大肠菌群测定 PPT
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食品中大肠菌群检测PPT课件
食品卫生监督中的应用
餐饮业卫生监督
在餐饮业卫生监督中，大肠菌群 检测是重要的检测指标之一，用 于评估餐饮企业的卫生状况和食
品安全水平。
超市食品安全检测
超市食品安全检测中，大肠菌群 检测是必检项目之一，用于检测 食品是否符合国家食品安全标准。
食品进出口检验
在食品进出口检验中，大肠菌群 检测是重要的检测指标之一，用 于评估食品的卫生状况和安全性，
自动化检测技术
利用机器人和自动化设备进行样品处理和数据分析，提高检测效 率。
快速检测技术
开发新型培养基和试剂，缩短检测时间，提高检测速度。
基因检测技术
利用基因测序和生物信息学技术，提高检测准确性和特异性。
提高检测效率和准确性的方法
标准化操作流程
01
制定统一的大肠菌群检测标准，规范操作流程，减少误差。
05
大肠菌群检测的挑战和未来发展
当前面临的挑战
检测方法不统一
目前大肠菌群检测方法多样，缺乏统一的标准， 导致检测结果存在差异。
检测效率低下
传统检测方法过程繁琐，耗时长，无法满足快速、 大批量检测的需求。
检测准确性不高
由于操作复杂和干扰因素多，传统检测方法容易 出现假阳性或假阴性结果。
技术发展与未来趋势
检测步骤
采集样品、增菌培养、分 离培养、生化鉴定和计数。
培养法检测
传统培养法
将样品接种在选择性培养 基上，通过培养后观察菌 落形态、染色和生化反应 等特征进行鉴定。
自动化培养法
利用自动化仪器进行样品 接种、培养和检测，提高 检测效率和准确性。
培养法优缺点
培养法准确度高，但检测 周期较长，需要专业人员 操作。
确保食品的安全进出口。
应用MUGal检测大肠菌群(幻灯)
以MUGal肉汤 测试标准菌株 的结果与标准 法完全一致
所试13株标准菌 所试13株标准菌 种 在 MUGal 肉 汤 显 荧光情况和在LST肉 荧光情况和在LST肉 汤及乳糖胆盐发酵 管产酸产气情况完 全一致。细菌产荧 光的时间明显早于 产气的时间。一般 产荧光培养6—10h 即可查见，产气则 于孵育14 h 于孵育 14h 后方可见 到。粪链球菌虽能 发酵乳糖并分解 MUGal， MUGal， 但 在 LST、 LST、 MUGal 肉 汤 和 乳 糖 胆盐发酵管中被抑 制。
研究技术路线
MUGal的合成 MUGal的合成 培养基 制备 标准菌株验证 SIGMA产品比较 与SIGMA产品比较 样品试验
MUGal的合成 MUGal的合成
按Martos的 Martos的 方法， 方法，制备溴 代乙酰半乳糖 （Ⅰ） ，再按 Robinson的方 Robinson的方 法与4 法与4-甲基伞 形酮（ 形酮（Ⅱ）在 碱性条件下缩 合为4 合为4-甲基伞 形酮形酮-乙酰半乳 糖苷（ 糖苷（Ⅲ） ，最后脱酰而成 4-甲基伞形酮甲基伞形酮β-D-半乳糖苷 （Ⅳ） 。
应用4 甲基伞形酮应用4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖 苷快速检验食品中的大肠菌群
甄宏太 李 平 方原民 镇江出入境检验检疫局） （镇江出入境检验检疫局）
前 言 一
大肠菌群作为粪便污染的指示菌, 大肠菌群作为粪便污染的指示菌,是食品卫生检验 的重要微生物项目之一 。 我国现行检验大肠菌群的标准检验方法以发酵乳糖， 我国现行检验大肠菌群的标准检验方法以发酵乳糖， 产酸和气作为判定依据，需1-4天。 产酸和气作为判定依据， 国外多采用测定ß 国外多采用测定ß-半乳糖苷酶的方法取代乳糖发酵 试验，该法灵敏、准确。ISO9308.1:2000也明确定 试验，该法灵敏、准确。ISO9308.1:2000也明确定 义了大肠菌群具有ß 半乳糖苷酶。 义了大肠菌群具有ß-半乳糖苷酶。 测定ß 半乳糖酶常用的底物有4 甲基伞形酮测定ß-半乳糖酶常用的底物有4-甲基伞形酮-ß-D半 乳糖苷（MUGal）、 ）、5 吲哚乳糖苷（MUGal）、5-溴-4氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷 gal）、 ）、3 环已酮半乳糖苷和8 （X-gal）、3，4-环已酮-ß-D-半乳糖苷和8-羟基喹 半乳糖苷等。 啉-ß-D-半乳糖苷等。当这些试剂中的半乳糖被大肠 菌群产生的半乳糖苷酶水解后， 菌群产生的半乳糖苷酶水解后，荧光物质或显色物 质游离，而产生荧光或显色。 质游离，而产生荧光或显色。
大肠菌群检验方法课件
平板计数
证实实验
分离培养
证实试验
↓ 报告
两步法
MPN计数法
1.推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个 稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃ 培养48±2h，观察是否产气。 2.证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐 （BGLB）肉汤管中，36±1℃培养 48±2h，观察是否产气。以BGLB产 气为阳性。查MPN表，报告每ml(g) 样品中大肠菌群的MPN值。
大肠菌群检验方法
介绍
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组 与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性 厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰 氏阴性无芽胞杆菌。 因此大肠菌群的检测一般都是按照它的 定义进行。有两步法、三步法
大肠菌群
两部法 三步法
↓
MPN计数法
↓
平板计数法
↓
↓
乳糖发酵试验
↓
↓
推测试验
证实实验
三步法
乳糖发酵试验、分离培养和证实试验
