生化技术课件第二章沉淀
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第二章 沉淀技术
(1)盐类的选择 常用的盐为(NH4)SO4 。其优点：
①溶解度大，对温度不敏感
25℃
0℃
4.1mol/L (767g/L ) 3.9mol/L (679 g/L)
②分级效果好 少量的盐浓度变化（盐析范围窄）即可使有 效成分与杂质间分开。
③对核酸、蛋白等大分子有保护作用。
④价廉易得，工艺上讲，其本身就是肥料，废液可肥田。
二、有机溶剂沉淀法：指利用能和水互溶的有机 溶剂，如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，在低盐浓度 下沉淀蛋白质的方法。
原理 脱水作用，破坏水化膜 ；降低溶液极性 有机溶剂与盐析比较其优点：
①分辨率高 一种物质只能在一个比较窄的有机溶剂范 围内沉淀 ②沉淀后不需脱盐。 缺点：对某些大分子如酶等变性失活。同时此法必须 在低温下进行。
沉淀核酸应注意基本工作思路组织的粉碎细胞的裂解dnprnp的解聚除蛋白质多糖及rna或dna杂质的去除核酸的沉淀一组织的粉碎细胞的裂解动植物组织液氮研磨裂解液裂解sds低渗缓冲液微生物离心收集菌体sds裂解细胞溶解膜蛋白和脂肪二dnprnp复合物的解聚蛋白质的去除方法加去污剂有机溶剂蛋白水解酶等
第二章 沉淀技术
饱和硫酸铵的配制：取过量的硫酸铵加热溶 解，再在0℃或室温下放置，直至硫酸铵 有固体析出即达100%饱和度。
要达到某一饱和度所需加入硫酸铵溶液的体积
可按下式计算：
V=V0(S2－S1)/(1－S2) V—所需加入饱和硫酸铵溶液的体积；
V0——待盐析溶液的体积； S1——待盐析溶液的原始饱和度； S2—所需达到的硫酸铵的饱和度。 适用于原来溶液体积不大时使用。
第二节 蛋白质沉淀法
一、盐析法 1. 原理：高浓度的中性盐使蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜 被破坏，蛋白质分子表面疏水区域相互作用，引起蛋白质分子相 互聚集并沉淀析出。 2. 盐的分级沉淀：
沉淀技术教学课件
物化沉淀技术
1
氧气化学计量法
氧气化学计量法是利用氧气的氧化性质，在特定条件下使溶质以稳定的氧化物形态沉 淀。
2
硝酸化学计量法
硝酸化学计量法通过控制硝酸用量和浓度，使溶质以稳定的硝酸盐形态沉淀下来。
3
恒流电沉积法
恒流电沉积法是利用电流调节沉淀速率，实现可控、均匀的物化沉淀过程。
4
恒电位沉积法
恒电位沉积法通过控制电位调节沉淀速率和沉淀物质的晶型，实现精确的沉淀控制。
沉淀技术能够实现物质的分离、纯化和定量分析， 是重要的实验室技术。
随着科学技术的不断发展，沉淀技术在各个领域 的应用前景广阔。
特殊操作沉淀技术
1
超重力沉淀技术
超重力沉淀技术利用高速离心作用，加强沉淀过程，实现快速和高效的物质分离。
2
非平衡沉淀技术
非平衡沉淀技术通过调节温度、压力和浓度等非平衡条件，实现特定物质的沉淀分离。
3
电化学催化沉淀技术
电化学催化沉淀技术利用电化学反应促进沉淀过程，加速反应速度和沉淀效果。
沉淀技术的误区
沉淀技术教学课件PPT
本PPT旨在介绍沉淀技术的定义、应用以及分类。从常规沉淀技术到物化沉淀 技术，再到特殊操作沉淀技术，掌握不同类型的沉淀技术和相关误区，为您 打开沉淀技术的奥秘之门。
简介
沉淀技术是一种重要的实验室技术，通过控制溶液中溶质的沉淀来实现物质的分离、纯化和定量分析。 本节将介绍沉淀技术的定义和应用，帮助您理解沉淀技术的重要性和广泛应用领域。
普通沉淀是最基本的沉淀技术，通过
多次沉淀
2
调整溶液条件，使溶质以固态形式沉 淀下来。
多次沉淀是利用多次重复沉淀过程，
进一步提高沉淀效果和纯度。
2019生化实验-PPT课件
卵清蛋白分离提取
第一天 新鲜鸡蛋两只 取蛋清50 ml 温水浴25℃～ 30℃ 加入等体积的三 氯乙酸－丙酮 （1:2V/V） 最终pH约3.5 再继续搅拌30 min 4℃放置过夜
第二天 布氏漏斗抽滤（或离心），得黄绿色清液 加入4℃预冷的丙酮200 ml 在4℃放置2 h之后， 弃上部丙酮液，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min 收集沉淀 沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透 析4 h，换水两次 再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜
2019 生化实验
实验安排
1
第一天 第二天
粗胰酶提取、卵清蛋白提取 粗胰酶提取卵清蛋白提取
PPO活性、蛋白浓度 测定
第三-四天
PPO提取、纯化
第五-七天
亲和层析柱材制备、染色体、质粒DNA提取
酶切、亲和层析 连接、感受态细胞制备 酶切、感受态细胞制备 连接、亲和层析
转化、SDS-PAGE、电转 Western
４：3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4℃保存, ５：氨苄青霉素 50mg/ml, ６：溶菌酶 ７：酚/氯仿/异戊醇 (25/24/1) ８：异丙 醇 ９：LB培养基10: TE缓冲液 11:电泳试剂
含氨卞（100ug/ml）的LB培养基 培养菌体 37℃ 200rpm 过夜 吸取1.5ml, 5000rpm,1－2min离心，取沉淀 预冷的100ul Solution Ⅰ,充分振荡悬浮 加入200ulSolutionII,颠倒徭匀后冰浴中3-5min, 150ul预冷Solution III混匀, 冰浴5min 离心,12000rpm,,5min 取上清加等体积氯仿，静置2-4min， 12000g 离心24min 取上清加2体积的乙 醇,1/10体积乙酸钠，-80 ℃,5-10min 12000g 离心 10min 取沉淀 冷冻干燥 悬于30μ ldd水
生化技术第二章 离心分离PPT教学课件
应用最早、最广泛的检测技术 简便、快速、操作容易
一 糖类的化学检测
糖类包括多糖、双糖、单糖 单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖 多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖 糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原
性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反 应而进行测定的。
非还原糖必须转化为还原糖再进行测定
用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗 结晶等较大颗粒
2高速离心机 1*104g～2.5*104 r/min ，R.C.F 1*104g～105g
用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细 胞器等
