理的质谱仪， 如 QMS、 TSQMS、QTrap 、ITMS， 这些仪器为扫描仪器。 此处， 主要讨论MS/MS 的方法。
质量a 1.007825035 2.014101779 12 13.00335483 14.003074 15.00010897 15.99491463 16.9991312 17.9991603 18.99840322 22.9896767 27.9769271 28.9764949 29.9737701 30.973762 31.9720707 32.97145843 33.96786665 35.96708062 34.96885273 36.96590262 38.9637074 39.9639992 40.9618254 78.9183361 80.916289 126.904473
因为每个元素均有特定的准确质量，因此，如能准确测定离 子的或质分量分子别的为质1量8，0.1就75可3和以1计80算.1其87元9u素，组相成差。0.0例1如26Cu1，3H为24和了C分12离H2这2N 两个化合物，仪器的分辨率m/Δm应为14300，为了区分他们，质 量测定应准确到小数点后4位有效数字。但是，随着待测物质质 量的增加，由各种元素组合成该质量的可能性迅速增加，而且其 中某些组合的质量的差别可能很小，因此，对仪器的分辨率及质 量测定的准确度的要求更高。
分子量信息
• 平均分子量（average molecular mass）由分子中各元素的（相对）平均原子量计算所得。
元素 H C N O F Na Si P S Cl K Br I
原子量a 1.00794（7） 12.011（1） 14.00674（7） 15.9994（3） 18.998403（9） 22.989768（6） 28.0855（3） 30.973762（4） 32.066（6） 35.452（9） 39.0983（1） 79.904（1） 126.90447（3）
分子量信息
天然丰度（%）b 99.985 0.015 98.9 1.1 99.63 0.37 99.76 0.04 0.2 100 100 92.23 4.67 3.1 100 95.02 0.75 4.21 0.02 75.77 24.23 93.2581 0.012 6.7302 50.69 49.31 100
高分辨质谱和元素组成
用质谱仪的应用程序，根据仪器测定的质量及离子或分子 中可能存在的元素，可计算出在一定测定误差范围内分子或离 子的各种可能的元素组成，即实验式。用准确质量计算元素组 成时，不能忽略电子的质量。质量测定的误差越小，可能的元 素组成越少。确定待测物质的实验式或元素组成时，应考虑质 谱法及其他理化方法提供的各种信息。
LC/MS定性定量方法与技术
盛龙生
中国药科大学 南京 210009 E-mail:shenglsh@yahoo.com.cn
LC-MS定性定量方法与技术
本讲内容：
1. LC/MS的基本数据与信息 2. LC/MS定性分析技术 3. LC/MS定量分析技术
LC/MS的基本数据与信息
LC/MS的基本数据与信息基于： MS质谱峰的m/z和强度 LC色谱峰的保留数据与面积
• 在质谱中氮规律指出：不含氮或含偶数氮原子的任何 离子，如为奇数电子（游离基阳离子或游离基阴离 子），其质量应为偶数，反之，若为偶电子离子（阳 离子或阴离子），其质量应为奇数。
• 含奇数氮的离子，如为奇电子离子，其质量应为奇数， 如为偶电子离子，其质量应为偶数。
质谱解析
• 质谱裂解主要为由游离基驱动（奇电子离子）的α 裂解和由电荷驱动（偶电子离子或奇电子离子）的 诱导裂解（i裂解）引起的两种基本途径。软离子化 技术，如ESI等，主要生成准分子离子，如M+H+， M+Na+，[M-H]-，M+Cl-等，这些离子均为偶电子离 子，在所得的质谱中，准分子离子常常是主峰，没 有或较少碎片峰，因而缺乏结构信息。为了获得结 构 信 息 ， 主 要 采 用 两 种 技 术 ， 即 MS-(CID)-MS（ 或 MSn）及源内碰撞诱导解离（in source CID）。偶电 子离子优势裂解反应为丢失一个小的中性分子并生 成另一偶电子离子。
122
100
N
NH N
HN
O
NN
N N
(M+H)+
O
386
75
磺胺类药物的
O
O
50
N
NH
N
O O
25
150
222 265
180
100
150
200
250
300
350
400
m/z
前体离子扫描-寻找代谢物
不饱和度
• 如果分子或碎片的元素组成己知，可计算其不饱和度， 包 括 环 、 双 健 和 叁 键 ， 故 又 称 双 键 相 等 数 （ double bond equivalents, DBE）。
• 设分百度文库式的通式为CxHyNzOn,, 则： DBE=x-(1/2y)+(1/2z)+1
• 卤素等取代一个H的元素计作H，S计作O, P计作N，Si 计作C。