三步法：
1.乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个释 度接种三管乳糖蛋白胨发酵管。36±1℃ 培 养 48±2h，观察是否产气。 2.分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平 板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。
3.证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观 察，同时接种普通乳糖发酵管36±1℃， 24±2h，观察产气情况。
主题一
示例一，引出主题 解释细节 进行练习以巩固所学内容
主题二
示例二，引出主题 解释细节 进行练习以巩固所学内容
总结
回顾所学内容 总结学习方法 与学员的互动交流，获取反馈信息
其它信息
参考书籍、电子文档等 咨询服务联系方式 ……
《大肠菌群测定》PPT课件
GB4789.3-2010 大肠菌群测定
GB4789.3-2010 大肠菌群测 定
• 定义：大肠菌群：一群在36℃培养48h可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和 兼性厌氧革兰氏染色阴性 无芽孢杆菌。该菌主要来 源自人畜粪便，作为粪便 污染指标评价食品的卫生 状况，推断 食品中肠道致 病菌污染的可能。
2
大肠菌群的食品卫生学意义
标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个 组合。 3 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单 位是100g/ml。
10
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
新国标的MPN表的基准问题。
1、新国标的MPN表采用了3个稀释度，分别是十 倍－百倍－千倍，加样量是3管，每管1毫升，意 味着加入样品的量为0.333克。
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
4
第一法 大肠菌群MPN计数法
• 初发酵：月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）替代 了乳糖胆盐发酵培基
• 确证实验：煌绿乳糖胆盐肉汤 （BGLB）替代了乳糖复发酵培 养基，取消了革兰氏染色实验
• 培养时间：由24h延长至48h • 单位：由MPN/100g变为
MPN/g
5
第一法 大肠菌群MPN计数法
12
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
改变加样量的问题。 这样查表得到的数值，应该降低10倍。
GB4789.3-2010 大肠菌群测 定
• 定义：大肠菌群：一群在36℃培养48h可发酵 乳糖、产酸产气的需氧和 兼性厌氧革兰氏染色阴性 无芽孢杆菌。该菌主要来 源自人畜粪便，作为粪便 污染指标评价食品的卫生 状况，推断 食品中肠道致 病菌污染的可能。
2
大肠菌群的食品卫生学意义
标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表只有40个 组合。 3 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单 位是100g/ml。
10
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
新国标的MPN表的基准问题。
1、新国标的MPN表采用了3个稀释度，分别是十 倍－百倍－千倍，加样量是3管，每管1毫升，意 味着加入样品的量为0.333克。
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语， 它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的 一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸
杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌是人和温血动物肠道 内普遍存在的细菌，是粪便中 的主要菌种产。气一克般雷生白活氏在菌人大 肠中并不致病，但它侵入人体 一些部位时，可引起感染 。
4
第一法 大肠菌群MPN计数法
• 初发酵：月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）替代 了乳糖胆盐发酵培基
• 确证实验：煌绿乳糖胆盐肉汤 （BGLB）替代了乳糖复发酵培 养基，取消了革兰氏染色实验
• 培养时间：由24h延长至48h • 单位：由MPN/100g变为
MPN/g
5
第一法 大肠菌群MPN计数法
12
关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
改变加样量的问题。 这样查表得到的数值，应该降低10倍。
微生物大肠菌群检测ppt
平板分离：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝 （紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯 （玫瑰红色）琼脂平板上，35-37度培养24小时。
证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳 糖发酵管中， 35-37度培养24小时，产酸产气，即证实 有大肠菌群存在。