高速冷冻离心机
3 超速离心机
2.5*104g～8*104 r/min ，R.C.F 5*105g或更高 结构：离心管帽、冷冻装置和温控系统、真空
第二章 离心分离
借助离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小和不同密度的物质分离的技术
细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等 常用离心分离
超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别 和各种生物大分子的重要手段之一
一 离心机的种类与用途
转速分：常速（低速）、高速和超速
1 常速离心机
<8000r/min, R.C.F<1*104g
定磷试剂，45 ℃水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线
（3）核酸含量的计算 一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％， RNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.9 DNA量＝ （总磷量－无机磷量）×10.5
2 二苯胺法测定DNA含量
DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺 试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有 最大吸收峰。在40～400μ g范围内，OD595与 DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏 度。
一 糖类的化学检测
糖类包括多糖、双糖、单糖 单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖 多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖 糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原
性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反 应而进行测定的。
非还原糖必须转化为还原糖再进行测定
用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗 结晶等较大颗粒
2高速离心机 1*104g～2.5*104 r/min ，R.C.F 1*104g～105g
用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细 胞器等
高速冷冻离心机
3 超速离心机
2.5*104g～8*104 r/min ，R.C.F 5*105g或更高 结构：离心管帽、冷冻装置和温控系统、真空
第二章 离心分离
借助离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小和不同密度的物质分离的技术
细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等 常用离心分离
超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别 和各种生物大分子的重要手段之一
一 离心机的种类与用途
转速分：常速（低速）、高速和超速
1 常速离心机
<8000r/min, R.C.F<1*104g
定磷试剂，45 ℃水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线
（3）核酸含量的计算 一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％， RNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.9 DNA量＝ （总磷量－无机磷量）×10.5
2 二苯胺法测定DNA含量
DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺 试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有 最大吸收峰。在40～400μ g范围内，OD595与 DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏 度。
生物化学技术2沉淀法
（三）蛋白质沉淀法
1.碱性蛋白质（多价阳离子的碱性蛋白质）
如：鱼精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀Pro
应用：①鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母PFK溶液时，溶 液中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白—核酸沉淀物上；将沉淀 物用0.1mol/L磷酸缓冲液洗脱，收集的PFK纯度提高了9倍
②从深红螺菌中分离PEP羟基激酶时，加鱼精蛋白处 理，可除去其中3/4的杂蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中
（4）脱盐
常用方法：凝胶过滤法和透析法
透析操作的注意事项：
透析袋处理：市售透析袋要D.W洗净，检查无漏洞时再用。 若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐 时，透析袋应用含EDTA-Na2的NaHCO3溶液中煮沸 10min；并经D.W煮沸、漂洗后再用
透析液的选择：透析液一般为低离子强度的中性缓冲液。 对含有辅基的酶透析时，宜在透析液中加入适量的辅基或 保护辅基的试剂。为防止微生物的生长，透析应在4℃进行 或在透析液中添加0.02%的NaN3
② （NH4）2SO4盐析
固体法 在大体积的粗提液中逐渐加入固体（NH4）2SO4，边 加边搅拌，缓缓加入。在此过程中，溶液（NH4） 2SO4的浓度不断升高，水分子不断与（NH4）2SO4结合， 当加入的（NH4）2SO4达到盐析点时，蛋白质就会沉 淀出来
例：在尿素酶抽提液中加入（NH4）2SO4，当饱和度达为35%时，尿素 酶基本留在溶液中；但当饱和度达到55%时，尿素酶几乎全部沉淀
对于难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅 拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速结晶
三、制备核酸
从生物材料（如动物组织、线粒体、叶绿体，以及微生 物中的真菌、细菌和病毒等）中分离出的DNA或RNA，往往 是以DNA- Pro（DNP）或RNA- Pro（RNP）复合物的形 式存在的，所以制备核酸样品时，首先需使复合物解聚，释 放出核酸，除去Pro，然后用沉淀法得到核酸