裂解途径
为了解释互补离子an-Bn和wn的形成，提出了几种裂解途径，例如：
上述裂解途径中首先通过1，2消除丢失碱基。这一消除可能是由于分子间的碱催化产生 的（3’磷酸酯基的带负电的氧原子）。然后，由这一中间体通过磷酸二酯基的3’C-O键 的开裂产生an-Bn和wn碎片。
寡糖产生的离子的命名
电荷保留在非还原端的碎片称A、B、C，而电荷保留在还原端的碎片称X、Y、Z。
高分辨质谱法也提高了目标化合物筛选和定量测定的选择 性。
同位素丰度
• 绝大多数元素在自然界以同位素混合物存在，如天然 的碳是98.90%的12C和1.10%的13C的混合物。
• 由于元素的同位素的存在，所以质谱峰呈现为同位素 峰簇，是各种元素及其同位素组成的表现，他们提供 了另一重要性息。
• 在质量测定的准确度有限时，根据同位素丰度数据有 可量能均限为1定4元0 u素，组而成其。在例m如/z1，41C处10H的20同和位C8H素12峰O2相的对名于义质 m/z140峰的强度分别为11%和8.8%，这是由13C存在的 机率所确定的，因而可区分这两个离子。应该注意低 丰度同位素峰的测定误差较大，还可能有其他成分的 离子与之重叠，所以实际应用有一定限制。
156.07604 12184
4 GHz
8
7.5
7
6.5
6 5.5
Resolution 12184
5
4.5
4
3.5
3
156.01087 12238
2.5
2
1.5
1
156.11226
0.5
9868
0 155.78 155.8 155.82 155.84 155.86 155.88 155.9 155.92 155.94 155.96 155.98 156 156.02 156.04 156.06 156.08 156.1 156.12 156.14 156.16 156.18 156.2 156.22 156.24 156.26 156.28 156.3 156.32 156.34 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)
单同位素分子量 （mono isotopic molecular mass） 由分子中各元素
中丰度最高（最
轻）的同位素的
（相对）原子量 计算所得
高分辨质谱和元素组成
如果离子质量测定的准确度足够高，则可以得到该离子确定 的元素组成。对于未知物分析，这个方法非常重要，常常称为 “高分辨质谱”。其实，仪器的分辨率和质量测定的准确度显然 是两个不同的概念。但是，通常，质谱的准确质量测定是以高分 辨率为前提的。如果仪器的分辨率不高，不能分离名义质量（整 数质量）相同而准确质量稍有差别的离子，则质谱测定的是由不 同离子重叠而成的质谱峰的质量。
• 质谱解析的经典著作是McLafferty的《Interpretation of Mass Spectra》，另外，也有商品化的解析软件 《Mass Frontier》等。
基本的偶电子离子裂解反应（1）
单键裂解伴随电荷的迁移
CH3-CH2-OH2+ → CH3-CH2+ + H2O
键的裂解伴随环化及电荷的迁移
LC/MS定性定量分析数据
定性数据
• TIC（或BPC，EIC 等）色谱峰的保留时间（tR ） • 质谱及m/z测定数据 • 化合物或离子的分子量、实验式、不饱和度 • 质谱峰的同位素丰度比 • MSn （ CID）结构信息 • “氮规律”
定量数据
• 质谱峰強度，色谱峰的面积
LC/MS提供的信息
a “Atomic Weights of the Elements 1987,” Pure Appl. Chem. 1988，60：841 括号内的数值为测不准水平，主要是同位素 丰度的自然变化。例如，氢原子量为1.00794±0.00007
同位素 1H 2H 12C 13C 14N 15N 16O 17O 18O 19F 23Na 28Si 29Si 30Si 31P 32S 33S 34S 36S 35Cl 37Cl 39K 40K 41K 79Br 81Br 127I
ESI/MS全扫描图（Buspirone）
100
(M+H)+ 386
N
O
NN
N N
75
O
Buspirone
C21H31N5O2
50
MW = 385
Relative Abundance
25
(M+Na)+
408
150
200
250
300
350
400
450
500
m/z
Buspirone产物离子谱
Relative Abundance
O
S O+
NH2
NH2
磺胺类药物的MS/MS
m/z 156.0119
NH2
O S O+
m/z 156.0773
H3C O
N H3C
O
N NH3+
x10 1 + Product Ion (0.820-0.966 min, 10 scans) (311.08060[z=1] -> **) sulfas_10ng_4GHz-016.d 9.5 9 8.5