水源水 严重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL 中度污染水：10，1，0.1,0.01mL 轻度污染水：100，10，1，0.1mL 大肠菌群变异不大的水源水：10mL10份 接种量1mL及1mL以内用单料乳糖胆盐 发酵管，接种量在1mL以上者，应保证接 种后发酵管中的总液体为单料培养液。
3.注意事项
乳糖发酵试验—分离培养—证实试验三步中，初发酵与证 实试验可能相差较大。
抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。 猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大， 胆盐剂量以0.5%较适宜。
挑选菌落时，EMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、 粉色较低；无典型菌落时，宜多挑选。
第二节 测定方法
1、测定程序
检样 稀释 乳糖胆盐发酵管
胆盐、或去氧胆酸钠
不产气 阴性 报告
革兰氏染色
产气 EMB、远腾氏等
乳糖发酵管
革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢
阴性 报告
阳性 报告
产气
不产气 阴性 报告
2.多管发酵法测定方法
发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋 白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无 菌操作加水样100mL.在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发 酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样10mL,摇 匀后，37度培养24小时。
其它粪便污染指示菌 分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌 克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌
证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳 糖发酵管中， 35-37度培养24小时，产酸产气，即证实 有大肠菌群存在。
水源水 严重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL 中度污染水：10，1，0.1,0.01mL 轻度污染水：100，10，1，0.1mL 大肠菌群变异不大的水源水：10mL10份 接种量1mL及1mL以内用单料乳糖胆盐 发酵管，接种量在1mL以上者，应保证接 种后发酵管中的总液体为单料培养液。
3.注意事项
乳糖发酵试验—分离培养—证实试验三步中，初发酵与证 实试验可能相差较大。
抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。 猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大， 胆盐剂量以0.5%较适宜。
挑选菌落时，EMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、 粉色较低；无典型菌落时，宜多挑选。
第二节 测定方法
1、测定程序
检样 稀释 乳糖胆盐发酵管
胆盐、或去氧胆酸钠
不产气 阴性 报告
革兰氏染色
产气 EMB、远腾氏等
乳糖发酵管
革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢
阴性 报告
阳性 报告
产气
不产气 阴性 报告
2.多管发酵法测定方法
发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋 白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无 菌操作加水样100mL.在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发 酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样10mL,摇 匀后，37度培养24小时。
其它粪便污染指示菌 分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌 克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌
实验九水中总大肠菌群的测定ppt课件
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
◆包扎
1．培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2．吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉 花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会 下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与 报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。 3．三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端， 与报纸约呈45º角，并将右端多余的报纸打一小结。 4. 玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160－170℃灭菌2 h.