蛋白质核酸沉淀分离技术课件.ppt
浓度。
加入硫酸铵固体的量：查表、计算
查表时 注意温
度
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
（1）加入固体盐法
20℃ 25℃
g ：加入固体硫酸铵的质量 S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
（2）加入饱和溶液法
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，
分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
§3.4 蛋白质沉淀方法
中性盐盐析法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
非离子型聚合物沉淀法
聚电解质沉淀法
金属沉淀法
其他沉淀法
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
一、中性盐沉淀法（盐析法）
盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。
优点 ①成本低，不需要特别昂贵的设备
或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用
前需用氨水或硫酸调节至所需pH。
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
二、等电点沉淀法 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白
质离子具有不同等电点这一特性，依次改 变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去， 最后获得目标产物。
硫酸铵饱和度％
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
方法二
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度
以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋 白质溶解度曲线
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
加入硫酸铵固体的量：查表、计算
查表时 注意温
度
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
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（1）加入固体盐法
20℃ 25℃
g ：加入固体硫酸铵的质量 S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度
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（2）加入饱和溶液法
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（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，
分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。
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§3.4 蛋白质沉淀方法
中性盐盐析法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
非离子型聚合物沉淀法
聚电解质沉淀法
金属沉淀法
其他沉淀法
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一、中性盐沉淀法（盐析法）
盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程 。
优点 ①成本低，不需要特别昂贵的设备
或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用
前需用氨水或硫酸调节至所需pH。
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二、等电点沉淀法 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白
质离子具有不同等电点这一特性，依次改 变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去， 最后获得目标产物。
硫酸铵饱和度％
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方法二
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度
以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋 白质溶解度曲线
蛋白质核酸沉淀分离技术课件
第二章 生物化学检验技术基础知识精品PPT课件
一、实验室规则
1．实验前的准备 实验前，要明确实验目的和要求。必须
认真预习实验的原理、操作步骤及注意事项， 做到实验目的明确：操作步骤及注意事项清 楚。
一、实验室规则
2．实验中的要求 （1）注重培养科学的思维方法、牢固的质量观念和良好的工作习惯 学生进入实验
室必须穿工作服。实验操作时，不能大声喧哗，来回走动，如有问题，举手请示 老师解决。 （2）实验操作过程应有条不紊，实验器具、试剂应摆放整齐有序。 （3）认真对待实验过程中的每一项基本技能训练：标本的制备及取样，试剂的定量 移取及加注，溶液的混匀、沉淀、过滤、’离心、保温、加热、冷却，各种仪器 的正确：操作等，均应在实验中反复多次训练，体会和掌握操作要点，力求做到 熟练、准确、规范。 （4）爱护公物，不管是易损的试管、吸管，还是精密分析仪器，均要按操作规程， 细心、认真操作。如有损坏，要及时登记补领，并按赔偿制度酌情赔偿；要注意 节约，避免不必要的人为浪费。 （5）试验中手脑并用，每进行一步操作，都要积极思考这一步的目的和作用。认真 观察实验现象。这样既能帮助理解实验原理及相关理论知识，又能培养科学的思 维习惯和方法。 （6）注意安全，杜绝安全事故的发生，凡属发烟或带恶臭及有毒气产生的化学操作， 均应在毒气柜中进行。 （7）生化实验大都是微量定量分析。要求在整个实验过程中，牢固树立定量的观念， 一切操作都要考虑到如何减少误差，保证分析结果的准确性。 （8）同学间要团结合作，不允许只顾自己，不顾别人，抢试剂，乱抓吸管。这样容 易导致实验混乱，标准液、标本、试剂间交叉污染，是全组实验失败。
一、实验室规则
3．实验后的清洁 实验结束后，对实验所得结果和数据，
进行整理、分析和计算。重视总结实验中的 经验、教训。认真完成实验报告，使用过的 器皿应清洗干净，放回原处，并安排劳动值 日生打扫实验室。离开实验室前要检查水、 电、煤气、门窗是否关好，经老师同意后方 能离开。
生物化学实验技术(2)常用分离技术
二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子， 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基 有敏感作用，使用前必须用H 处理： 有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓 溶液，通入H 饱和，放置过夜， 溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离 浓缩结晶，100℃烘干后使用 烘干后使用。 子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 ），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH 右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
第三节 其他沉淀法一．Fra bibliotek电点沉淀法 二．生成盐复合物沉淀法 三． 选择性变性沉淀 四．非离子多聚物沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低， 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 值。 等电点法常与盐析法、 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。 合使用，以提高其沉淀能力。
使用硫酸铵时： 使用硫酸铵时：
1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种， ）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有 ℃或室温两种， 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种 ）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（ 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或 ）盐析后一般放置半小时至一小时， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫 酸铵密度较大， 酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
(生化工程课件)16 沉淀法
止共沉现象。（pI） • 离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L • 样品浓度: 0.5~2%
–稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 –浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 • 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+
16.4 非离子型聚合物沉淀法
–优点：a 室温 b 颗粒大，易于收集 c 提高蛋白质的稳定性 d PEG 难去 除
– 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区 暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
16.2 等电点沉淀
• 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，
分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏， 由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生 沉淀。
• 概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析 出的操作称为等电点沉淀。
4.9
18.9
43.3
42.2
NaH2PO4
1.6
7.8
93.8
101
先除去杂蛋白，然后在较高的饱和度下， 沉淀目标蛋白，操作步骤如下
硫酸铵的最终浓度（％飽和）
1 0 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100
1L中应加硫酸铵的量 g
0 5 6 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767
（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度， 降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性， 导致脱水凝聚。
• 常用的有机溶剂沉析剂
• 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋 白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
–稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 –浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 • 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+
16.4 非离子型聚合物沉淀法
–优点：a 室温 b 颗粒大，易于收集 c 提高蛋白质的稳定性 d PEG 难去 除
– 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区 暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；
16.2 等电点沉淀
• 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，
分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏， 由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生 沉淀。
• 概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析 出的操作称为等电点沉淀。