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
◆灭菌
1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。
2.接通电源，进行加热。
3. 排
除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭
平板划线分离操作法示意图
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
5 复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另
一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒置管），每 管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中 培养24h，有产酸、产气者，即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群 存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠 菌群数。
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菌移液管（1ml）、无菌锥形瓶、无菌试管 、小倒管、精密pH试纸 • 培养基和试剂：LST肉汤、BGLB肉汤、无 菌生理盐水、1mol/L NaOH 、1mol/L HCl
实验步骤：前期准备
• 每个小组准备器材：移液管1mlX6、 10mlX2、锥形瓶500mlX2、试管X14
• 准备试剂： • 配制：LST肉汤（1000ml）和BGLB肉汤
加好后塞好试管塞，放进培养箱培养24-48h
实验步骤：复发酵
• 将LTS发酵管取出，观察倒管是否有气泡 ，将初发酵产气的管数种类进行记录
注意：在发酵试验工作中，经常可以看到在发酵 倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有 时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮 的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者 可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比 小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖 发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有 气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而 应作进一步试验。
实验步骤：复发酵与结果
• 准备BGLB肉汤发酵管（分装、灭菌等） • 用接种环接一环产气的LTS发酵管至BGLB发酵
管中，并记号 • 放进培养箱培养48h • 取出观察倒管是否产气，如果两种发酵管均产
气则证实为大肠菌群阳性，并根据管数查MPN 检测表（P142-143），得出MPN值
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
生理盐水（500ml）
相关配方
相关配方
•生理盐水：8.5g+1000ml蒸馏水（一锥形瓶瓶装 225ml，剩下的装在另外一个锥形瓶中）
实验步骤：前期准备
• 将相关玻璃仪器进行灭菌前包装 • 将配制好的LST肉汤加入试管中（注意1
），然后小心将小倒管放入肉汤中（注 意2）（每组10支） • 将所有东西包扎好放入灭菌锅中灭菌 20min
耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 ℃ 培养48h 产酸产气，并在44.5℃培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）
卫生学意义
• 大肠菌群和大肠杆菌作为食品卫生标准的意义在于，是 评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
• 另外，肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属等，对食 品安全性威胁很大。经常检验致病菌有一定困难。而食 品中的大肠菌群较容易检出，肠道致病菌与大肠菌群的 来源相同，而且在一般条件下大肠菌群在外环境中生存 时间也与主要肠道致病菌一致．所以大肠菌群的另一重 要食品卫生意义是作为肠道致病菌污染食品的指示菌．
• 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了 对人体健康危害性的大小。
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约 0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或 成双，但不呈长链排列。约50%的菌株 有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般 不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株 有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成 芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰 氏染色阴性。
实验步骤：检样稀释
• 称取25g样品→加入225ml生理盐水中→ 摇床匀质→制成1:10样品匀液
• 取一支无菌试管+9ml生理盐水 →+1ml1:10样品→制成1:100稀释液
• 如2方法制成1:1000稀释液（注意3） • 分别标注好标号
实验步骤：初发酵
用1ml无菌移液管分别吸取3个稀释度的稀释样品至 LST肉汤发酵试管中（每一稀释度3管）
大肠菌群数的定义
• 食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内 大肠菌群最近似数（MPN）表示。
P142
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问
10
大肠菌群MPN计数法 操作步骤
初发酵
24 ± 2h ~48 ± 2h
复发酵GB/T 4789.3210大肠菌群实验材料• 检测样品：奶粉 • 设备和材料：恒温培养箱、天平、摇床、无
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
• 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养
基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37℃分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可 维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白 胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）” 来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了 大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。
奶粉的大肠菌群检验方法
大肠菌群的定义
• 大肠菌群：一群在37℃，经24h能发 酵乳糖，并产酸产气，需氧或兼性厌氧生 长的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。
• 其中包括有大肠杆菌（也称大肠埃希氏 菌）、肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯氏 菌属中的一部分和沙门氏菌属的第Ⅲ亚属。
P139
大肠杆菌的定义
• 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、 IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为 ++--或-+--的细菌。
大肠杆菌的生物学特性
培养特性：
• 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培 养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能 生长，生长温度范围15-46 ℃。
在普通营养琼脂上有3种菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。
• 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归 属于埃希氏菌属。
• 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五 种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠 杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
大肠菌群和大肠杆菌的关系
• MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)