4.9
18.9
43.3
42.2
NaH2PO4
1.6
7.8
93.8
101
先除去杂蛋白，然后在较高的饱和度下， 沉淀目标蛋白，操作步骤如下
硫酸铵的最终浓度（％飽和）
1 0 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100
1L中应加硫酸铵的量 g
0 5 6 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767
（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度， 降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性， 导致脱水凝聚。
• 常用的有机溶剂沉析剂
• 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋 白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
生化分离工程：2-1 沉淀
物分子，“盐溶”与“盐析”的分界值不同。
三） 影响盐析的因素
1 蛋白质种类和浓度
种类
生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基团与疏水基团不 相同，不同生物分子产生盐析现象所需中性盐的浓度（离子强 度）亦不同。
浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的影响，必须
将生物分子的浓度控制在一定的范围内。一般认为2.5%-3.0% 的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
二） 盐析剂
1. 盐析剂的选择
感胶离子序(Hofmeister序列): 1888年，Hofmeister对一系 列盐沉淀蛋白质的能力实验 测定，结果排列如下：
阴离子排序为：柠檬酸根3- > 酒 石 酸 根 3- >F- > IO-3 > H2PO-4 > SO-4 > CH3COO> Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 > ClO-4 > I- > CNS-;
对阳离子排序为： Th4+ > Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
阴阳离子盐析效果
结论：
离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。
• 阴离子盐析效果 ：
• 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3＞SCN-
一 概述
1 基本概念
定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶 解度降低而形成无定形固体沉淀的过程
三） 影响盐析的因素
1 蛋白质种类和浓度
种类
生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基团与疏水基团不 相同，不同生物分子产生盐析现象所需中性盐的浓度（离子强 度）亦不同。
浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的影响，必须
将生物分子的浓度控制在一定的范围内。一般认为2.5%-3.0% 的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
二） 盐析剂
1. 盐析剂的选择
感胶离子序(Hofmeister序列): 1888年，Hofmeister对一系 列盐沉淀蛋白质的能力实验 测定，结果排列如下：
阴离子排序为：柠檬酸根3- > 酒 石 酸 根 3- >F- > IO-3 > H2PO-4 > SO-4 > CH3COO> Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 > ClO-4 > I- > CNS-;
对阳离子排序为： Th4+ > Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
阴阳离子盐析效果
结论：
离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。
• 阴离子盐析效果 ：
• 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3＞SCN-
一 概述
1 基本概念
定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶 解度降低而形成无定形固体沉淀的过程
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• 第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚刚开始出现沉淀时，记下
所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点
• 继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得
到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第 二个级分，如此连续可得到6～10个级分
• 按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱
和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力
• 中性盐沉淀法（盐析法） • 有机溶剂沉淀法 • 蛋白质沉淀法 • 有机聚合物沉淀 • 选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀） • 结晶沉淀法
中性盐沉淀（盐析法）
• 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过
程称为“盐析”。
在蛋白质领域应用最广，其突出的优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
•pH值：pI附近
•离子强度：盐浓度<5%，V<2倍
蛋白质沉淀法
• 仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用 • 碱性蛋白质、凝集素、种金属
有机聚合物沉淀法
聚乙二醇
[HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)] (Polyethylene Glycol , PEG )
➢亲水性强，溶于水和许多有机溶剂 ➢对热稳定 ➢有广范围的分子量
结晶沉淀法：
在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。 不等同于等电点沉淀法
透析
• 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有近150年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术 之一
作用:
• 除盐 • 除少量有机溶剂 • 除去生物小分子杂质 • 浓缩样品
• 半透膜：纤维素 • 将半透膜制成袋状 • 袋内外两边的浓度
中性盐沉淀蛋白质的基本原理
盐分级沉淀：多次盐析的应用
中性盐的选择： 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它
与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃
20℃
80℃
100 ℃
（NH4)2SO4 70.6
75.4
Na2SO4
4.9
用过滤方法
• 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中
查出。
盐析曲线的制作
• 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据
可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和 度。具体操作方法如下：
• 取待分离样品溶液(已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度)，
冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次 分别加入不同量的硫酸铵
达到平衡为止
• “保留液” • “渗出液”或“透
析液”
• MwCO
• 扩散压(透析的动力)
• 透析的速度:
膜的厚度 溶质的浓度梯度 膜的面积 温度
• 检查透析效果的方法是：用 BaCl2检查
(NH4)2SO4，用 AgNO3 检查NaCl、KCl等
制备核酸
• DNA-蛋白质(DNP)
• RNA-蛋白质(RNP)
• 快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
沉淀法
• 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
• 基本原理：溶解度的不同 • 不同溶解度的产生的原因：亲和力的差异
溶解度的大小与下列因素有关：
✓ 溶质和溶剂的化学性质及结构 ✓ 加入某些沉淀剂 ✓ 溶液的pH值、离子强度和极性
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：
18.9
NaH2PO4
1.67.895.310343.3
42.2
93.8
101
2) 分离效果好 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 4) 价格便宜，废液不污染环境
•缺点：需要一定时间脱盐
盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法
• 最常用的是固体硫酸铵加入法 • 原则：缓慢均匀少量
• 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常
第二章 生物大分子的纯化方法
概述 • 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题
• 达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题 。
常用的分离纯化方法和技术有：
• 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性
沉淀等）
• 离心 • 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲
和层析
注意点 ：
①水相和有机相的位置 ②充分接触，速度适当 ③苯酚重新蒸馏 ④异戊醇混合液
脱盐
• 常用方法：凝胶过滤法和透析法
• 透析法：
有机溶剂沉淀法
⑴基本原理 ①降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小 ②有机溶剂脱水作用
有机溶剂沉淀法的优点是：
①分辨能力比盐析法高
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易
其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引 起变性失活，操作需在低温下进行
有机溶剂的选择和浓度的计算
DNP／RNP复合物的解聚
• 去污剂 • 有机溶剂 • 蛋白水解酶
(1)去污剂
• 十二烷基硫酸钠(SDS)或Tween40 …… • 乙酸钾溶液 • 离心除去沉淀物 • 上清液即为初步纯化的核酸制品
(2)有机溶剂
• 苯酚、氯仿 • 上层水相(含核酸)和下层有机相 • 界面：变性凝聚蛋白 • 收集水相
• 与水互溶:乙醇、甲醇和丙酮 。
• 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂
浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下 式计算：
V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)
有机溶剂沉淀的影响因素
•温度：
一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高
•样品浓度：蛋白质初浓度：
5mg/mL～20mg/mL
• 以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，
即可得到盐析曲线
蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度％
盐析的影响因素：主要盐析常数Ks
1) 蛋白质的浓度： 较适中的浓度0.2 %～ 2.0%
2) pH值对盐析的影响：pI
3) 温度的影响：离子强度 0℃～4℃
• 在生物大 分子制备 中 ，用的 较多的是 分子量为 400 ～
6000 的 PEG
本方法的优点：
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性
②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当 多的生物大分子
③沉淀后有机聚合物容易去除
选择性变性沉淀法
原理：利用理化性质等方面的差异 ⑴ 热变性 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性 ⑶ 选择性酸碱变性