的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释， 加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管 数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近 似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如 改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或 增加10倍。
实验步骤：前期准备
• 每个小组准备器材：移液管1mlX6、 10mlX2、锥形瓶500mlX2、试管X14
• 准备试剂： • 配制：LST肉汤（1000ml）和BGLB肉汤
加好后塞好试管塞，放进培养箱培养24-48h
实验步骤：复发酵
• 将LTS发酵管取出，观察倒管是否有气泡 ，将初发酵产气的管数种类进行记录
注意：在发酵试验工作中，经常可以看到在发酵 倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有 时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮 的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者 可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比 小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖 发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有 气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而 应作进一步试验。
实验步骤：复发酵与结果
• 准备BGLB肉汤发酵管（分装、灭菌等） • 用接种环接一环产气的LTS发酵管至BGLB发酵
管中，并记号 • 放进培养箱培养48h • 取出观察倒管是否产气，如果两种发酵管均产
气则证实为大肠菌群阳性，并根据管数查MPN 检测表（P142-143），得出MPN值
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
生理盐水（500ml）
相关配方
相关配方
•生理盐水：8.5g+1000ml蒸馏水（一锥形瓶瓶装 225ml，剩下的装在另外一个锥形瓶中）
实验步骤：前期准备
• 将相关玻璃仪器进行灭菌前包装 • 将配制好的LST肉汤加入试管中（注意1
），然后小心将小倒管放入肉汤中（注 意2）（每组10支） • 将所有东西包扎好放入灭菌锅中灭菌 20min
耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 ℃ 培养48h 产酸产气，并在44.5℃培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）
卫生学意义
• 大肠菌群和大肠杆菌作为食品卫生标准的意义在于，是 评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
• 另外，肠道致病菌如沙门氏菌属和志贺氏菌属等，对食 品安全性威胁很大。经常检验致病菌有一定困难。而食 品中的大肠菌群较容易检出，肠道致病菌与大肠菌群的 来源相同，而且在一般条件下大肠菌群在外环境中生存 时间也与主要肠道致病菌一致．所以大肠菌群的另一重 要食品卫生意义是作为肠道致病菌污染食品的指示菌．
• 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了 对人体健康危害性的大小。
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约 0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或 成双，但不呈长链排列。约50%的菌株 有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般 不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株 有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成 芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰 氏染色阴性。
实验步骤：检样稀释
• 称取25g样品→加入225ml生理盐水中→ 摇床匀质→制成1:10样品匀液
• 取一支无菌试管+9ml生理盐水 →+1ml1:10样品→制成1:100稀释液
• 如2方法制成1:1000稀释液（注意3） • 分别标注好标号
实验步骤：初发酵
用1ml无菌移液管分别吸取3个稀释度的稀释样品至 LST肉汤发酵试管中（每一稀释度3管）
大肠菌群数的定义
• 食品中大肠菌群数是以每100mL（g）检样内 大肠菌群最近似数（MPN）表示。
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大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问
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大肠菌群MPN计数法 操作步骤
初发酵
24 ± 2h ~48 ± 2h
复发酵GB/T 4789.3210大肠菌群实验材料• 检测样品：奶粉 • 设备和材料：恒温培养箱、天平、摇床、无
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
• 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养
基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37℃分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可 维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白 胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）” 来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了 大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。
奶粉的大肠菌群检验方法
大肠菌群的定义
• 大肠菌群：一群在37℃，经24h能发 酵乳糖，并产酸产气，需氧或兼性厌氧生 长的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。
• 其中包括有大肠杆菌（也称大肠埃希氏 菌）、肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯氏 菌属中的一部分和沙门氏菌属的第Ⅲ亚属。
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大肠杆菌的定义
• 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、 IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为 ++--或-+--的细菌。
大肠杆菌的生物学特性
培养特性：
• 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培 养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能 生长，生长温度范围15-46 ℃。
在普通营养琼脂上有3种菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。
• 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归 属于埃希氏菌属。
• 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五 种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠 杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
大肠菌群和大肠杆菌的关系
• MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)
的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释， 加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管 数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近 似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如 改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或 增加10倍。